交聯(lián)劑結(jié)構(gòu)對(duì)可生物降解殼聚糖水凝膠性能影響的研究

王帥,黃燦鋒,朱東雨,姜濤,陳至鵬

(1.廣東工業(yè)大學(xué) 輕工化工學(xué)院,廣東 廣州 510006;2.化學(xué)與精細(xì)化工廣東省實(shí)驗(yàn)室揭陽(yáng)分中心,廣東 揭陽(yáng) 515200;3.廣東順德創(chuàng)新設(shè)計(jì)研究院,廣東 佛山 528311)

羧甲基殼聚糖(CMCS)作為殼聚糖的衍生物具有豐富的氨基和羧基,其水凝膠被廣泛應(yīng)用在生物材料中,例如載藥凝膠[1]、傷口敷料[2]、組織工程等[3]。但目前的CMCS水凝膠交聯(lián)劑中往往存在離子脫落[4]、反應(yīng)效率低[5]和細(xì)胞毒性等[6]問(wèn)題,限制了其應(yīng)用。醛基多糖不僅能賦予水凝膠雙醛官能團(tuán),還具有良好的生物安全性,吸引了人們的廣泛關(guān)注[7-9]。但是多糖來(lái)源廣泛,不同醛基多糖交聯(lián)的CMCS水凝膠性能相差較大,為了更有針對(duì)性地選擇多糖進(jìn)行醛基化改性,本文在相同反應(yīng)條件下制備了8種不同結(jié)構(gòu)的醛基多糖,然后分別制備了CMCS/醛基多糖水凝膠,并對(duì)其生物、物理化學(xué)性能進(jìn)行評(píng)估。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

羧甲基殼聚糖(CMCS,取代度≥90%);海藻酸鈉[SA,粘度(200±20) mPa·s,純度99.9%];環(huán)糊精(CD,純度98%);羥乙基淀粉(HES,取代度≥50%,純度98%);羥乙基纖維素(HEC,粘度1 500～2 500 mPa·s);羧甲基纖維素(CMC,純度99%);普魯蘭多糖(Pul,粘度15～180 mPa·s);葡聚糖(Dex,Mw=4×104);硫酸軟骨素(CS,純度90%);高碘酸鈉(NaIO4)、乙二醇、無(wú)水氯化鈣(CaCl2,純度99.9%)、鹽酸羥胺、氫氧化鈉(NaOH)、二甲基亞砜(DMSO)均為分析純;MTT(純度97%);MEM培養(yǎng)基;L929小鼠成纖維細(xì)胞;去離子水(H2O)。

美國(guó)THEMOR-FILSHER iS50R全波段研究級(jí)紅外光譜儀;捷克泰思肯TESCAN MIRA4型掃描電鏡;奧地利安東帕MCR301旋轉(zhuǎn)流變儀。

1.2 醛基多糖交聯(lián)劑的制備

以CD為例,取2.138 9 g NaIO4溶于30 mL純水中,攪拌溶解,按摩爾比1∶1往NaIO4溶液里加入一定質(zhì)量CD,避光攪拌反應(yīng)8 h,加入200 μL乙二醇繼續(xù)避光攪拌2 h以終止反應(yīng),并置于透析袋中透析3 d,最后凍干得到白色固體產(chǎn)物醛基環(huán)糊精(OCD)。SA、HES、HEC、CMC、Pul、Dex、CS 7種多糖均采用以上方式在同一條件下氧化制備得到對(duì)應(yīng)的醛基多糖氧化物OSA、OHES、OHEC、OCMC、OPul、ODex、OCS。

1.3 殼聚糖水凝膠的制備

以CMCS/OCD水凝膠為例,取4 mL 6%(m/v)的CMCS溶液于玻璃瓶中,加入700 μL 5%(m/v)的OCD溶液,快速攪拌均勻后置于45 ℃烘箱中交聯(lián)反應(yīng)4 h,得到CMCS/OCD水凝膠。CMCS/OSA、CMCS/OHES、CMCS/OHEC、CMCS/OCMC、CMCS/OPul、CMCS/ODex、CMCS/OCS七種水凝膠均采用以上方式制備。

1.4 紅外光譜分析

采用全波段研究級(jí)紅外光譜儀來(lái)分析醛基多糖交聯(lián)劑和多糖水凝膠的結(jié)構(gòu),分辨率1 cm-1。對(duì)于不同結(jié)構(gòu)的醛基多糖,將凍干后的樣品研磨成粉,采用溴化鉀壓片法進(jìn)行測(cè)試;對(duì)于水凝膠,將樣品凍干后,直接采用ATR法測(cè)試。

1.5 醛基取代度的測(cè)試

采用鹽酸羥胺-NaOH滴定法測(cè)定醛基多糖的醛基取代度[10],具體方案如下:①配制0.25 mol/L的鹽酸羥胺-甲基橙溶液:取4.375 g鹽酸羥胺溶于40 mL純水中,加入1.5 mL甲基橙溶液(0.05%),將溶液稀釋定容在250 mL。②醛基濃度測(cè)定:取0.1 g樣品醛基多糖,溶解于25 mL鹽酸羥胺-甲基橙溶液中,靜置2 h后,用0.1 mol/L的標(biāo)準(zhǔn)NaOH溶液滴定,滴定終點(diǎn)為溶液顏色由紅色變?yōu)辄S色,并記錄加入的NaOH的體積和對(duì)應(yīng)的pH。以VNaOH為橫坐標(biāo),pH為縱坐標(biāo)繪制曲線并對(duì)曲線進(jìn)行一階微分,微分曲線的峰值對(duì)應(yīng)的橫坐標(biāo)即為滴定終點(diǎn)所消耗的VNaOH。③取代度計(jì)算:醛基取代度計(jì)算依據(jù)公式(1)。

(1)

式中,DSCHO為醛基取代度,mol/mol;VNaOH為消耗的NaOH的體積,mL;c標(biāo)為標(biāo)準(zhǔn)NaOH的濃度,mol/L;M多糖為多糖的摩爾質(zhì)量,g/mol;m樣為樣品質(zhì)量,g。

1.6 掃描電鏡

將CMCS/醛基多糖水凝膠凍干后噴金,并固定在樣品臺(tái)上,使用掃描電鏡觀察多糖水凝膠的形貌結(jié)構(gòu)。

1.7 溶脹性能測(cè)試

將CMCS/醛基多糖水凝膠凍干后稱重,并記錄質(zhì)量為m1,再浸泡在生理鹽水中,每隔30 min取出用濾紙擦干表面水分后稱重,直至水凝膠質(zhì)量恒定后,記錄此時(shí)質(zhì)量為m2,通過(guò)公式(2)計(jì)算水凝膠的平衡溶脹率SR。

(2)

式中,m2為平衡溶脹后水凝膠的質(zhì)量,g;m1為干態(tài)水凝膠的質(zhì)量,g。

1.8 力學(xué)性能測(cè)試

使用旋轉(zhuǎn)流變儀探究CMCS/醛基多糖水凝膠的力學(xué)性能:將水凝膠樣品裁剪為直徑25 mm,厚度3 mm的小圓片,設(shè)定恒定應(yīng)變?chǔ)?1%,溫度T=37 ℃ 進(jìn)行頻率掃描,頻率范圍ω=1～100 rad/s,并以對(duì)數(shù)取點(diǎn)測(cè)得水凝膠樣品的模量-頻率關(guān)系曲線。

1.9 細(xì)胞毒性測(cè)試

采用MTT法測(cè)試CMCS/醛基多糖水凝膠的細(xì)胞相容性,具體步驟如下:

①浸提液制備:首先將水凝膠浸泡除去游離組分,凍干滅菌后備用。取無(wú)菌處理后的干膠放置于MEM培養(yǎng)基(含10%胎牛血清,1%青霉素-鏈霉素溶液)中,溶脹平衡后,置于培養(yǎng)基(2 mg/mL)中37 ℃ 浸提24 h。

②細(xì)胞接種和毒性檢測(cè):用胰酶消化對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的L929小鼠成纖維細(xì)胞,調(diào)節(jié)細(xì)胞密度為3×104/mL。將細(xì)胞懸液接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,每孔加200 μL細(xì)胞懸液,并在37 ℃、含5%CO2培養(yǎng)箱中培育24 h后,吸棄培養(yǎng)液,實(shí)驗(yàn)組加浸提液,對(duì)照組加正常的培養(yǎng)基,每組設(shè)立5個(gè)平行孔,將培養(yǎng)板置于37 ℃、含5%CO2培養(yǎng)箱中培育24 h,每孔加入MTT液20 μL(5 g/L),常規(guī)孵育4 h后吸棄培養(yǎng)液,加入DMSO 150 μL,在37 ℃保溫10 min,振蕩器搖勻40 s,使用酶標(biāo)儀測(cè)490 nm波長(zhǎng)處的吸光值A(chǔ)。

L929細(xì)胞的細(xì)胞活性RGH按如下公式(3)計(jì)算:

(3)

2 結(jié)果與討論

2.1 紅外光譜分析

以CD為例,所制備的醛基多糖及其水凝膠的紅外光譜見(jiàn)圖1。

圖1 CD,OCD,CMCS和CMCS/OCD水凝膠的紅外光譜Fig.1 FTIR spectra:CD,OCD,CMCS and CMCS/OCD hydrogel

由圖1可知,3 200～3 500 cm-1處出現(xiàn)強(qiáng)而寬的吸收峰是CD等多糖結(jié)構(gòu)上—OH的伸縮振動(dòng)吸收峰,其它7種多糖也在這個(gè)位置出現(xiàn)—OH的吸收峰。相比于CD,OCD在1 733 cm-1處出現(xiàn)了醛基的特征吸收峰,表明醛基化改性成功,其它醛基多糖在1 720～1 740 cm-1內(nèi)也都有明顯的峰,表明剩余7種多糖均發(fā)生了氧化反應(yīng)。當(dāng)OCD與CMCS復(fù)合交聯(lián)形成水凝膠(CMCS/OCD)后,1 733 cm-1的特征峰消失,說(shuō)明—CHO參與了席夫堿反應(yīng)被消耗掉;同時(shí),CMCS/OCD水凝膠的紅外譜圖在1 669 cm-1處出現(xiàn)了碳氮雙鍵的特征峰,表明生成了亞胺鍵,進(jìn)一步證明了CMCS的—NH2與OCD的—CHO發(fā)生了席夫堿交聯(lián)反應(yīng)。此外,CMCS/OCD水凝膠在3 200～3 500 cm-1處的紅外光譜特征峰向右移,證明CMCS和OCD可能發(fā)生了氫鍵相互作用。其余幾種醛基多糖及其多糖水凝膠的紅外譜圖均有類似的規(guī)律,表明其余7種多糖水凝膠也均被成功制備。

2.2 醛基取代度

以O(shè)CD為例,通過(guò)公式(1)計(jì)算各種醛基多糖的取代度,8種醛基多糖的醛基取代度匯總見(jiàn)圖2。

圖2 不同氧化多糖的醛基度Fig.2 Oxidation degree of various polyaldehyde polysaccharide

由于分子結(jié)構(gòu)和糖單元的不同,多糖被NaIO4氧化的程度不同,最終導(dǎo)致醛基度的不同。醛基和氨基反應(yīng)活性高,因此能偶聯(lián)多肽、蛋白等生物活性物質(zhì),其中OCD和OPul醛基取代度最高,表示其能偶聯(lián)的生物活性物質(zhì)越多,適當(dāng)?shù)娜┗扔欣隰燃谆鶜ぞ厶撬z在生物學(xué)方面的應(yīng)用。

2.3 不同多糖水凝膠的形貌分析

由圖3可知,在制備的CMCS/醛基多糖水凝膠中,除了CMCS/OCS水凝膠外,其他樣品均顯示出明顯的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),表面光滑且多孔,孔徑為微米級(jí),說(shuō)明交聯(lián)程度較高。CMCS/OHEC、CMCS/OCMC、CMCS/OCS和其他水凝膠相比孔徑比較大,最高可達(dá)400 μm,判斷因?yàn)槠鋵?duì)應(yīng)的多糖交聯(lián)劑醛基度低,導(dǎo)致水凝膠的交聯(lián)度低,孔徑較大,這樣有利于水凝膠溶脹,而其他醛基度較高的多糖水凝膠孔徑就小一些,最高僅為200 μm,這種小而緊密的孔洞有利于提高水凝膠的力學(xué)性能。

圖3 復(fù)合水凝膠的SEM圖像Fig.3 SEM images of composite hydrogels

2.4 不同多糖水凝膠的溶脹性能

圖4探索了醛基多糖結(jié)構(gòu)交聯(lián)CMCS水凝膠在純水里的溶脹性能。多糖凝膠的溶脹比隨著時(shí)間的推移先上升直至平緩最終達(dá)到溶脹平衡。經(jīng)過(guò)400 min 的浸泡溶脹后,多糖凝膠的質(zhì)量和體積都有所變化,其中,溶脹比較小的是CMCS/OCD水凝膠、CMCS/OPul水凝膠、CMCS/OHES水凝膠、CMCS/ODex水凝膠、CMCS/OSA水凝膠;具有較大溶脹比的是CMCS/OCS水凝膠、CMCS/OHEC水凝膠,這些多糖凝膠都表現(xiàn)出優(yōu)秀的吸水和保水能力,并且溶脹比隨醛基含量的增加而降低。主要是因?yàn)槿┗吭礁?與氨基發(fā)生交聯(lián)形成交聯(lián)點(diǎn)的可能性越大,交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)越密集。因此,在實(shí)際應(yīng)用中,可根據(jù)產(chǎn)品的溶脹需求,選擇不同的醛基多糖制備CMCS水凝膠。

圖4 不同水凝膠的溶脹率Fig.4 Swelling ratio of various composite hydrogels

2.5 多糖水凝膠的流變力學(xué)性能

通過(guò)流變學(xué)實(shí)驗(yàn)反映多糖凝膠的力學(xué)強(qiáng)度。圖5顯示了不同多糖凝膠的儲(chǔ)能模量(G′)和損耗模量(G″)隨應(yīng)變的變化規(guī)律。

圖5 各種復(fù)合水凝膠的機(jī)械性能Fig.5 Mechanical properties of various composite hydrogels

由圖5可知,在應(yīng)變范圍內(nèi),所有多糖凝膠的G′都大于G″,說(shuō)明CMCS與醛基多糖均發(fā)生交聯(lián)形成水凝膠,且具有力學(xué)穩(wěn)定性。從G′來(lái)看,CMCS/OCD水凝膠、CMCS/OSA水凝膠、CMCS/OHES水凝膠、CMCS/ODex水凝膠力學(xué)強(qiáng)度相對(duì)較高,這與這幾種水凝膠的醛基多糖組分有關(guān),醛基度高導(dǎo)致交聯(lián)密度增大,進(jìn)一步使凝膠網(wǎng)絡(luò)更牢固,其力學(xué)強(qiáng)度越好,具有更好的彈性。

2.6 多糖水凝膠的細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)

通過(guò)MTT法檢測(cè)CMCS/醛基多糖水凝膠的細(xì)胞相容性,結(jié)果見(jiàn)圖6。

圖6 不同復(fù)合水凝膠的細(xì)胞活性Fig.6 Cell viability of various composite hydrogels

由圖6可知,L929細(xì)胞活性均接近1,證明8種多糖水凝膠均具有良好的細(xì)胞相容性。部分多糖水凝膠對(duì)L929細(xì)胞活性大于1,說(shuō)明對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)有一定的促進(jìn)作用,歸因于凝膠主體是生物多糖,在浸提過(guò)程中部分凝膠降解,這部分降解產(chǎn)物可作為營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)。因此得出結(jié)論:CMCS/醛基多糖水凝膠顯示出體外細(xì)胞無(wú)毒性,并且在一定程度上可以支持細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖,有望應(yīng)用在生物醫(yī)用材料上。

3 結(jié)論

本文通過(guò)統(tǒng)一氧化反應(yīng)條件制備了8種醛基多糖,每種醛基多糖僅通過(guò)醛基與CMCS的氨基發(fā)生席夫堿反應(yīng),形成交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)水凝膠。本文還對(duì)多糖水凝膠的微觀形貌、溶脹比、流變力學(xué)性能和細(xì)胞毒性進(jìn)行對(duì)比。醛基滴定結(jié)果表明相同條件下多糖的被氧化程度不同,此外不同醛基多糖交聯(lián)得到的CMCS水凝膠均顯示無(wú)毒,有望應(yīng)用在生物醫(yī)用材料領(lǐng)域。更重要的是,不同醛基多糖交聯(lián)的CMCS水凝膠的孔徑、溶脹比和力學(xué)強(qiáng)度具有較大的差異,這也對(duì)醛基多糖/CMCS水凝膠在實(shí)際應(yīng)用上進(jìn)行了補(bǔ)充研究,可根據(jù)需求,針對(duì)不同性能選擇不同的醛基多糖作為殼聚糖水凝膠的交聯(lián)劑。