1株間座殼屬真菌抗松材線蟲的活性

于金英,汪 冶,呂耀平,于 威

(1.浙江理工大學 生命科學與醫藥學院,杭州 310018; 2.麗水學院 生態學院,浙江麗水 323000)

松材線蟲(Bursaphelenchusxylophilus)是一種寄生在松樹上并導致松材線蟲病發生的病原性植物線蟲,對松樹具有高度的破壞性,借助媒介昆蟲松墨天?？梢詮氖芮秩镜臉淠狙杆賯鞑?引起病害流行[1-2]。通過注干施用(半)合成農藥被認為是最有效的直接控制松材線蟲的策略之一,并在亞洲國家得到了廣泛應用[3]。然而,大多數殺線劑可能對非目標生物體有害,引起嚴重的環境和人類健康等問題已被停用。因此,很多研究者以期從植物或微生物代謝產物中發現對環境友好且具有更高效殺蟲性能的天然化合物來代替合成殺蟲劑,在防治松材線蟲的同時,保護環境并節約成本。

在松材線蟲病的生物防治研究方面,大量研究表明,微生物可以產生對松材線蟲具有毒殺作用的酶和次級代謝物,如擔子菌毛頭鬼傘(Coprinuscomatus)產生的含氧雜環化合物[4],鏈霉菌(Streptomycessp.)產生的殺魚菌素[5],以及應用最為成功的微生物殺蟲劑蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis)產生的殺蟲晶體蛋白等[6],但是由于眾多生物因素以及非生物因素的干擾,相關的研究多停留在高效菌株的篩選和室內研究,生物菌劑的應用并沒有獲得很好的實踐效果[7]。

植物內生真菌是一種寄生在植物活體組織中而不引起任何有害癥狀的微生物。內生真菌與寄主互惠共生,寄主提供內生菌所需要的生境和營養,真菌分泌植物生長和生存所需的功能性代謝產物,這些代謝物在結構與功能上與寄主植物的次生代謝產物相似[8]?？嚅?Meliaazedarach)為楝科落葉喬木植物,其次生代謝產物如苦楝素具有廣泛的殺蟲活性[9-10]。迄今,有關苦楝內生真菌殺線蟲活性的研究鮮有報道,因此,本研究選取苦楝作為研究對象,篩選具有殺線活性的內生真菌,為進一步開發生防菌劑防治松材線蟲病提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試植物 供試植物苦楝于2021 年10 月采自浙江省麗水市,隨機選取苦楝莖、葉、果實的健康組織。

1.1.2 供試松材線蟲 松材線蟲分離于麗水市蓮都區大港頭森林防疫站提供的馬尾松(Pinusmassoniana)疫木,經浙江省農科院鑒定為松材線蟲,置于長有灰葡萄孢(Botrytiscinerea)的培養皿中,28 ℃避光飼養。

1.1.3 供試培養基 馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養基:去皮馬鈴薯200 g切塊加適量蒸餾水,加熱至馬鈴薯熟爛,經紗布過濾,濾液加入20 g葡萄糖、20 g瓊脂粉,加蒸餾水定容至1 000 mL,置于高壓滅菌鍋內121 ℃滅菌20 min。

馬鈴薯葡萄糖液體(PDB)培養基:去皮馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g,操作步驟與PDA培養基制作一致。

1.1.4 主要儀器 體視顯微鏡(Leica EZ4W,德國徠卡,德國),離心機(凱達TG16G,湖南凱達科學儀器有限公司,中國),紫外-可見分光光度計(日本島津 UV-1780,島津公司,日本),旋轉薄膜蒸發儀(BUCHI-R210, 瑞士步琦有限公司,瑞士),恒溫振蕩培養箱(KS 4000i control,IKA,德國),超凈工作臺(博迅SW-CJ-1CU,上海博迅醫療生物儀器股份有限公司,中國),超聲波清洗器(SG250H,上海冠特超聲儀器有限公司,中國),旋渦混合器(GL-88B,海門市其林貝爾儀器制造有限公司,中國),生化培養箱(SHP-150,上海森信實驗儀器有限公司,中國),電子天平[SQP,賽多利斯科學儀器(北京)有限公司,中國]。

1.1.5 其他材料 酶試劑盒(南京建成生物工程研究所),DNA抽提試劑盒(擎科生物科技有限公司),PCR通用引物(擎科生物科技有限公司設計合成),1.5%瓊脂糖凝膠電泳(1.5 g瓊脂糖,100 mL 1×TAE緩沖液);乙酸乙酯、二甲基亞砜等試劑(國藥集團化學試劑有限公司)。

1.2 試驗方法

1.2.1 苦楝內生真菌的分離與純化 將采集的苦楝組織樣品用無菌水清洗干凈,依次經75%(V/V)的酒精溶液浸洗4～5 min,2%(V/V)的次氯酸鈉浸洗4～5 min,75%酒精浸洗0.5 min,無菌水漂洗2～3次,用滅菌濾紙吸干多余水分后,用滅菌解剖刀將苦楝的莖、葉、果實切成小段/小片,放置于PDA固體培養基上,每皿3塊組織,于 28 ℃恒溫倒置培養,將各組織的最后一次無菌水沖洗液涂布于PDA培養基上平行培養,以檢測苦楝組織消毒是否徹底[11-13]。待組織塊長出菌絲后,用滅菌接種針挑取菌絲尖端轉接于PDA固體培養基上,在PDA固體培養基上純化后,PDA斜面培養基4 ℃保存。

1.2.2 搖瓶發酵 將4 ℃保藏的菌種接種于PDA固體培養基中活化,生化培養箱28 ℃靜置培養7 d活化。將活化好的菌株切塊接入裝有150 mL PDB液體培養基的錐形瓶中,接種后, 28 ℃、180 r·min-1振蕩培養3 d[14]。

1.2.3 活性菌株初篩 將發酵液于6 000 r·min-1離心10 min去除菌絲,使用微孔過濾器(0.22 μm)過濾得到濾液,待生長于灰葡萄孢培養基上的大多數線蟲處于妊娠期(J4/成蟲)時,將線蟲同齡(生長期)化,使所有線蟲處于同一生長水平,使用貝爾曼漏斗法,線蟲靜置12 h后收集至離心管中,于4 000 r·min-1離心5 min,用0.9%生理鹽水沖洗3次,配置成100條·mL-1的線蟲懸浮液,在24孔板中,每孔加入0.5 mL的線蟲懸浮液,再加入等量發酵液,以背景溶液作為空白對照,設置3個平行試驗,分別于處理后12、24、36和48 h在體視顯微鏡下觀察線蟲的存活狀況。蟲體運動且為螺旋形判定為活蟲;蟲體不運動且身體僵直判定為死蟲。按以下公式計算死亡率和校正死亡率[15]。

死亡率=死蟲數/供試蟲數×100%

校正死亡率=(處理組死亡率-對照組死亡率)/(1-對照組死亡率)×100%

1.2.4 胞內、胞外代謝產物制備 活性菌株搖瓶發酵3 d后,對發酵液進行離心,將菌絲與真菌發酵液分離,濾液中加入等體積的乙酸乙酯,萃取3次后合并萃取液,減壓回收溶劑得到胞外代謝產物,稱量后用2%(V/V) 二甲亞砜(DMSO)溶解配置成20 mg·mL-1溶液,置于4 ℃保存,備用。菌絲加入100 mL乙酸乙酯,超聲萃取30 min后靜置,減壓回收溶劑得到胞內代謝產物,稱量后用2% DMSO溶解配置成20 mg·mL-1溶液,置于 4 ℃保存,備用[16-17]。將得到的胞內、胞外代謝產物用2% DMSO連續稀釋制備2、1、0.6和0.4 mg·mL-1的系列測試溶液。

1.2.5 室內毒力測定 參照“1.2.3”的方法,以2% DMSO作為空白對照,每個濃度設置3個平行試驗,分別于12、24、36和48 h在體視顯微鏡下觀察線蟲的存活情況,根據公式計算死亡率和校正死亡率。

1.2.6 對松材線蟲卵孵化的影響 用貝爾曼漏斗收集處于妊娠期的松材線蟲,用無菌水清洗3次后置于空白培養皿中培養12 h,待線蟲產卵并黏底后,用無菌水收集松材線蟲卵,配制為卵懸浮液(約200個·mL-1)。將約0.5 mL卵懸浮液和0.5 mL測試溶液混合在24孔板中,混合溶液的終質量濃度為2、1、0.6和0.4 mg·mL-1。在25 ℃黑暗環境下孵育24和48 h后,在體視顯微鏡下統計孵化的卵數[18]。

線蟲孵化率=孵化線蟲數/處理線蟲卵數×100%

線蟲孵化抑制率=(對照線蟲孵化率-處理線蟲孵化率)/對照線蟲孵化率×100%

1.2.7 對松材線蟲酶活力的影響 取4 mL松材線蟲(約10萬條),分別加入1 mL配置好的菌株J352-03胞內、胞外代謝產物,溶液的終質量濃度為0.5 mg·mL-1,充分混勻,以背景溶液作為對照,每處理設3次重復。將各管置于28 ℃培養箱中避光培養,分別于12、24、36和48 h 充分搖勻后取出1 mL,4 000 r·min-1離心5 min,去上清,以蒸餾水清洗3次。加入適量生理鹽水冰浴勻漿,2 500 r·min-1離心10 min后取上清,用生理鹽水定容至1 mL。使用考馬斯亮藍G250染色法測定線蟲勻漿液的蛋白含量,并根據酶試劑盒說明測定酶的活性[19]。

1.2.8 活性內生真菌的鑒定 形態學鑒定:滅菌接種針挑取菌絲接種于PDA固體培養基上,于28 ℃真菌培養箱中培養3～5 d,觀察菌落的形態特征。挑取純化后的菌絲通過插片法制作真菌顯微玻片,觀察菌絲和分生孢子形態等特征,根據菌株的形態特征,查閱相關文獻,比對觀察結果,初步確定菌株的分類地位。

分子生物學鑒定:采用硅基質吸附柱法從真菌中抽提DNA。采用通用引物[20]ITS1 (5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)擴增ITS區序列,PCR 擴增條件:95 °C預變性5 min,擴增40個循環(95 °C變性15 s,50 °C 退火20 s,72 °C延伸40 s)。采用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物。

PCR產物送至上海元莘生物醫藥科技有限公司測序。利用NCBI-BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)對所測內生真菌ITS區序列進行同源性比對,得到真菌序列同源性最相似種屬,借助軟件MEGA11(Mega Limited;新西蘭)采用鄰接法(Neighbor-joining)構建系統進化樹,確定各分離菌株的種類。

1.2.9 數據分析 利用Excel 2010進行數據、圖表處理。采用Graphpad Prism 8.0(GraphPad Software;美國)軟件計算半數致死濃度(LC50)以及方差分析(Analysis of Variance,簡稱ANOVA),并使用Tukey檢驗(P=0.05)比較數據之間的差異顯著性。

2 結果與分析

2.1 殺松材線蟲活性菌株的篩選

2.1.1 活性菌株初篩 按照“1.2.3”的方法對31株苦楝內生真菌發酵濾液的殺線活性進行測定,發現菌株J352-03對松材線蟲的毒性較強。由表1可知,該菌株發酵液處理48 h時線蟲的校正死亡率可達到100%。

表1 菌株J352-03對松材線蟲的殺線活性

2.1.2 J352-03胞內和胞外代謝產物對松材線蟲的殺蟲活性 按照“1.2.4”方法制備菌株J352-03胞內和胞外代謝產物,將松材線蟲置于不同梯度質量濃度(2、1、0.6和0.4 mg·mL-1)的J352-03胞內和胞外代謝產物中,分別在浸漬處理12、24、36和48 h后觀察松材線蟲的存活狀況并計算校正死亡率(圖1),圖1表明菌株J352-03對松材線蟲的毒殺活性呈現出隨著樣品濃度的提高而增加的趨勢,在2 mg·mL-1質量濃度下浸漬處理松材線蟲48 h后,菌株J352-03胞內、胞外的次生代謝產物對松材線蟲的校正死亡率可高達100%。

同組不同小字母表示 0.05 水平上差異顯著

2.1.3 半致死濃度LC50運用Graphpad Prism 8.0對松材線蟲暴露于菌株J352-03次生代謝產物的校正死亡率數據進行擬合得到LC50值以及毒力回歸方程(表2),結果顯示菌株J352-03的次生代謝產物對不同處理時間的松材線蟲均表現出顯著的殺蟲活性,在48 h時松材線蟲死亡率達到最高值,胞內、胞外代謝產物的LC50值分別為 0.46、0.42 mg·mL-1。

表2 菌株J352-03胞內和胞外代謝產物毒殺松材線蟲作用的LC50值

2.2 對松材線蟲卵孵化的影響

菌株J352-03的胞內代謝產物處理24 h時,在2、1、0.6、0.4 mg·mL-1質量濃度下的孵化率分別為20.02%、24.84%、42.81%、57.69%,顯著低于對照組(79.16%;P<0.05);在處理48 h時累積孵化率分別為28.75%、35.42%、 51.67%、62.33%,顯著低于對照組(85.42%;P<0.05)。菌株J352-03胞外代謝產物處理 24 h時,2、1、0.6、0.4 mg·mL-1質量濃度下的孵化率分別為10.51%、20.11%、34.76%、 47.58%,顯著低于對照組(79.16%;P<0.05);在處理48 h時累積孵化率分別為20.42%、 29.17%、44.17%、55.42%,顯著低于對照組 (85.42%;P<0.05)。隨濃度的增加,其對線蟲的孵化抑制活性逐漸增強,在2 mg·mL-1質量濃度下浸漬24 h時,胞內、外代謝產物對線蟲的孵化抑制率為74.74%, 86.74%,浸漬48 h時抑制率為66.54%、76.05%(圖2)。

圖2 菌株J352-03代謝產物處理24 h和48 h后松材線蟲的累積孵化率(A)和孵化抑制率(B)

2.3 對松材線蟲酶活力的影響

2.3.1 對松材線蟲乙酰膽堿酯酶活力的影響 松材線蟲乙酰膽堿酯(AChE)對J352-03胞內、外代謝產物非常敏感,對照組與給藥組AChE活力在不同時間段的變化趨勢相對一致,給藥處理組AChE活力始終低于對照組(圖3;P<0.05), 24～48 h,胞內、胞外代謝產物處理后的兩組松材線蟲AChE活力接近,無顯著性差異(P>0.05)。

圖3 菌株J352-03代謝產物處理下松材線蟲體內乙酰膽堿酯酶酶活力的變化

2.3.2 對松材線蟲三磷酸腺苷酶活力的影響 由圖4可知,給藥處理組的三磷酸腺苷酶(ATP酶)活力在不同時間點均低于對照組的ATP酶活力,并且存在顯著性差異(P<0.05),胞內、胞外代謝產物處理48 h時,兩組松材線蟲ATP酶活力相近,分別為1.92、1.5 U·mgprot-1,無顯著性差異(P>0.05)。表明菌株J352-03的胞內、外代謝產物可以有效地抑制松材線蟲ATP 酶的活性。

圖4 菌株J352-03代謝產物處理下松材線蟲體內三磷酸腺苷酶活力的變化

2.3.3 對松材線蟲超氧化物歧化酶活力的影響 圖5顯示,在處理12 h時,對照組松材線蟲的超氧化物歧化酶(SOD)活力為160.43 U·mgprot-1,此時浸漬于胞內、胞外代謝產物中的松材線蟲的SOD活力為109.5、81.11 U·mgprot-1,顯著低于對照組(P<0.05)。12～36 h,給藥處理組與對照組變化趨勢相對一致。在36 h后,給藥處理組松材線蟲的SOD活力依舊呈下降趨勢,但此時對照組SOD活力小幅度提升。整個變化過程中給藥處理組SOD活力顯著低于對照組 (P<0.05),表明菌株J352-03的胞內、外代謝產物可以抑制松材線蟲的SOD活力。

圖5 菌株J352-03代謝產物處理下松材線蟲體內超氧化物歧化酶活力的變化

2.3.2 對松材線蟲過氧化氫酶活力的影響 圖6顯示,在松材線蟲暴露24 h前,給藥處理組松材線蟲的過氧化氫酶(CAT)活力顯著高于對照組(P<0.05),在24 h時,3 組松材線蟲的CAT活力無顯著性差異(P>0.05),但是隨著中毒時間的延長,給藥處理組CAT活力逐漸被抑制,對照組CAT活力顯著高于給藥處理組(P<0.05)。

圖6 菌株J352-03代謝產物處理下松材線蟲體內過氧化氫酶酶活力的變化

2.4 有殺線蟲活性菌株的鑒定

2.4.1 表型特征 如圖7所示,菌株J352-03在PDA培養基上的菌落外觀呈白色,邊緣規則,菌落干燥不透明,28 ℃避光培養時生長迅速,培養3 d菌落直徑可達5 cm,培養后期會出現黑色的分生孢子器。油鏡下觀察,菌絲發達呈細長分枝狀,分生孢子呈橢圓形,與文獻[21]一致,初步鑒定J352-03為間座殼屬真菌。

圖7 菌株J352-03的菌落及其菌絲形態(100x)

2.4.2 ITS區序列分析以及系統發育樹構建 將提取到經瓊脂糖凝膠電泳檢測質量良好的DNA,通過PCR擴增得到ITS序列,PCR產物經凝膠電泳檢測(圖8)。將測序得到的ITS區序列通過NCBI-BLAST進行同源性比對,取同源性最相近的10個種屬的序列借助軟件MEGA11構建系統進化樹,構建的系統進化樹(圖9)表明,菌株J352-03與Diaporthesp.(登錄號:KU375703.1)聚類在同一分支,兩者序列相似性為99.46%。根據同源性比較結合菌株的形態學觀察,將菌株J352-03鑒定為間座殼屬中的一個未知種Diaporthesp.。

圖8 菌株J352-03 rDNA-ITS序列PCR鑒定

圖9 基于ITS序列建立的菌株J352-03及其近似種的系統發育樹

3 討論與結論

Diaporthesp.屬于間座殼屬真菌,該屬真菌通常從植物中分離得到,廣泛存在于自然界,近年來國內外研究者對其次生代謝產物進行了研究,發現其次生代謝產物具有結構多樣性以及豐富的生物活性,主要包括生物堿類、萜類、吡喃酮類、蒽醌類、酸衍生物、醇類和酰胺類等。Diaporthesp.中的生物活性化合物丁香酚可以用來抑制細菌以及抗氧化劑[22-23];Li等[24]分離到一種羊毛甾醇衍生物對革蘭氏陽性菌和陰性菌,特別是對臨床分離的化膿性鏈球菌(Streptococcuspyogenes)和銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa),以及對人致病的金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)均有明顯的抗菌作用。此外,還具有細胞毒性、抗菌、抗高膽固醇、抗結核、抗糖尿病、抗氧化和抗炎特性[25]。因此,Diaporthesp.在農藥醫藥方面有潛在的應用價值,但是,目前對于Diaporthesp.的殺蟲活性鮮有報道,Zhang等[25]從Diaporthesp.中分離到兩種高度取代的二苯甲酮抑制劑,可顯著抑制寄生蟲環磷酸鳥苷(cyclic guanosine monophosphate,簡稱cGMP)依賴性蛋白激酶活性,這說明Diaporthesp.可潛在成為殺線生防菌。

線蟲在受到外源性傷害時,其體內與代謝相關的酶活性會發生改變[26-27],乙酰膽堿酯酶(AChE)是一種參與神經傳遞的重要蛋白質,是有機磷酸鹽和氨基甲酸鹽類殺蟲劑的重要靶標,位于突觸后膜上的AChE將神經遞質乙酰膽堿水解為膽堿和醋酸酯來終止信號,在線蟲體內起著終止神經沖動的重要作用。給藥處理組可以顯著抑制AChE酶活力,推測給藥后的松材線蟲通過抑制AChE導致乙酰膽堿不能被水解,在突觸間隙積累,最終引起蟲體肌肉劇烈收縮,產生痙攣性麻痹,導致線蟲死亡。三磷酸腺苷酶(ATP酶)是一種與物質運送、能量轉換以及信息傳遞相關的蛋白酶,與機體代謝密切相關,也是菊酯類殺蟲劑的主要作用靶標之一。由于ATP酶是能量轉換的關鍵酶,推測當ATP酶活性被抑制時,線蟲生命活動所需要的能量不能被滿足,最終導致線蟲死亡;超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)等抗氧化酶有助于抵消活性氧(ROS)在細胞和分子水平上引起氧化損傷的毒性。SOD是松材線蟲體內的一種富含金屬離子的抗氧化酶,當SOD含量充足時,自由基被俘獲,細胞處于健康狀態,但是當SOD含量缺失或不足時,細胞受自由基侵害,發生變異、衰老或死亡。當松材線蟲的SOD活性受到抑制時,將會影響線蟲體內清除氧自由基的效率,從而造成線蟲體內毒素堆積,使細胞膜產生過氧化,導致細胞膜破壞和損傷,最終導致線蟲死亡,線蟲細胞正常的生理代謝遭到干擾,從而破壞線蟲的抗氧化保護酶系;CAT是一種四亞基血紅素酶,是松材線蟲體內的解毒相關酶,松材線蟲體內的過氧化氫對細胞高度有害,其積累將導致DNA、蛋白質和脂質的氧化,從而導致細胞凋亡,CAT通過將過氧化氫分解為水和分子氧來阻止細胞產生活性氧(ROS),使細胞免受過氧化氫的傷害。給藥處理組線蟲前期CAT酶活力明顯高于對照組以滿足松材線蟲中毒后的解毒需求,但是隨著中毒時間的延長,給藥組CAT酶活力逐漸被抑制,松材線蟲在菌體代謝產物的作用下體內的過氧化氫得不到分解,在線蟲體內積累,從而使松材線蟲體內產生毒性很大的氫氧自由基,細胞功能受到極大的影響并逐漸凋亡,最終導致線蟲死亡。Diaporthesp.的代謝產物對4 種酶活性均有抑制作用,表明其毒性作用機制可能是綜合作用產生。

本研究從苦楝中分離得到1株具有高效殺線蟲活性的菌株Diaporthesp.,研究表明,Diaporthesp.代謝產物對松材線蟲具有較強的致死作用,對松材線蟲卵的孵化以及體內代謝活動相關酶(AchE、SOD、ATP、CAT)活性均有不同程度的抑制作用。對Diaporthesp.殺線蟲的主要成分及其機制有待深入研究。