SHIP2、EGFL7 表達與肺癌患者臨床病理參數及預后的關系

陳慧芬，謝艷萍，梁亦賢，朱文娟

肺癌發病率及死亡率均居于惡性腫瘤前列[1]，其早期癥狀不明顯，待患者出現咳嗽、胸痛及氣短等癥狀而就診時，大多已進入中晚期，盡管目前肺癌的治療已取得顯著進步，但預后仍較差，尤其是腫瘤的侵襲轉移及復發，嚴重影響患者的生存時間及生存質量[2-3]。因此，探尋可用于評估肺癌預后的生物標志物，已成為科研工作者的研究熱點。有研究證實，含SH2 結構域的Ⅱ型肌醇5’-磷酸酶（SHIP2）蛋白參與腫瘤的發生及發展過程[4]。類表皮生長因子域7（EGFL7）屬于血管內皮表達基因，呈明顯特異性，該基因與惡性腦膜瘤發生及發展密切相關[5]。但目前臨床上關于SHIP2、EGFL7 表達與肺癌預后關聯性的研究尚不多見，本研究通過回顧性收集肺癌患者的病歷資料，以探討組織SHIP2、EGFL7 表達與肺癌患者臨床病理參數及預后的關系，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 回顧性收集2019 年1—12 月湖州市第一人民醫院收治的76 例肺癌患者的臨床及隨訪資料。納入標準：（1）符合《肺癌臨床診療指南（2018 版）》[6]中的相關診斷標準，且經病理學確診；（2）年齡≥18 歲；（3）無認知障礙及精神類疾病。排除標準：（1）伴有嚴重感染、全身免疫系統疾病及其他惡性腫瘤；（2）妊娠期或哺乳期女性；（3）臨床資料缺失。本研究經湖州市第一人民醫院醫學科研與臨床試驗倫理委員會審批通過。

1.2 方法

1.2.1 檢測方法 使用免疫組織化學SP（鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶）法檢測SHIP2、EGFL7 蛋白表達。收集入組患者經手術切除的癌組織及癌旁組織標本，癌旁組織為超過肺癌組織邊緣5 cm的無癌組織。SHIP2 蛋白表達：將切下組織予以石蠟包埋，4m 厚連續切片，二甲苯脫蠟，梯度酒精水化及蘇木精染色處理。先使用3%H2O2溶液清除內源性過氧化物，予以檸檬酸修復液在高溫高壓狀態下進行抗原修復，待冷卻后使用磷酸鹽緩沖液（PBS）漂洗3 次，每次漂洗時間為3 min，隨后加入一抗兔抗人SHIP2 單克隆抗體，在4 ℃環境中孵育過夜。待使用PBS漂洗后，使用3，3’二氨基聯苯胺四鹽酸鹽（DAB）顯色，蘇木精復染，脫水，封片。陰性對照組使用PBS 代替一抗進行處理。EGFL7 蛋白表達：以石蠟包埋切片，二甲苯脫蠟，梯度酒精水化，3%過氧化氫孵育處理后，使用磷酸鹽緩沖液（PBS）進行洗滌以阻斷內源性過氧化物酶；使用微波進行抗原修復，并分別加入正常羊血清和過氧化物酶溶液，待孵育后將一抗（兔抗人EGFL7 多克隆抗體）加入在4 ℃環境中進行孵育過夜，再加入生物素標記二抗和辣根過氧化物酶標記的鏈霉素卵白素鏈霉菌抗生物素溶液，最后使用DAB 染色，蘇木素復染，脫水及封片處理。陰性對照組使用PBS 代替一抗進行處理。最后在顯微鏡下觀察。

1.2.2 結果判定 免疫結果判定由病理科兩位高年資醫師獨立完成。以細胞膜或細胞漿內出現棕黃色或棕褐色染色，判定為SHIP2、EGFL7 蛋白表達陽性。每個切片隨機選擇5 個視野，由病理醫師在光學顯微鏡下進行觀察。根據二次積分法進行計分，將細胞染色強度與陽性細胞所占比例乘積作為評分，其中陽性細胞染色強度評分標準如下：若未見染色則計為0分，淺黃色計為1 分，淺棕色計為2 分，深棕色計為3 分；陽性細胞所占比例評分具體如下：若＜5%則計為0分，5%～25%計為1 分，26%～50%計為2 分，51%～75%計為3 分，若＞75%則計為4 分。將上述兩項分數的乘積作為總評分，若總評分＜3 分，則判定為低表達（陰性）；若總評分≥3分，則判定為高表達（陽性）。

1.3 隨訪 隨訪時間為3 年，包括電話隨訪及門診復診，收集患者臨床資料，截止時間為2022 年12 月，統計所有入組患者的3 年生存率。

1.4 統計方法 采用SPSS 23.0 統計軟件進行數據分析，計數資料采用2檢驗；采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，組間比較采用Log-rank檢驗；采用多變量Cox 回歸分析影響肺癌預后的影響因素。P ＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 肺癌組織及癌旁組織SHIP2、EGFL7 蛋白表達比較 肺癌組織中SHIP2、EGFL7 蛋白高表達率均高于癌旁組織（均P ＜0.05），見表1。

表1 肺癌組織及癌旁組織SHIP2、EGFL7 表達情況比較例（%）

2.2 SHIP2、EGFL7 表達與肺癌患者臨床病理參數的關系 SHIP2、EGFL7 高表達與低表達組性別、年齡、腫瘤大小、病理類型及分化程度差異均無統計學意義（均P ＞0.05），但兩組TNM 分期及淋巴結轉移差異均有統計學意義（均P ＜0.05），見表2。

表2 SHIP2、EGFL7 表達與肺癌患者臨床病理參數的關系例

2.3 預后情況 肺癌患者3 年生存率為46.05%（35/76），其中SHIP2 高表達組3 年生存率為32.65%（16/49），低表達組為70.37%（19/27），SHIP2 高、低表達組3 年生存率差異有統計學意義（=9.968，P＜0.05）；EGFL7 高表達組3 年生存率為36.17 %（17/47），低表達組為62.07%（18/29），EGFL7 高、低表達組3 年生存率差異有統計學意義（=4.842，P＜0.05），見圖1 ～2。

圖1 SHIP2 表達組生存曲線

圖2 EGFL7 表達組生存曲線

2.4 多因素Cox 回歸分析TNM 分期、淋巴結轉移、SHIP2 及EGFL7 高表達均為影響肺癌患者預后的獨立危險因素（均P ＜0.05），見表3。

表3 多因素Cox 回歸分析

3 討論

國內外對肺癌致病因素及發病機制已有大量研究，但其發病機制較為復雜，且受多種因素影響，導致臨床上對肺癌的診斷及預后評估的準確性仍存在不足。因此，為進一步明確診斷，使患者盡早得到有效治療，降低復發率及死亡率，有必要繼續探索可用于明確早期肺癌診斷的標志物及預后的影響因子。本研究結果顯示肺癌組織中SHIP2、EGFL7 蛋白高表達率均高于癌旁組織（均P ＜0.05），這說明SHIP2、EGFL7 蛋白高表達與肺癌的發生有關。賴世平等[7]研究后發現在卵巢癌組織中SHIP2 蛋白高表達所占比例顯著高于癌旁組織；張芳等[8]認為EGFL7蛋白在常見淚腺上皮性腫瘤組織中呈高表達狀態，且與血管生成及腫瘤細胞增殖活性呈明顯相關性。有研究指出，磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶（P13K/Akt）信號轉導通路與腫瘤細胞增殖、分化密切相關，該通道在腫瘤細胞惡性增殖和轉移及新血管生成過程中具有重要作用[9]；SHIP2 通過負向調節P13K/Akt 信號轉導通路可達到抑制腫瘤細胞增殖的目的[10]。EGFL7 具有內分泌功能，EGFL7 蛋白介導機體胚胎血管發育及內皮細胞遷移過程，而血管生成是影響惡性腫瘤生長、侵襲及轉移的重要因素，在宮頸癌[11]、直腸癌[12]等惡性腫瘤組織中EGFL7 蛋白呈高表達。因此，EGFL7 可能通過參與血管生成而介導腫瘤發生、進展過程。

本研究結果顯示肺癌組織中SHIP2、EGFL7 高表達與TNM 分期、淋巴結轉移有關（均P ＜0.05），這提示SHIP2、EGFL7 高表達可能參與肺癌發生、發展過程。劉固等[13]提出EGFL7 蛋白參與結直腸癌（CRC）發生、侵襲及轉移等，EGFL7 高表達與TNM分期無關，但與淋巴結轉移呈明顯相關性，并認為EGFL7 表達可作為CRC術后預后情況的預測因子。SHIP2、EGFL7 高表達組3 年生存率低于低表達組（P ＜0.05），這表明SHIP2、EGFL7 高表達與肺癌預后有關，且高表達通常提示預后不良。另外，本研究通過多因素Cox 回歸分析結果顯示TNM 分期、淋巴結轉移、SHIP2 及EGFL7 高表達均為影響肺癌患者預后的獨立危險因素（均P ＜0.05）。這進一步說明SHIP2、EGFL7 高表達不僅與肺癌發生及預后明顯相關，還可作為評估肺癌預后的預測因子[14]。有研究顯示，SHIP2 表達與非小細胞肺癌的轉移和血管侵襲密切相關。Feleke 等[15]在報道中提出EGFL7在骨肉瘤（OS）和骨巨細胞瘤（GCTB）中呈高表達，可作為OS 和GCTB 細胞靶向治療和預后評估的生物標志物。另外，Heissig 等[16]提出EGFL7 表達可能介導腫瘤生長、轉移及耐藥性。因此，肺癌患者SHIP2、EGFL7 高表達可引起腫瘤細胞增殖、分化，導致疾病進一步惡化，故監測肺癌組織SHIP2、EGFL7 表達水平可評估患者預后情況。

利益沖突 所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明 陳慧芬：實驗操作、論文撰寫；謝艷萍、梁亦賢、朱文娟：數據整理、統計學分析、論文修改