菌劑對雞糞-生物炭堆肥理化性質和微生物群落結構的影響

王瑞飛, 孔盈利, 魏藝璇, 白 雙, 展莉平, 張 昊, 李明軍, 楊清香

(1.河南師范大學生命科學學院,河南 新鄉 453007; 2.河南省農業微生物生態與技術國際聯合實驗室,河南 新鄉 453007)

禽畜糞便中含有大量營養成分,是一種潛在的生物質能源。中國每年的禽畜糞便產生量超過3.0×109t,但是其綜合利用率不足60%[1]。禽畜糞便的不合理處置不僅造成大量養分流失,而且極易造成農業面源污染,給生態環境造成巨大壓力[2]。因此,禽畜糞便的資源化利用不僅能降低禽畜糞便的污染風險,而且能夠實現禽畜糞便的再利用,對推動禽畜養殖業的可持續發展具有十分重要的意義。

目前,高溫堆肥已經成為中國實現禽畜糞便資源化的最有效方式之一[3],具有無害化處理徹底、附加值高、經濟效益好等優點,但也存在腐熟周期長、營養流失多等問題。為了提高高溫堆肥的效果,研究者主要圍繞2個方面展開研究。一方面是高溫堆肥過程中的條件(如物料成分、通風量、含水率等)的優化[4-5],另一方面是開發推進禽畜糞便腐熟進程的微生物菌劑、硝酸鉀等外源添加劑[6]。研究發現,微生物是高溫堆肥順利進行的核心決定因素,其他條件和因素往往通過影響堆肥中的微生物來調控有機質轉化和物料的腐殖化[7-8]。由于接種微生物菌劑可以直接調節堆肥物料中的微生物種類和數量,提高微生物活性,加速有機質的分解,因此,研究微生物菌劑對堆肥過程中微生物群落變化的影響及其作用機制已經成為目前堆肥研究中的熱點[9-11]。

雞糞是中國重要的有機肥源之一,生物炭是固體廢棄物在缺氧條件下熱解產生的具有發達空隙結構、比表面積大的穩定富碳物質。已有研究結果表明,生物炭與雞糞混合后使堆肥物料的堆體密度更小、透氣性更好,有利于微生物的繁殖和活性發揮[12]。近年來,伴隨著高通量測序技術在各種環境微生物群落分析中的應用[13],部分研究者已經應用高通量測序技術對生物炭禽畜糞便堆肥中的微生物群落結構、多樣性和豐度進行了分析。例如,Jiang等[14]通過內轉錄間隔區(Internal transcribed spacer,ITS)測序發現,牛糞生物炭堆肥中主要真菌屬的豐富度隨著堆制進程的推進而變化,在堆制初期的真菌主要是曲霉屬真菌(Aspergillus)和未分類真菌(Unclassied fungi),在堆制末期的真菌主要是Myriococcum、未分類的小囊菌(UnclassifiedMicroascaceae)和枝頂孢屬真菌(Acremonium),且與不加生物炭的牛糞堆肥中的微生物群落變化有明顯區別;Duan等[15]通過16S rDNA、ITS測序發現,羊糞蘋果樹生物炭混合能夠增加堆制過程中細菌的多樣性,減少真菌群落的多樣性,與微生物相關的酶活性也隨之改變,從而加快了腐熟進程;Zhai等[16]通過高通量測序發現,在雞糞生物炭混合堆肥堆制過程中,N2O釋放相關微生物從22個下降到19個,從而削弱了反硝化進程,提升了堆肥質量。盡管目前相關研究已取得了一定進展,但是鮮有研究利用高通量測序技術全面評價菌劑對雞糞-生物炭堆肥堆制過程中細菌、真菌群落演替的影響。

本研究首先分析微生物菌劑對雞糞-生物炭堆肥理化性質的影響。隨后,通過細菌16S rDNA、真菌ITS高通量測序技術和信息學分析,探討菌劑對堆肥堆制中細菌、真菌群落演替的影響。最后,利用種子萌發試驗初步評估菌劑腐熟雞糞-生物炭堆肥對植物生長的潛在促進作用,以期為深入闡明菌劑促進禽畜糞便堆制過程中腐熟的微生物學機制提供理論借鑒,為堆肥腐熟菌劑的開發奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

上海青種子,購自河南省新鄉市種子市場。2019年6月,在河南省焦作市武陟縣某生物有機肥廠進行雞糞-生物炭堆肥堆制試驗。雞糞含水率50%,總有機碳含量28.62%,全氮含量1.70%,碳氮質量比約17∶1;生物炭含水率10%,總有機碳含量30.11%,全氮含量1.11%,碳氮比約27∶1。

菌劑菌種的制備。芽孢桿菌(Bacillussp.)BA、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)K1、巨大芽孢桿菌(Bacillusmagaterium)J2和木霉(Trichodermasp.)M1,均為筆者所在課題組自行篩選并保藏。用無機鹽培養基(4 g磷酸氫二銨,2 g硫酸鉀,1 g氯化鈉,20 g葡萄糖,10 ml 100倍濃縮的微量元素,0.6 g七水合硫酸鎂,1 000 ml蒸餾水,pH值7.0)進行細菌發酵培養(37 ℃,24 h),調整活菌數達1×108CFU/ml;用麩皮培養基(含有40%水分的麩皮)對木霉M1進行培養(28 ℃,7 d),用無菌水沖洗收集孢子,調節孢子含量至1×108CFU/ml。堆肥堆制前將細菌和孢子等量混合。

1.2 試驗設計和樣品的采集

將雞糞和生物炭混合均勻,調節含水率約為50%,碳氮比約為21∶1,采集初始混合樣品(CS),然后將混合物料分為對照組、處理組(各5 t混合物料),處理組接種細菌和真菌混合菌劑(1×106CFU/kg);對照接入與處理組等量的無菌水。堆體表面覆土,每周翻堆1次。堆肥堆制持續64 d,在堆肥堆制的第4 d、14 d、30 d、53 d,于同一堆體5個不同點距堆體表面20 cm處分別取樣,均勻混合作為1個樣品,并分成2份,分別用于堆肥理化性質測定、DNA提取(高通量測序)。根據采樣時間,分別將對照組樣品命名為C4(4 d)、C14(14 d)、C30(30 d)、C53(53 d),分別將處理組樣品命名為T4(4 d)、T14(14 d)、T30(30 d)、T53(53 d)。

1.3 堆肥理化性質測定

每天8:30-9:30用溫度計分別測定堆體中心面3個位置距表面20 cm處的溫度,取其平均值作為堆體溫度,同時記錄環境溫度;用105 ℃烘干法測定堆體含水率,將堆肥樣品與蒸餾水按照1∶10(質量體積比)混勻后測定pH值[17];采用總有機碳(Total organic carbon,TOC)儀測定總有機碳含量[18];用連續流動分析儀(AA3型)測定全氮含量[19];銨態氮、有效磷、速效鉀含量的測定方法參考NY525-2012《有機肥料》[20]。

1.4 高通量測序

用FastDNA?Spin Kit for Soil試劑盒提取樣品DNA,用NanoDrop2000 Spectrophotomete(美國賽默飛世爾科技公司)檢測DNA純度和濃度,用上海美吉公司的Illumina MiSeq平臺進行細菌16S rRNA基因V3、V4區(338F:5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′;806R:5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)和真菌ITS區(ITS1F:5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′;ITS2R:5′-GCTGCGTTCTTCATCGA-3′)的擴增測序[21]。

1.5 種子萌發試驗

種子萌發試驗參考已有的方法[22],并做適當修改,具體操作如下:將5 g腐熟后的雞糞-生物炭堆肥與去離子水按1∶10(質量體積比)混合后浸提30 min,獲得浸提液,將上海青種子先用1%次氯酸鈉溶液浸泡15 min,再用蒸餾水清洗3遍。取5 ml浸提液,加入鋪有濾紙的直徑90 mm的培養皿中,每皿放置30粒種子(共2皿),25 ℃培養48 h。記錄種子發芽情況和根長,以去離子水代替浸提液的處理作為對照。

1.6 數據分析與處理

用Graphpad prism 8.0、Origin 2018和Excel 2007進行數據統計分析,借助上海美吉公司云平臺(https://cloud.majorbio.com/)進行高通量數據分析。分別用FLASH 1.2.11、QIIME 1.9.1和UCHIME 8.1進行高通量測序數據原始讀數合并、質量控制和數據優化,用Uparse 7.0.1090、Bayesian算法獲得操作分類單元(OTU,相似度97%),用Silva細菌16S rRNA數據庫、真菌ITS數據庫進行細菌、真菌分類,用Mothur 1.30.2計算Shannon指數。

2 結果與分析

2.1 菌劑對雞糞-生物炭堆肥堆制過程中理化特性的影響

2.1.1 菌劑對堆肥堆制過程中物料顏色、狀態及氣味的影響 顏色和狀態是堆肥物料腐殖化的重要表觀特征[23]。隨著堆肥堆制過程中水分、多糖類物質含量的變化,物料通常由塊狀、易粘結、有惡臭味逐漸變得均勻松散且有土腥味。圖1顯示,鮮雞糞與生物炭混合后,堆體呈現粘結狀,內部呈黑色,臭味明顯。隨著堆制過程的推進,對照(未接種菌劑)和處理組(接種菌劑)堆體的顏色均漸變為褐色。但是,處理組堆體的顏色變化早于對照。在堆肥堆制的第4 d時,處理組的塊狀堆體物料團塊已明顯變小,刺激性糞臭味基本消除,蚊蠅聚集減少;在堆肥堆制第14 d時,堆體物料已呈現團粒狀松散狀態;在堆肥堆制第53 d,堆體帶有明顯土腥味。但是,對照在堆肥堆制第30 d才呈現團粒狀松軟狀態,直至堆肥堆制第53 d仍有刺激性臭味。上述表觀特征的變化表明,接種菌劑明顯加快了堆肥堆體的腐熟進程。

A:堆肥堆制的現場場景;B:不同時間堆肥物料的形態、顏色變化。圖1 菌劑對堆肥堆體顏色及形態的影響Fig.1 Effects of microbial agents on compost color and morphology

2.1.2 菌劑對堆肥堆制過程中溫度、含水率和pH值的影響 溫度、pH值和含水率與微生物新陳代謝密切相關,經常作為判斷堆肥是否腐熟的重要指標[24]。溫度監測結果顯示,對照、處理組均能在堆肥堆制的0～4 d內快速升溫,其中處理組堆體的溫度在堆肥堆制第4～15 d維持在70 ℃以上,最高溫度達到76 ℃,之后溫度開始下降,在堆肥堆制第64 d,堆體溫度降至40 ℃左右。對照的溫度雖然在堆肥堆制的第4 d升至60 ℃以上,但是在堆肥堆制第4～64 d,其溫度長期維持在60 ℃以上,并且其最高溫度(72 ℃)明顯低于處理組(圖2A)。含水率監測結果顯示,物料的初始含水率約為50%,在堆肥堆制第53 d,對照、處理組的含水率分別為15.39%、17.06%,但是處理組含水率在堆肥堆制第4～30 d的下降速度明顯快于對照(圖2B)。pH值監測結果顯示,2組堆肥堆體的pH值始終保持在7.5～8.3,在堆肥堆制第53 d,對照、處理組的pH值分別為8.20、7.97,均符合中國農業有機肥的標準,但是2組堆肥pH值的變化趨勢有所不同(圖2C)。以上結果表明,接種微生物菌劑明顯促進了雞糞-生物炭堆肥堆體的溫度、水分和pH值的變化,有利于堆肥堆體的腐熟。

A:溫度;B:含水率;C:pH值。圖2 菌劑對堆肥堆體溫度、含水率及pH值的影響Fig.2 Effects of microbial agents on composting temperature, moisture content and pH

2.1.3 菌劑對堆肥堆制過程中總有機質、全氮、銨態氮、有效磷和速效鉀含量的影響 堆肥的腐熟本質上是微生物對物料中的有機質進行降解轉化的過程[8]。有機質含量測定結果表明,物料中總有機質的平均初始含量為383.70 g/kg,隨著堆肥堆制過程的推進,處理組和對照有機質含量整體均呈下降趨勢,在堆肥堆制第53 d,對照和處理組的總有機質含量分別比堆肥初期降低了18.9%(72.60 g/kg)和38.8%(148.90 g/kg)(圖3A)。全氮含量測定結果表明,平均初始全氮含量為21.50 g/kg,隨著堆肥堆制過程的推進,處理組與對照的全氮含量均呈上升趨勢,在堆肥堆制第53 d,對照和處理組全氮含量分別增加了36.05%(7.75 g/kg)和64.05%(13.77 g/kg)(圖3B)。銨態氮含量測定結果表明,銨態氮的平均初始含量為186.20 mg/kg,在堆肥堆制過程中,處理組的銨態氮含量始終低于對照,在堆肥堆制第53 d,對照和處理組的銨態氮含量分別比堆肥初期降低了30.5%(56.70 mg/kg)和50.8%(94.53 mg/kg)(圖3C)。以上結果表明,菌劑能極大促進有機質分解,增加堆肥堆體的全氮含量,減少堆肥堆體中的銨態氮含量,從而產生明顯的保氮效果。

A:總有機質含量;B:全氮含量;C:銨態氮含量。圖3 菌劑對堆肥堆體中總有機質、全氮及銨態氮含量的影響Fig.3 Effects of microbial agents on the contents of total organic matter, total nitrogen and ammonium nitrogen in compost

有效磷含量測定結果表明,物料中的有效磷初始含量為71.00 mg/kg,在堆肥堆制過程中,處理組的有效磷含量始終高于對照(圖4A)。在堆肥堆制第53 d,對照和處理組的有效磷含量分別比堆肥初期增加了16.5%(11.75 mg/kg)和38.6%(27.45 mg/kg)。速效鉀含量測定結果表明,物料中的速效鉀初始含量為224.10 mg/kg,其在堆肥堆制過程中的變化趨勢與有效磷含量相似,在堆肥堆制第53 d,對照和處理組的速效鉀含量分別比堆肥初期增加35.1%(78.74 mg/kg)和57.6%(129.14 mg/kg)(圖4B)。由此可見,菌劑能夠促使物料中的磷元素、鉀元素向更易被植物吸收的可利用態轉變。

A:有效磷含量;B:速效鉀含量。圖4 菌劑對堆肥堆體中有效磷、速效鉀含量的影響Fig.4 Effects of microbial agents on the content of available phosphorus and available potassium in compost

2.2 菌劑對堆肥堆制過程中細菌、真菌群落多樣性的影響

高通量測序結果顯示,不同樣品產生的細菌高質量序列數為45 189～56 038條,這些序列聚類為377～632個分類操作單元(Operational taxonomic unit,OTU);真菌高質量序列數為55 390～73 234條,這些序列聚類為128～637個OTU。處理組細菌OTU數量和Shannon指數在各個時期均明顯高于對照,而真菌的相應數值總體上表現出相反趨勢(表1)。上述結果表明,菌劑促進了堆肥堆制過程中微生物群落結構的變化。

表1 高溫堆肥堆體樣品中細菌、真菌的豐度與多樣性

2.2.1 菌劑對堆肥堆制過程中細菌群落組成的影響 如圖5所示,在門水平上,對照中厚壁菌門(Firmicutes)細菌的相對豐度維持在80.0%以上,為絕對優勢菌門,放線菌門(Actinobacteria)細菌的相對豐度在堆肥堆制后期(第53 d)明顯提高,達到16.00%。處理組中,厚壁菌門(Firmicutes)在堆肥堆制前30 d仍為絕對優勢菌門,相對豐度>78.00%,但是放線菌門(Actinobacteria)細菌的相對豐度在堆肥堆制后期(第53 d)提高到66.40%,取代厚壁菌門(Firmicutes)細菌成為最豐富的細菌門細菌,變形菌門(Proteobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)和綠彎菌門(Chloroflexi)細菌的相對豐度也明顯提高,分別達到為4.80%、10.00%和6.00%。

CS代表雞糞和生物炭的起始混合樣品,C表示對照,T表示處理組,14、30、53分別代表堆肥堆制時間為14 d、30 d、53 d。Firmicutes:厚壁菌門;Actinobacteria:放線菌門;Proteobacteria:變形菌門;Bacteroidetes:擬桿菌門;Chloroflexi:綠彎菌門;Others:其他。圖5 門水平上細菌群落組成Fig.5 Composition of bacterial community at phylum level

如圖6所示,在堆肥堆制第14 d,在屬水平上,對照細菌相對豐度大于1%的優勢屬主要為櫻桃樣芽孢桿菌(Cerasibacillus)、未分類芽孢桿菌(Unclassified-f-Bacillaceae)、假纖細芽孢桿菌(Pseudogracilibacillus)、芽孢桿菌(Bacillus)和肉桿菌(Atopostipes)等。隨著堆肥堆制過程的進行,上述屬細菌的相對豐度不斷發生變化,如肉桿菌(Atopostipes)的相對豐度明顯降低,櫻桃樣芽孢桿菌、未分類芽孢桿菌的相對豐度先升后降,在堆肥堆制第53 d接近0;布哈加瓦氏菌(Bhargavaea)、假纖細芽孢桿菌的相對豐度先降后升,在堆肥堆制第53 d,相對豐度分別高達33.23%、10.75%。在堆肥堆制第14 d,處理組相對豐度大于1.00%的優勢菌屬(10個)與對照(8個)有高度的相似性(7個一致),但是相對豐度存在顯著差異,如櫻桃樣芽孢桿菌、假纖細芽孢桿菌在處理組的相對豐度分別為3.20%、22.17%,但在對照中的相對豐度分別為22.12%、11.40%。隨著堆肥堆制過程的推進,處理組與對照中相對豐度大于1.00%的共有屬的組成成員逐漸減少,在堆肥堆制第53 d,處理組只有5個相對豐度大于1.00%的屬與對照相同,并且這些屬的相對豐度均低于4.00%。進一步分析發現,處理組中糖霉菌(Glycomyces)、阮繼生氏菌(Ruania)、布哈加瓦氏菌(Bhargavaea)的相對豐度較高,分別為8.00%、13.39%、16.46%,而對照中這3個細菌的相對豐度則接近0;布哈加瓦氏菌(Bhargavaea)、假纖細芽孢桿菌、薄壁芽孢桿菌(Gracilibacillus)、海洋芽孢桿菌(Oceanobacillus)表現出相反的趨勢。由此可見,在屬水平上,處理組和對照的細菌群落結構在堆肥堆制進程中的變化有明顯差異。

A:第14 d相對豐度差異顯著的細菌屬;B:第30 d相對豐度差異顯著的細菌屬;C:第53 d相對豐度差異顯著的細菌屬。CS代表雞糞和生物炭的起始混合樣品,C表示對照,T表示處理組,14、30、53分別代表堆肥堆制時間為14 d、30 d、53 d。Pseudogracilibacillus:假纖細芽孢桿菌;Cerasibacillus:櫻桃樣芽孢桿菌;Unclassified-f-Bacillaceae:未分類芽孢桿菌; Bacillus:芽孢桿菌;Bhargavaea:布哈加瓦氏菌;Atopostipes:肉桿菌;Oceanobacillus:海洋芽孢桿菌;Thermobifida:高溫雙歧菌屬;Amphibacillus:雙芽孢桿菌屬;Saccharomonospora:糖單胞菌屬;Tepidimicrobium:熱微菌屬;Planifilum:直絲菌屬;Streptomyces:鏈霉菌屬;Corynebacterium_1:棒狀桿菌_1;Glycomyces:糖霉菌;Ruania:阮繼生氏菌;Gracilibacillus:薄壁芽孢桿菌屬;Unlassified-f-Micrococcaceae:未分類的微球菌科成員;Virgibacillus:枝芽孢桿菌屬;Salinicoccus:鹽水球菌屬;Brachybacterium:短狀桿菌屬;Georgenia:喬治菌屬;Brevibacterium:短桿菌屬;Norank-f-Bacillaceae:未明確屬的芽孢桿菌科成員。 圖6 屬水平上細菌相對豐度有顯著差異的群落Fig.6 Communities with significant differences in relative abundance of bacteria at the genus level

2.2.2 菌劑對堆肥堆制過程中真菌群落組成的影響 如圖7所示,在門水平上,子囊菌門(Ascomycota)、被孢霉門(Mortierellomycota)、未分類真菌門(Unclassified-Fungi)和擔子菌門(Basidiomycota)為所有樣品中的優勢菌門,尤其是Ascomycota占有絕對優勢地位,其在各樣品中的相對豐度為57.73%～98.76%。此外,對照樣品中Ascomycota的相對豐度在堆肥堆制第30 d、53 d分別為59.24%、74.14%,明顯低于其在處理組第30 d的相對豐度(69.94%)和第53 d的相對豐度(98.76%)。

如圖8所示,在屬水平上,在堆制第14 d的堆肥樣品中,對照、處理組中相對豐度>1.00%的屬均包含被孢霉(Mortierlla)、木霉(Trichoderma)、念珠菌(Diutina)、籃狀菌(Talaromyces) 和鐮刀霉(Fusarium)等,但被孢霉(Mortierlla)、木霉(Trichoderma)在處理組中的相對豐度均高于對照,而籃狀菌屬(Talaromyces)、德巴利氏酵母(Debaryomyces)則相反。隨著堆肥堆制進程的推進,被孢霉(Mortierlla)、念珠菌(Diutina)、籃狀菌(Talaromyces)和鐮刀霉(Fusarium)的相對豐度在對照中均出現顯著下降,在堆肥堆制第53 d均低于5.00%;毛孢子菌(Cutaneotrichosporon)的相對豐度則顯著上升,在堆肥堆制第53 d達到6.90%;德巴利氏酵母(Debaryomyces)的相對豐度先下降后上升,在堆肥堆制第53 d達到13.45%。在處理組中,盡管上述菌的相對豐度隨著堆肥堆制進程的推進也表現出浮動,但是枝頂孢霉(Acremonium)在處理組中的相對豐度變化最為明顯,呈現連續升高的趨勢,在堆肥堆制第53 d高達94.9%,成為處理組真菌群落中的絕對主導,其他菌的相對豐度均低于1.00%,而對照中枝頂孢霉(Acremonium)的相對豐度則一直處于較低水平。因此可見,真菌群落成員的相對豐度在處理組和對照中表現出明顯差異。

A:堆肥堆制第14 d相對豐度差異顯著的真菌屬;B:堆肥堆制第30 d相對豐度差異顯著的真菌屬;C.堆肥堆制第53 d相對豐度差異顯著的真菌屬。CS代表雞糞和生物炭的起始混合樣品,C表示對照,T表示處理組,14、30、53分別代表堆肥堆制的第14 d、30 d、53 d。 Mortierella:被孢霉;Diutina:念珠菌;Debaryomyces:德巴利氏酵母;Talaromyces:籃狀菌; Trichoderma:木霉;Fusarium:鐮刀霉;Aspergillus:曲霉;Cutaneotrichosporon:毛孢子菌;Wallemia:節擔菌屬;Guehomyces:耐冷酵母屬;Plectosphaerella:小不整球殼屬;Metarhizium:綠僵菌屬;Penicillium:青霉屬;Acremonium:枝頂孢霉;Dichotomopilus:二分枝毛殼屬;Dipodascus:雙足囊菌屬;Saitozyma:沙蜥屬;Acaulium:無莖真菌屬;Acrostalagmus:筍頂孢屬;Melanocarpus:黑果球粉衣屬。圖8 屬水平的真菌相對豐度存在顯著差異的物種Fig.8 Species with significant differences in relative abundance of fungi at genus level

2.3 菌劑處理的堆肥促進上海青種子萌發和根生長的效果

在菌劑處理的堆肥浸提液培養下,上海青種子的萌發結果如圖9所示,可以看出,處理組種子培養48 h的萌發率(91.60%)高于對照(83.30%),其平均根長(1.59 cm)是對照(1.25 cm)的1.27倍。因此可見,菌劑處理的堆肥有效刺激了種子萌發和根生長,對植物生長有潛在促進作用。

A:不同時間點的根長;B:培養第48 h的發芽率;C:培養第48 h的根長。圖9 菌劑處理的堆肥對上海青種子萌發率和根長的影響Fig.9 Effects of the compost treated with microbial agents on seed germination rate and root length of Brassica rapa var. chinensis (Linnaeus) Kitamura

3 討 論

高溫堆制是實現禽畜糞便資源化、無害化的重要手段,但是傳統的高溫堆制往往存在周期長、營養流失多等問題[2]。接種微生物菌劑能夠直接影響堆體中的微生物組成,從而有效促進堆肥腐熟,克服傳統高溫堆制的缺點。因此,開發高效腐熟菌劑,深入探討其微生物學機制就顯得尤為重要。

相關研究結果表明,堆肥是否腐熟不能用單一指標進行評價[24]。因此,本研究首先綜合評價菌劑對雞糞-生物炭堆肥堆制過程中多個腐熟指標的影響。結果顯示,菌劑顯著促進雞糞-生物炭堆肥堆制過程中溫度、含水率、pH值的變化和臭味的去除,并縮短腐熟時間,而且菌劑處理的堆肥最終全氮、有效磷和速效鉀含量均高于對照。本研究結果也得到了其他研究結果的間接支持。例如,Xu等[25]研究發現,由部分高溫和中溫微生物組成的菌劑可使牛糞-秸稈堆肥中的氨氣釋放量減少29.98%～46.94%;Li等[26]研究發現,由枯草芽孢桿菌等菌種組成的菌劑延長了豬糞-玉米芯堆肥的高溫時間,使堆肥中的硝態氮含量比對照高21 g/kg。盡管本研究中所用菌劑能高效促進雞糞-生物炭堆肥堆體腐熟,但是在中國,豬、牛、禽、羊的糞污產生量分別占畜禽糞污總產量的33.9%、48.3%、4.7%、13.1%[27]。因此,本研究中所用菌劑能否在其他禽畜糞便堆肥中廣泛應用值得進一步探討。

微生物群落是影響堆肥腐熟的核心因素[28-31],本研究結果表明,外加菌劑能高效促進堆肥堆制過程中微生物群落的變化。與對照相比,菌劑處理堆肥中的一些門如放線菌門(Actinobacteria)、子囊菌門(Ascomycota)的相對豐度顯著升高,可能由于菌劑處理的堆肥提前進入腐熟期,為這些微生物生長提供了良好的環境條件[32]。屬水平的分析結果表明,菌劑可能從2個方面促進雞糞-生物炭堆肥中微生物群落的演替。一方面,接種菌劑提高了與有機質降解、同化相關微生物[如假纖細芽孢桿菌(Pseudogracilibacillus)、直絲菌(Planifilum)[33-34])]的相對豐度,同時降低了與碳氮損失相關微生物[如櫻桃樣芽孢桿菌(Cerasibacillus)、肉桿菌(Atopostipes)[35-36]]的相對豐度。上述結果與菌劑促進雞糞-生物炭堆肥中總有機質含量減少和全氮含量增加的結果相呼應。另一方面,菌劑促進了生防真菌的生長。例如,枝頂孢霉(Acremonium)中的成員如Acremoniumsp. Ld-03能夠抑制病原真菌鐮刀霉(Fusarium)的生長,可能通過產生多種肽類和環肽類抗生素實現[37-38]。在本研究中,枝頂孢霉(Acremonium)在處理組堆肥堆制進程中相對豐度持續升高,最終高達94.9%。此外,菌劑處理能夠明顯降低一些潛在病原菌如毛孢子菌(Cutaneotrichosporon)[39]、鐮刀霉(Fusarium)的相對豐度。此外,在堆肥堆制第14 d、30 d,處理組堆肥中布哈加瓦氏菌(Bhargavaea)、假纖細芽孢桿菌(Pseudogracilibacillus)、薄壁芽孢桿菌(Gracilibacillus)的相對豐度均顯著高于對照,然而在堆肥堆制第53 d,上述細菌在對照中的相對豐度卻顯著高于處理組。由此可見,布哈加瓦氏菌(Bhargavaea)、假纖細芽孢桿菌(Pseudogracilibacillus)、薄壁芽孢桿菌(Gracilibacillus)這3個菌在常規的雞糞-生物炭堆肥堆制過程中也會隨著堆肥堆制進程的推進而使相對豐度發生改變,但是接種菌劑則會加速這一過程。

綜上,接種微生物菌劑可能通過影響堆肥堆制過程中物質轉化相關微生物的相對豐度、抑制病原微生物生長、加速高溫堆肥堆制過程中微生物的演替等促進堆肥理化性質的變化,從而提高堆肥的腐熟速度和質量。本研究結果為闡明微生物菌劑在高溫堆肥堆制過程中的微生物學機制及其應用提供了參考,在下一步研究中,將對菌劑接入量、菌劑中各菌種比例對堆肥堆制進程的影響及菌劑使用范圍進行探究,以期開發出更為高效的堆肥腐熟菌劑。

4 結 論

微生物菌劑能夠高效促進雞糞-生物炭堆肥過程中溫度、水分、pH值的變化和臭味的去除,增加堆肥中的總氮、有效磷鉀含量,減少堆肥中銨態氮含量,因此微生物菌劑能有效加快雞糞-生物炭堆肥的腐熟進程,提高堆肥質量。微生物菌劑能夠高效促進雞糞-生物炭堆肥堆制過程中微生物群落的演替。在門水平上,菌劑能夠促使堆肥堆體中絕對優勢真菌子囊菌門(Ascomycota)真菌的相對豐度明顯提高,而絕對優勢細菌由厚壁菌門(Firmicutes)細菌變為放線菌門(Actinobacteria)細菌;在屬水平上,菌劑能夠刺激堆肥堆體中具有強有機質降解能力的假纖細芽孢桿菌(Pseudogracilibacillus)、布哈加瓦氏菌(Bhargavaea)等和具有生防潛力的鏈霉菌(Streptomyces)、枝頂孢霉(Acremonium)等相對豐度提高,降低一些致病性真菌屬[如毛孢子菌(Cutaneotrichosporon)和鐮刀霉(Fusarium)]真菌的相對豐度。處理組堆肥有效刺激了上海青種子萌發和根生長,種子培養48 h后的萌發率、根長分別達到91.60%、1.59 cm,均高于對照。