65%氨氟樂靈水分散粒劑的高效液相色譜-質(zhì)譜和氣相色譜-質(zhì)譜分析方法

林威,常海龍,黃晨宇,李保同,王龍,周雯雯

(江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 國土資源與環(huán)境學(xué)院,江西 南昌 330045)

氨氟樂靈屬于二硝基苯胺類選擇性芽前土壤封閉除草劑,作用方式為抑制紡錘體的形成,從而抑制細(xì)胞分裂和根系、芽的生長[1-3]。主要通過雜草的胚芽和胚軸吸收,對已出土雜草及以根莖繁殖的雜草無效果,持效期長,適用于棉花、大豆、冬小麥和果園等作物一年生禾本科和部分闊葉雜草的防治[4-8]。目前,有關(guān)氨氟樂靈原藥和制劑有效成分的檢測有氣相色譜法和液相色譜法[9-10],此類方法雖定量較準(zhǔn)確,但檢出限較高。本文在優(yōu)化前人分析方法的基礎(chǔ)上,采用HPLC-MS和GC-MS對65%氨氟樂靈水分散粒劑中有效成分檢測進(jìn)行了實驗,方法操作方便,檢出限低,結(jié)果可靠,可用于氨氟樂靈制劑中有效成分的分析。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

甲醇、丙酮、乙腈、甲酸、乙酸均為色譜純;65%氨氟樂靈水分散粒劑;氨氟樂靈(≥97%)標(biāo)準(zhǔn)品LGC DR公司。

Agilent6120單四級桿液質(zhì)聯(lián)用儀;Agilent1260高效液相色譜儀;安捷倫氣相色譜(7890B)-質(zhì)譜(5977B)聯(lián)用儀;EX224ZH電子天平;TST-USB-20超純水機(jī);0.22 μm有機(jī)濾膜。

1.2 儀器條件

1.2.1 HPLC-MS儀器條件

1.2.1.1 液相色譜條件 Zorbax Eclipse XDB-C18色譜柱(4.6 mm×150 mm,5 μm),甲醇∶0.2%乙酸水(體積比80∶20)為流動相,流速1 mL/min,柱溫箱35 ℃,進(jìn)樣量10 μL。

1.2.1.2 質(zhì)譜條件 采用ESI離子源負(fù)離子掃描SIM模式,SIM模式離子選擇349.1(m/z),碰撞誘導(dǎo)解離電壓100 V,干燥器溫度350 ℃,霧化器壓力0.31 MPa,干燥器(氮氣)流速12.0 L/min,駐留590 ms,相對駐留100%,增益1.00。

1.2.2 GC-MS儀器條件

1.2.2.1 氣相色譜條件 HP-5MS型毛細(xì)管柱(60 m×0.25 mm×0.25 μm);氦氣作載氣,載氣流速1.2 mL/min;進(jìn)樣口溫度250 ℃。升溫程序:初溫170 ℃保持1 min,以25 ℃/min速度升溫至230 ℃, 再以10 ℃/min速度升溫至260 ℃,并保持3 min。采用分流進(jìn)樣的方式,分流比為1∶1,進(jìn)樣量1 μL。

1.2.2.2 質(zhì)譜條件 定量離子為321,輔助定性離子為279,333,離子化能量70 eV,溶劑延時6 min,質(zhì)譜接口溫度270 ℃,離子源溫度230 ℃,四極桿溫150 ℃。

1.3 溶液的配制

1.3.1 標(biāo)樣溶液配制 準(zhǔn)確稱取兩份0.01 g氨氟樂靈標(biāo)準(zhǔn)品(精確至0.000 1 g),分別用甲醇和丙酮溶解,超聲20 min,冷卻至室溫。用100 mL容量瓶定容至刻度,配制成100 mg/L甲醇、丙酮標(biāo)樣儲備液。

1.3.2 試樣溶液配制 準(zhǔn)確稱取兩份0.015 38 g 65%氨氟樂靈水分散粒劑(精確至0.000 1 g),分別用甲醇和丙酮溶解,超聲20 min,冷卻至室溫,用100 mL容量瓶定容至刻度,配制成有效成分為100 mg/L 甲醇、丙酮試樣溶液。

1.4 實驗方法

1.4.1 HPLC-MS測定 將甲醇標(biāo)準(zhǔn)儲備液逐級稀釋至0.01,0.05,0.1,0.25,0.5,1 mg/L,用0.22 μm有機(jī)濾膜過濾,待HPLC-MS開機(jī)后儀器穩(wěn)定進(jìn)行測定。

1.4.2 GC-MS測定 將丙酮標(biāo)準(zhǔn)儲備液逐級稀釋至0.05,0.1,0.25,0.5,1,2 mg/L,用0.22 μm有機(jī)濾膜過濾,待GC-MS開機(jī)后儀器穩(wěn)定進(jìn)行測定。

試樣中氨氟樂靈的質(zhì)量分?jǐn)?shù)W1(%)按下式計算。

式中A1——氨氟樂靈試樣響應(yīng)值;

A2——標(biāo)樣響應(yīng)值;

M1——氨氟樂靈試樣量,mg;

M2——標(biāo)樣質(zhì)量,mg;

W2——氨氟樂靈標(biāo)樣的質(zhì)量分?jǐn)?shù),%。

2 結(jié)果與討論

2.1 溶劑的選擇

氨氟樂靈在不同溶劑中的溶解度分別為:丙酮極易溶,乙腈、甲醇和氯仿易溶,正己烷、異戊烷、超純水微溶。氨氟樂靈標(biāo)準(zhǔn)品用甲醇、乙腈和丙酮作溶劑配制成濃度均為1 mg/L的樣品,在GC-MS上進(jìn)行分析。結(jié)果表明,用甲醇作為溶劑時,響應(yīng)值較小,且基峰較高;丙酮作為溶劑時,響應(yīng)值高,且峰形好;乙腈作為溶劑時,樣品響應(yīng)值與丙酮接近,但長期使用乙腈,易造成色譜柱固定相流失,降低色譜柱壽命。所以,GC-MS檢測采用丙酮作樣品溶劑。

HPLC-MS通常優(yōu)先選用流動相作為樣品溶劑,經(jīng)測試,用甲醇作為溶劑時,響應(yīng)值較高,且無雜峰,故選用甲醇作流動相。

2.2 HPLC-MS條件選擇

2.2.1 色譜條件優(yōu)化 選擇1 mg/L氨氟樂靈標(biāo)準(zhǔn)品溶液對條件進(jìn)行優(yōu)化,選用甲醇-水/0.2%乙酸水和乙腈-水/0.2%乙酸水兩種流動相對氨氟樂靈進(jìn)行分離。結(jié)果表明,乙腈-水作為流動相時,峰面積較小,且有峰拖尾發(fā)生;將超純水更換為0.2%乙酸水后,峰拖尾情況有所改善,但峰面積依然較小。選用甲醇-水作為流動相時,峰面積較大,但峰型拖尾,而將超純水更換為0.2%乙酸水后,峰面積增大,且峰型對稱,所以確定選用甲醇-0.2%乙酸水作為流動相。

隨后對甲醇-0.2%乙酸水流動相比例進(jìn)行調(diào)整,結(jié)果表明,體積比為80∶20時,峰型最佳,且保留時間較短。而后調(diào)整流速與柱溫,在流速1 mL/min、 柱溫35 ℃時峰型最好,且峰面積最大。經(jīng)多次進(jìn)樣,數(shù)據(jù)并無較大波動,由此確定色譜條件。

圖1 HPLC-MS氨氟樂靈標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖Fig.1 HPLC-MS Standard chromatogram of prodiamine

2.2.2 質(zhì)譜條件優(yōu)化 在SCAN模式下,對1 mg/L氨氟樂靈標(biāo)準(zhǔn)品溶液進(jìn)行ESI離子源(+/-)模式相對分子質(zhì)量為200～500范圍內(nèi)掃描,得出在負(fù)離子模式下可獲得強(qiáng)有效峰,且349.1,351.0為主要離子,隨后選擇SIM模式雙通道模式對349.1,351.0進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn),在m/z為349.1時為最強(qiáng)有效峰。隨后在SIM模式下對質(zhì)譜條件進(jìn)一步優(yōu)化,調(diào)整碰撞誘導(dǎo)解離電壓等參數(shù),至樣品在儀器條件下響應(yīng)值達(dá)到最大時確定最終質(zhì)譜條件。

2.3 GC-MS條件選擇

2.3.1 離子選擇 對100 mg/L氨氟樂靈標(biāo)準(zhǔn)品溶液在相對分子質(zhì)量為100～700范圍內(nèi)進(jìn)行全掃描,根據(jù)氨氟樂靈質(zhì)譜圖(圖2)中豐度最大的離子,以及全掃描結(jié)果中豐度最大的離子確定設(shè)置定量離子為321,并另外選擇兩個豐度較大的離子作為輔助定性離子分別為279,333,隨后以上述離子進(jìn)行選擇離子監(jiān)測模式(SIM)對樣品進(jìn)行測定。

圖2 氨氟樂靈標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖Fig.2 Standard mass spectrometry of prodiamine

圖3 GC-MS氨氟樂靈標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖Fig.3 GC-MS Standard chromatogram of prodiamine

圖4 氨氟樂靈HPLC-MS標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.4 Standard curve of prodiamine in HPLC-MS

圖5 氨氟樂靈GC-MS標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.5 Standard curve of prodiamine in GC-MS

2.3.2 升溫程序的優(yōu)化 進(jìn)樣口溫度設(shè)置為250 ℃,可確保樣品完全氣化,且在進(jìn)樣口端不會因樣品分解造成峰面積減小等問題。初始柱溫設(shè)置為170 ℃保持1 min,以25 ℃/min升溫至230 ℃,再以10 ℃/min 升溫至260 ℃保持3 min,期間氨氟樂靈可以與雜質(zhì)完全分離,縮短了檢測時間并提高了檢測效率。

2.4 方法線性相關(guān)性與檢出限

2.4.1 HPLC-MS法標(biāo)準(zhǔn)工作曲線 甲醇標(biāo)準(zhǔn)工作液根據(jù)所述條件上機(jī)測定,采用外標(biāo)法定量,橫坐標(biāo)為質(zhì)量濃度x(mg/L),縱坐標(biāo)為響應(yīng)值y,將數(shù)據(jù)擬合得到線性回歸方程:y=657 674x-967.1,R2=1.000 0。根據(jù)國家標(biāo)準(zhǔn),在實際進(jìn)樣時,儀器的信噪比(S/N)等于3時所檢測的樣品濃度,得出在該儀器條件下的最低檢出限(LOD)值為0.002 mg/L。

2.4.2 GC-MS法標(biāo)準(zhǔn)工作曲線 丙酮標(biāo)準(zhǔn)工作液根據(jù)所述條件上機(jī)檢測,用Agilent MassHunter進(jìn)行分析,以溶液質(zhì)量濃度(mg/L)為橫坐標(biāo)x,響應(yīng)值為縱坐標(biāo)y繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得出線性回歸方程為y=6 448.2x-26.037,R2=0.999 6,在儀器信噪比(S/N)為3時,在該儀器條件下的LOD值為0.005 mg/L。

2.5 方法精密度測定

取氨氟樂靈甲醇、丙酮試樣溶液各5份,分別在上述兩種儀器條件下進(jìn)行檢測,結(jié)果見表1、表2。

表1 HPLC-MS 65%氨氟樂靈水分散粒劑精密度測定Table 1 Precision determination of 65% prodiamine WG in HPLC-MS

表2 GC-MS 65%氨氟樂靈水分散粒劑精密度測定Table 2 Precision determination of 65% prodiamine WG in GC-MS

HPLC-MS方法的標(biāo)準(zhǔn)偏差和變異系數(shù)分別是0.23%,0.36% (見表1),GC-MS方法的標(biāo)準(zhǔn)偏差和變異系數(shù)分別是0.32%,0.49%(見表2)。

2.6 準(zhǔn)確度實驗

準(zhǔn)確稱取10份已知含量65%氨氟樂靈水分散粒劑試樣,置于50 mL容量瓶中,各取5份分別加入一定量甲醇標(biāo)準(zhǔn)溶液和丙酮標(biāo)準(zhǔn)溶液,按上述兩種方法進(jìn)行測定,結(jié)果見表3、表4。

表3 HPLC-MS 65%氨氟樂靈水分散粒劑準(zhǔn)確度測定Table 3 Accuracy of 65% prodiamine WG in HPLC-MS

表4 GC-MS 65%氨氟樂靈水分散粒劑精密度測定Table 4 Accuracy of 65% prodiamine WG in GC-MS

由表可知,HPLC-MS法氨氟樂靈回收率為98.12%～101.35%,平均回收率為99.66%;GC-MS氨氟樂靈回收率為99.77%～101.91%,平均回收率為100.94%。

3 結(jié)論

采用HPLC-MS和GC-MS技術(shù),建立了測定65%氨氟樂靈水分散劑有效成分含量的兩種分析方法。與目前已有的氣相色譜法和高效液相色譜法比較,檢出限更低,且準(zhǔn)確度和精密度更高,線性相關(guān)性更好,同時具有操作方便、檢測時間較短等優(yōu)點,可作為氨氟樂靈水分散粒劑中有效成分的分析方法。