貴州蜜環菌資源的分子標記與遺傳多樣性分析

王彩云, 武新玲, 侯 俊, 王 永, 成忠均, 張翔宇*

(1.畢節市中藥研究所, 貴州 畢節 551700; 2.山東中醫藥大學 藥學院, 山東 濟南 250355; 3.中國醫學科學院 藥用植物研究所, 北京 100193; 4.大方縣鄉村振興局, 貴州 大方 551600)

0 引言

【研究意義】蜜環菌屬〔Armillaria(Fr.) Staude〕是擔子菌綱傘菌目口蘑科中具有重要藥用、經濟價值的屬,也是全球森林生態系統真菌區系中重要組成部分。蜜環菌(Armillariamellea)不僅是我國傳統名貴中藥材豬苓(Grifolaumbellata)和天麻(Gastrodiaelatal)栽培必不可少的共生菌,而且具有較高的食藥用價值。另外,蜜環菌在全世界寒帶和溫帶侵染600多種樹木,可導致林木根朽病,闊葉樹及針葉樹尤為嚴重[1]。目前,全球蜜環菌生物種為北美10個、歐洲7個、非洲5個、澳洲5個,亞洲至少存在19個生物種,我國分布有15種[2]。自1978年Korhonen首次發現蜜環菌生物種以來,生物種已成為蜜環菌系統分類的基礎,根據生物種建立的分類種,已得到森林病理學和菌物分類學界的廣泛認可[3]。而蜜環菌屬的系統發育學和遺傳多樣性研究是現代蜜環菌生物種研究的熱點之一,具有重要意義。【前人研究進展】國內外學者在蜜環菌屬的分子鑒定及遺傳多樣性方面開展了大量研究,COETZEE等[4-5]基于ITS和IGS-1序列進行了來自印尼、馬來西亞以及南美的部分蜜環菌屬種的系統進化地位分析和分子鑒定;KIM等[6-7]采用RFLP、ITS、AFLP等多種標記手段對北美的部分蜜環菌屬種進行了鑒定以及系統進化分析,部分菌株得到有效區分;國內關于蜜環菌報道中,王守現等[8]用RAPD技術進行了13個蜜環菌菌株的遺傳多樣性分析,提出RAPD技術可以有效區分蜜環菌菌株并分析其遺傳多樣性;孫立夫等[9]應用ISSR技術分析了采自東北的53個法國蜜環菌菌株的遺傳多樣性,提出ISSR標記在蜜環菌中存在較高的多態性。【研究切入點】目前,有關蜜環菌的研究報道主要集中于生物學特征、化學成分分析等方面[10-16],有關貴州蜜環菌菌株分子標記及遺傳多樣性分析的報道相對較少。【擬解決的關鍵問題】利用分子標記技術對貴州天麻主產區畢節地區19個蜜環菌居群的菌株遺傳多樣性進行分析,構建聚類分析樹狀圖,弄清親緣關系,并討論其形成的可能原因,以期為蜜環菌的優良資源篩選及后續研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 蜜環菌 供試蜜環菌為畢節市中藥研究所從貴州天麻主產區收集的蜜環菌資源(表1),經分離、提純后的試管種。

表1 供試蜜環菌資源信息與來源

1.1.2 主要試劑和儀器 用于PCR反應的2×M5HiPer plus Taq HiFi PCR mix 購于北京聚合美生物科技有限公司,引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。標準DNA分子量(Marker)DL5000購于寶日醫生物技術(北京)有限公司(TaKaRa)。DNA提取試劑盒(貨號DP305)購于天根生化科技(北京)有限公司。PCR擴增儀(Appliedbiosystems,Veriti)、凝膠成像系統(Bio-Rad,XRS+)、NanoDrop分光光度儀(Thermo Scientific,NanoDrop2000)、電泳儀(Bio-Rad,通用電泳儀164-5070)。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取及濃度測定 取適量蜜環菌的新鮮菌索,置于液氮中研磨后利用天根生化科技(北京)有限公司的植物基因組DNA提取試劑盒(貨號DP305)提取蜜環菌DNA,將DNA原液保存于-20 ℃備用。再利用微量核酸蛋白分析儀Nanodrop 2 000測定DNA濃度及純度,并利用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的完整性。

1.2.2 分子標記的擴增引物及篩選 依據參考文獻[17-19],選擇3對引物進行蜜環菌分子標記擴增并進行分析,其中,1#引物[17]序列為AR1,5′-CTGACCTGTTAAAGGGTATGTGC-3′;AR2,5′-AAGCTGAATCCTTCTACAAAGTCAA-3′;2#引物[18]序列為EF595F,5′-CGTGACTTCATCAAGAACATG-3′;EF1160R,5′-CCGATCTTGTAGACGTCCTG-3′;3#引物[19]序列為LR12R,5’-CTGAACGCCTCTAAGTCAGAA-3′;O-l:5′-AGTCCTATGGCCGTGGAT-3′。以此3對引物分別對蜜環菌DNA進行分子標記擴增,選擇合適引物。

1.2.3 PCR擴增 以蜜環菌DNA為模板,分別利用1.2.2確定的引物進行PCR擴增。PCR擴增反應在Bio-Rad PCR擴增儀上進行,反應程序為95 ℃預變性5 min;95 ℃變性30 s,57 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,40個循環;72 ℃延長7 min,4 ℃保存。PCR擴增體系為DNA 3 μL,F/R引物各0.5 μL,10 μL 2× M5HIPer plus Taq HIFI PCR mix,ddH2O 6 μL,總體系為20 μL。PCR產物用1.0%瓊脂糖凝膠,電泳儀180 V電壓15 min,測定引物是否能擴增出目的片段。

1.2.4 序列比對及聚類分析 將PCR擴增所得原液送至中國農業科學院進行Sanger測序。用ContigExpress拼接測序結果,并去除兩端不準的部分。將拼接好的序列在NCBI數據庫中進行比對,并下載同源度較高的序列用于構建系統發育樹。運用DNASTAR中的EditSeq對堿基長度、GC含量等進行測量;利用MEGA7.0進行聚類分析并構建進化樹。

2 結果與分析

2.1 蜜環菌菌株的DNA質量

用植物基因組DNA試劑盒(DP305)提取蜜環菌基因組DNA,OD260/OD280值在1.63～1.96,DNA濃度為24.9～117.8 ng/μL(表2),其純度和產量均較高,說明所提取的DNA可用于后續試驗。

表2 供試蜜環菌樣品的DNA濃度與OD260/OD280值

2.2 蜜環菌菌株的適宜引物

3對引物以蜜環菌DNA為模板進行PCR擴增、電泳檢測后發現,2#、3#引物均能有效對19份蜜環菌DNA模板進行擴增(圖1)。2#、3#引物適用于蜜環菌種群,對蜜環菌DNA模板產生各自特有且清晰的目的基因帶。因此,選用2#、3#引物進行分子標記擴增分析。

圖1 蜜環菌樣品用2#(上)、3#(下)引物擴增的目的片段圖譜

2.3 蜜環菌菌株的堿基組成

由表3可知,19株蜜環菌以2#、3#引物擴增獲得序列的堿基長度、GC含量等均不同。其中,以2#引物擴增的序列,堿基片段長度為574～667 bp,平均值為593 bp;GC含量為51.79%～54.27%,平均含量為53.56%。C含量為23.43%～30.13%,平均含量為26.38%;G含量為23.43%～30.34%,平均含量為27.18%;A含量為25.21%～22.15%,平均含量為23.31%;T含量為22.01%～24.62%,平均含量為22.96%。以2#為引物時,各供試菌株的GC含量差異不明顯,表明其親緣關系較近,其中,10號、13號菌株的堿基長度以及GC含量、各堿基含量均相同,表明2個菌株的親緣關系極為接近。以3#引物擴增的序列,堿基片段長度為828～925 bp,平均值為891 bp;GC含量為43.01%～45.00%,平均含量為44.02%。C含量為18.15%～25.42%,平均含量為22.74%;G含量為17.51%～25.16%,平均含量為21.26%;A含量為23.82%～33.57%,平均含量為28.68%;T含量為23.62%～33.06%,平均含量為27.20%。以3#為引物時,各供試菌株的GC含量差異不明顯,表明其親緣關系較近,其中,1號菌株與3號菌株的GC含量相同,堿基長度相同,表明其親緣關系極為接近。

表3 2#、3#引物擴增19個蜜環菌菌株的堿基組成

2.4 蜜環菌菌株的相似率

由表4可見,各供試蜜環菌菌株以2#引物擴增得到的序列比對覆蓋率不低于82%,序列相似率不低于96.08%。其中,8、14、17的DNA序列與A.mellea的同源性最高,序列相似率均達99%以上,基因覆蓋度均達96%以上,其余16個菌株的DNA序列與A.gallica的同源性最高,序列相似率均高于96%,基因覆蓋度均達82%以上。

表4 各菌株用2#、3#引物擴增序列的相似率

各供試蜜環菌菌株以3#引物擴增得到的序列比對覆蓋率不低于93%,序列相似率不低于98.45%。其中,10號菌株的序列比對覆蓋率為93.00%,序列相似率為99.88%,與A.sinapina的同源性最高;11號菌株的序列比對覆蓋率為99.00%,序列相似率為99.54%,與A.cepistipes的同源性最高;8、14、17的DNA序列與A.mellea的同源性最高,序列相似率均達98%以上,基因覆蓋度均達94%以上;其余14個菌株的DNA序列與A.gallica的同源性最高,序列相似率均高于99%,基因覆蓋度均達94%以上。綜上,貴州天麻主產區畢節市野生蜜環菌資源,大部分為A.gallica,少部分為A.mellea。

2.5 蜜環菌菌株的聚類

如圖2所示,2#引物將19份天麻樣品分為7大類,樣品(2)、4、2、(1)、16、17聚為第1類,其中4、(2)、2、(1)的遺傳距離最近;第2類為樣品7、12;第3類為樣品9、15;第4類為樣品8、3、11;樣品6單獨聚為一類;第6類為樣品1、5、14;第7類為樣品10、13。與上述分類不同,3#引物將19份樣品分為5大類,樣品4、13、9、11聚為第1類;樣品6、12、17聚為第2類;樣品14單獨為1類,與A.mellea的遺傳距離最近;樣品(1)、10單獨為第4類;樣品2、(2)、8、16、7、5、15、1、3聚為第5類,其中,樣品2、(2)遺傳距離最近,5、15、1、3遺傳距離最近。

圖2 2種引物擴增蜜環菌樣品DNA目的片段的進化樹

從2#、3#引物的擴增序列構建的系統發育樹看,19個菌株在系統發育樹上的聚類結果與表3的GC含量分析基本一致;與表4結果接近。來自不同地區的蜜環菌菌株未聚為一類,說明蜜環菌資源遺傳多樣性豐富,與地理環境關系不密切。8號和9號菌株均來自畢節市七星關區楊家灣鎮,8號分離于菌材,9號分離于子實體,但是遺傳距離較遠,親緣關系不密切,可能是相同地區的菌株自身發生遺傳變異,導致菌株的遺傳多樣性。

3 討論

近年來,世界各地關于蜜環菌的報道越來越多,歐洲、北美等地對蜜環菌的研究較早也比較深入,我國有關蜜環菌的研究進展較快,蜜環菌的鑒定方法隨之從傳統的形態學鑒定發展到如今的分子生物學鑒定。作為傳統經典的鑒定方法,形態學有著其獨特的優越性,但由于蜜環菌分類特征不明顯,表觀形態多樣,而且需要結合孢子、菌索、子實體等樣本才能鑒定,受到較大限制;在分子生物學鑒定中,采用單個的IGS、ITS、EF-1α序列無法準確鑒定每個蜜環菌種。基于此,研究選擇特異性引物2#(翻譯延伸因子1α基因,EF-1α)以及3#引物(基因間隔區,IGS),其中,翻譯延伸因子1α基因參與蛋白質的合成。研究結果表明,2個引物擴增序列得到的聚類結果不一樣,可能是因為2種引物擴增的區域進化速度不相同,EF-1α的進化相對保守。對采自貴州畢節市的19份野生蜜環菌資源進行基于分子標記的遺傳多樣性分析后,2對引物均能有效擴增蜜環菌的基因組DNA,并能對貴州畢節產區蜜環菌資源進行有效分類,對蜜環菌遺傳多樣性研究提供了寶貴資源,該分子標記體系的建立為今后利用分子標記對蜜環菌遺傳多樣性研究、親緣關系分析及種質資源鑒定等研究工作奠定了基礎。

研究種質資源遺傳多樣性的有效方法是聚類分析和GC含量,在生物體的DNA序列中,GC含量能夠反映出種屬間親緣關系的遺傳特性,每個物種的DNA中都有其特定的GC含量,不同物種的GC含量不同,GC含量差異越小,親緣關系越接近[20]。基于聚類和GC含量等對來源于貴州主產區的19份蜜環菌種質進行分析,以2#引物擴增的序列分為7大類群,以3#引物擴增的序列分為5大類群,不同地區來源的種質相互交錯,親緣關系與地理來源無明顯相關性,但貴州畢節市野生蜜環菌資源大部分為A.gallica,少部分為A.mellea。黃萬兵等[21]研究提出,A.gallica、A.cepistipes能促進天麻生長;CHA等[22-23]研究提出,A.gallica的共生效果相對較好。研究發現,貴州畢節市天麻主產區存在豐富的A.gallica資源,因此完全有條件篩選最適宜當地天麻種植的蜜環菌菌種來發展天麻產業,無需從外地引種、購種,從而有效避免長期跨地區引種帶來的產量不穩、菌種退化等問題。

4 結論

2#、3#引物能有效擴增蜜環菌的基因組DNA,并能將采自貴州畢節市的19份野生蜜環菌資源進行有效分類。通過序列比對、GC含量分析以及聚類分析發現,不同地區的蜜環菌資源相互交錯,親緣關系與地理來源無明顯的相關性,貴州畢節市野生蜜環菌資源大部分為A.gallica,少部分為A.mellea。