給水系統(tǒng)微生物檢測方法的比較

許 皓,趙 蓓,李相宜,尚風(fēng)雷,焦復(fù)燃

(北京市自來水集團(tuán)有限責(zé)任公司,北京市供水水質(zhì)工程技術(shù)研究中心,北京 100031)

飲用水安全與人類健康息息相關(guān)。在2003年世界環(huán)境日的致辭中,時(shí)任聯(lián)合國秘書長的科菲·安南指出全世界80%的疾病和50%的兒童死亡都與飲用水水質(zhì)不良有關(guān),并強(qiáng)調(diào)水在人類生存和可持續(xù)發(fā)展中的核心作用。世界衛(wèi)生組織于2017年制定的Guidelinesfordrinking-waterquality:Fourtheditionincorporatingthefirstaddendum[1]中指出,保證飲用水微生物安全在于找到方法防止或減少病原體進(jìn)入水源,并減少對去除病原體的處理過程的依賴。該報(bào)告同時(shí)指出,飲用水微生物衛(wèi)生安全除了與糞便污染有關(guān),還會(huì)受到生長在供水管網(wǎng)中部分微生物(如軍團(tuán)菌)的影響。此外,還有研究[2]表明自來水廠某些處理過程存在微生物泄漏風(fēng)險(xiǎn)。隨著飲用水水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)的不斷嚴(yán)格,水廠微生物安全性和風(fēng)險(xiǎn)管控的需求都提高到新的水平。

部分基于培養(yǎng)的傳統(tǒng)微生物檢測方法存在不準(zhǔn)確、時(shí)效性不高等缺點(diǎn),無法滿足全面、深入的微生物檢測需求。因此,選擇適合的微生物檢測方法,實(shí)現(xiàn)對給水系統(tǒng)中微生物快速、準(zhǔn)確地檢測,并能夠進(jìn)一步深入開展微生物溯源尤為重要。本文通過總結(jié)基于傳統(tǒng)培養(yǎng)、生物化學(xué)和分子生物學(xué)的3類檢測方法,綜合對比其優(yōu)缺點(diǎn)和應(yīng)用特性,為從源頭到龍頭全供水過程的微生物安全保障提供參考。

1 基于培養(yǎng)的傳統(tǒng)方法

傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法大多依賴于直接觀察培養(yǎng)微生物的生理行為。

飲用水微生物檢測中,異養(yǎng)菌平板計(jì)數(shù)(heterotrophic plate count, HPC)即根據(jù)以有機(jī)碳源為營養(yǎng)源的培養(yǎng)基檢測到的微生物計(jì)數(shù),描述所有異養(yǎng)菌數(shù)量的方法[3],其作為傳統(tǒng)的指示菌檢測手段于一個(gè)多世紀(jì)前提出[4]。該方法現(xiàn)多用于檢測水中的細(xì)菌總數(shù),在國內(nèi)外飲用水水質(zhì)監(jiān)測指標(biāo)中均有規(guī)定相應(yīng)的培養(yǎng)時(shí)間、溫度及檢出限值,與總大腸桿菌群一起作為衡量消毒效果的指標(biāo)[5]。

根據(jù)配方不同,HPC培養(yǎng)基多為傳統(tǒng)營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(PCA)、貧營養(yǎng)培養(yǎng)基(R2A)、高營養(yǎng)的5%羊血瓊脂培養(yǎng)基(TSA-SB)等[3]?；【?、埃希氏菌、沙門氏菌、氣單胞菌、彎曲桿菌、志賀氏菌等存活但不能檢出或生長相對緩慢的細(xì)菌,使用PCA的HPC結(jié)果被證明低于水體中實(shí)際細(xì)菌總數(shù)[6]。同時(shí),也有人認(rèn)為使用PCA檢測得到的細(xì)菌代表著可快速生長的細(xì)菌,當(dāng)存在糞便污染時(shí)可能與大腸菌群和腸道病原體一起出現(xiàn)[7]。R2A營養(yǎng)成分較PCA豐富且含量低,適合產(chǎn)色素菌生長,更適合對飲用水中細(xì)菌的檢測[8]。

根據(jù)接種方法的不同,HPC可分為倒平板(pour plate, PP)法、涂布(spread plate, SP)法和濾膜(membrane filter, MF)法,3種方法的優(yōu)缺點(diǎn)對比如表1所示[7]。

表1 HPC不同接種方法優(yōu)缺點(diǎn)Tab.1 Advantages and Disadvantages of Different Vaccination Methods of HPC

綜上,HPC的優(yōu)點(diǎn)是成本低廉、操作較簡單,且對操作人員的專業(yè)水平要求較低,是國內(nèi)較普遍使用的方法。但具有較多缺點(diǎn):(1)HPC檢測到的總細(xì)菌群落比例通常低于飲用水中實(shí)際比例[4],該方法除了無法檢測飲用水中部分“存活但不可培養(yǎng)”的細(xì)菌和生長相對緩慢的細(xì)菌外,還無法檢測死亡的細(xì)菌;(2)可檢測最大樣品量受限;(3)不同的培養(yǎng)基、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時(shí)間對細(xì)菌數(shù)量和種群影響大[4];(4)培養(yǎng)用時(shí)長,需要一天至幾天,無法滿足快速檢測需求[9];(5)部分接種方式對操作環(huán)境要求嚴(yán)格。

R2A多用于檢測飲用水、顆?；钚蕴?granular activated carbon, GAC)、管道內(nèi)壁生物膜、無損反滲透膜內(nèi)異養(yǎng)菌的數(shù)量[6]。美國在檢測供水管網(wǎng)消毒劑效果時(shí),使用PP法加PCA在(35±0.5)℃和(48±2)h的條件下進(jìn)行檢測,來排除高HPC結(jié)果對總大腸桿菌檢測的影響。若無消毒劑殘留,則規(guī)定HPC小于500 CFU/mL的檢出限值。當(dāng)用低營養(yǎng)介質(zhì)的培養(yǎng)基檢測到較高數(shù)量的細(xì)菌時(shí),一些美國自來水公司將其作為水質(zhì)變化的敏感指標(biāo),可能代表氯胺消毒的水存在硝化問題,或次氯酸鈉消毒的水存在消毒劑殘留量不足等問題[7]。MF法可測定樣品體積靈活,但受限于濾膜孔徑,適合檢測渾濁度較低的樣品。HPC可用于檢測飲用水水源水的污染[10-12],評價(jià)水處理過程中生物穩(wěn)定性和活性,探究水質(zhì)指標(biāo)對生物穩(wěn)定性的影響,評估各處理單元效率效果[13-17],還可用于評價(jià)配水管網(wǎng)中的生物穩(wěn)定性[16,18-23]。

2 基于生物化學(xué)的微生物檢測方法

基于生物化學(xué)的方法是利用微生物體中不同分子的結(jié)構(gòu)和功能特性,通過特異的生化反應(yīng)或生物分子特征檢測微生物的方法,包括固定底物酶底物法(defined substrate technology, DST)、流式細(xì)胞術(shù)(flow cytometry, FCM)和三磷酸腺苷(ATP)生物發(fā)光法。

2.1 DST

DST是傳統(tǒng)的鑒別培養(yǎng)基的一種應(yīng)用。根據(jù)微生物的代謝特點(diǎn),利用生物化學(xué)反應(yīng)的原理,在培養(yǎng)基中加入某種指示劑或化學(xué)藥品,一般可直接測定某種微生物的種類。在飲用水檢測中,該方法多應(yīng)用于總大腸菌群和嗜肺軍團(tuán)菌的檢測[24]。

DST的優(yōu)點(diǎn)在于假陽性/陰性的發(fā)生率比一般酶底物法低,且檢驗(yàn)周期短[25]、靈敏度高、操作流程簡單[24]。DST和基于最可能數(shù)法(MPN)建立的Colilert?-QuantiTray聯(lián)合方法(IDEXX, Chalfont St. Peter, UK)對培養(yǎng)的環(huán)境、設(shè)施和人員要求也更低[26]。該方法已列入《生活飲用水標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法 微生物指標(biāo)》(GB/T 5750.12—2006)[27]。但是,目前DST所需檢測試劑為國外進(jìn)口,價(jià)格較高,可能限制該方法的使用。

在實(shí)際應(yīng)用中,大腸菌群產(chǎn)生的特異性酶可以分解培養(yǎng)基中的色原底物,使培養(yǎng)液呈黃色。檢測大腸桿菌可以通過其產(chǎn)生的特異性酶使培養(yǎng)基出現(xiàn)熒光反應(yīng)[25],或使用伊紅-美藍(lán)試劑使大腸桿菌出現(xiàn)深紫色且?guī)в薪饘俟鉂傻奶卣鞣磻?yīng)。DST除了可檢測總大腸菌群和埃希氏菌,還可實(shí)現(xiàn)大量樣品中糞大腸菌群[28-30]、嗜肺軍團(tuán)菌[31-32]、銅綠假單胞菌[33]、腸球菌[34]等特定菌種的快速檢測,并能在無法保證無菌的環(huán)境下使用[24],適用于應(yīng)急污染事故的快速評價(jià)。

2.2 FCM

FCM是一種基于特定細(xì)胞亞群的熒光或光散射特性,利用激光測量分析液相中懸浮細(xì)胞或微粒的技術(shù)。該技術(shù)多用于水中細(xì)菌總數(shù)的檢測。

FCM的優(yōu)點(diǎn)在于較傳統(tǒng)方法耗時(shí)短、誤差小、靈敏度高,可用于區(qū)分活菌和死菌,并獲得活菌百分比,適用于各類水質(zhì)檢測[35]。劉曉露[9]、沈朕等[36]證明了FCM在微生物應(yīng)急快速檢測中有較高的可信度。

在實(shí)際應(yīng)用中,FCM可用于分析水源水中水生生物信息,對病毒、細(xì)菌、藻類進(jìn)行計(jì)數(shù)分類、活性鑒定和功能檢測,達(dá)到快速區(qū)別不同水源水、識(shí)別實(shí)際操作中的異常值[37-38]、描述水源水中微生物實(shí)時(shí)波動(dòng)的目的[11]。通過追蹤細(xì)胞損傷動(dòng)力學(xué)、微生物水動(dòng)力學(xué)和細(xì)菌細(xì)胞總數(shù)評估過濾單元、消毒單元[39]的效率和效果[17,37,40-43],評估工藝段是否能有效控制由水源水波動(dòng)引起的微生物波動(dòng)[11],監(jiān)控微生物穩(wěn)定性[16,44-46],用于水廠微生物水質(zhì)檢測系統(tǒng)預(yù)警[41]。在管網(wǎng)中,FCM可有效用于檢測追蹤微生物的再生,識(shí)別可能的污染源,分析細(xì)菌再生的原因[47-51],也可分析建筑物中水停滯后微生物群落的變化[52]。該技術(shù)的突出應(yīng)用是在微生物全自動(dòng)在線檢測系統(tǒng)的建設(shè)和水污染事件快速響應(yīng)機(jī)制的建立方面[53],例如,Hammes等[54]建立了將流式檢測和數(shù)據(jù)分析結(jié)合起來的自動(dòng)檢測系統(tǒng),Besmer等[10]也研究了長期使用FCM系統(tǒng)檢測飲用水處理流程和水源水的系統(tǒng)。

2.3 ATP生物發(fā)光法

ATP是僅出現(xiàn)在活細(xì)胞內(nèi)的基礎(chǔ)能量單位,其數(shù)量與細(xì)菌數(shù)成正比。該方法基本原理是利用熒光素酶試劑對活細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記,利用生物發(fā)光儀檢測發(fā)出的熒光[9]。優(yōu)點(diǎn)在于檢測時(shí)間短、操作簡單;缺點(diǎn)在于靈敏度和準(zhǔn)確性不高、反應(yīng)體系的最佳條件未知,并且難以消除天然水體中細(xì)胞及游離ATP對結(jié)果的干擾[55]。

ATP生物發(fā)光法雖然只能判斷微生物的數(shù)量和活性,但對污染或微生物入侵的敏感性較高,多與其他特異性檢測方法搭配使用,用于水源水中檢測菌落總數(shù)[55-58];監(jiān)測水廠出現(xiàn)污染的緊急狀況[59],檢測細(xì)菌群落豐度,建立各類模型[60-62];檢測判斷管網(wǎng)生物穩(wěn)定性的影響因素[16,23,63]。在在線監(jiān)測系統(tǒng)中與FCM或作為細(xì)菌指示劑與基于微流體的系統(tǒng)相配合,可實(shí)現(xiàn)快速實(shí)時(shí)監(jiān)測[64]、篩選特定微生物、監(jiān)測飲用水污染[65-66]的作用,并起到預(yù)警作用[67]。

3 基于分子生物學(xué)的方法

基于分子生物學(xué)的方法依賴于對DNA和RNA研究技術(shù)的進(jìn)步,包括基于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(poly-merase chain reaction,PCR)技術(shù)的方法、指紋圖譜法、基于高通量測序(high-throughput sequencing, HTS)技術(shù)的方法。

3.1 基于PCR技術(shù)的方法

3.1.1 PCR

PCR是一種體外快速擴(kuò)增特異性核酸片段的技術(shù),于1983年由Mullis等[68]提出并迅速投入試驗(yàn)。其原理是以人工合成的核苷酸序列為引物,在DNA聚合酶的作用下,通過反應(yīng)溫度的變化,對目的基因進(jìn)行指數(shù)擴(kuò)增,從而特異性地?cái)U(kuò)增目標(biāo)細(xì)菌特定基因片段[9]。

PCR分析具有較高的特異性、靈敏度和重復(fù)性,檢測耗時(shí)較短[9],但最大缺點(diǎn)是不能區(qū)分病原體的活性。PCR分析是基于完整的核酸,而不是完整的活細(xì)胞,因此,病原菌PCR擴(kuò)增陽性可能來自死亡細(xì)胞或非感染性細(xì)胞的假陽性[69]。同時(shí),該技術(shù)無法對起始模板準(zhǔn)確定量,只能通過電泳對擴(kuò)增反應(yīng)的最終產(chǎn)物進(jìn)行定性[70]。

3.1.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative real-time PCR,qPCR)與常規(guī)PCR相比可以實(shí)現(xiàn)定量分析,具有更好的特異性、靈敏度和自動(dòng)化程度,同時(shí)可以解決PCR污染的問題[9],是目前應(yīng)用最廣泛的PCR技術(shù)。根據(jù)qPCR所用熒光化學(xué)物質(zhì)的不同,可分為熒光染料和熒光探針2類[70]。

熒光染料SYBR Green Ι與dsDNA的結(jié)合具有非特異性,可能使試驗(yàn)產(chǎn)生假陽性結(jié)果,因此,其特異性不如探針法[71]。但此檢測方法較為簡單,成本較熒光探針更低。

熒光探針TaqMan具有高度特異性[72]。與熒光染料相比,探針法的特異性節(jié)省了時(shí)間,敏感性、特異性、穩(wěn)定性更高,但其缺點(diǎn)是仍無法區(qū)分細(xì)菌的活性[9]。

3.1.3 數(shù)字PCR

數(shù)字PCR(digital PCR, dPCR)屬于第3代PCR,最早出現(xiàn)于1999年[73]。相較于qPCR,dPCR能夠直接讀出DNA分子的個(gè)數(shù),是一種對起始樣品核酸分子的絕對定量技術(shù)。該方法的優(yōu)點(diǎn)是使得該技術(shù)能夠檢測野生型序列背景中的罕見突變,還能降低樣本中抑制劑對結(jié)果的干擾[74]。

由于能有效進(jìn)行樣本劃分和單分子目標(biāo)擴(kuò)增,dPCR在理論上優(yōu)于qPCR,但在實(shí)踐中,因qPCR具有更高的靈敏度,其在特定應(yīng)用方面仍優(yōu)于dPCR[74]。

表2總結(jié)對比了3代PCR技術(shù)的特點(diǎn)[75]。

表2 3代PCR技術(shù)特點(diǎn)對比Tab.2 Comparison of Three Generations of PCR Technologies

PCR對特定檢測目標(biāo),如致病性大腸桿菌和“兩蟲”[76-78]的檢測,有比較深入而廣泛的研究[79-82]。PCR技術(shù)可檢測水源水、水處理各單元和管網(wǎng)中的特定條件致病菌,并能精確到屬水平,對給水系統(tǒng)的微生物風(fēng)險(xiǎn)管控提供建議[83-87]。新建立的多重PCR檢測技術(shù)可一次性同時(shí)檢測多種致病菌[88-89]和抗生素抗性基因(antibiotic resistance genes, ARGs),為飲用水中ARGs和潛在抗性致病菌的風(fēng)險(xiǎn)防控提供理論指導(dǎo)[90],評估管網(wǎng)管材腐蝕與微生物群落間的聯(lián)系[91]。

3.2 指紋圖譜法

3.2.1 梯度電泳技術(shù)

梯度電泳技術(shù)按發(fā)展時(shí)間可分為變性梯度凝膠電泳(denaturing gradient gel electrophoresis, DGGE)和溫度梯度凝膠電泳(temperature gradient gel electrophoresis, TGGE)。DEEG可靠性高、重現(xiàn)性好、操作簡便、樣品分析量大,且可以實(shí)現(xiàn)微生物的時(shí)空變化檢測[92]。缺點(diǎn)是其僅能檢測環(huán)境中占總量1%以上的微生物[93],分離片段有長度限制[92],不同序列的DNA分離效果不佳[94-95],也不能區(qū)分微生物活性[96]。

3.2.2 多態(tài)性分析技術(shù)

限制性片段長度多態(tài)性分析(restriction fragment length polymorphisms, RFLP)是以分子雜交為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記,于1974年創(chuàng)立,被稱為第一代分子標(biāo)記技術(shù),優(yōu)點(diǎn)是帶型清楚[96]。單末端標(biāo)記限制性片段長度多態(tài)分析(T-RFLP)根據(jù)16S rRNA設(shè)計(jì)引物,在引物末端使用熒光標(biāo)記,其優(yōu)點(diǎn)在于結(jié)果更可靠、分析迅速、結(jié)果輸出形式便利[97]。單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析(single-strand conformation polymor-phism, SSCP)也是以PCR為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記技術(shù)[92],利用單鏈核酸因結(jié)構(gòu)和構(gòu)象不同在電泳中遷移速率不同做多態(tài)性分析。

指紋圖譜法常與基于PCR技術(shù)的方法聯(lián)合使用。國內(nèi)外學(xué)者應(yīng)用PCR-DGGE進(jìn)行微生物污染溯源[98-99]、群落結(jié)構(gòu)及多樣性變化分析[100-102]等方面的研究;利用疊氮溴化乙錠(EMA)-PCR方法檢測飲用水中食源性致病菌活菌[103]。SSCP可研究地表水水庫不同溫度中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和組成的季節(jié)動(dòng)態(tài)[104]。

3.3 基于HTS技術(shù)的方法

HTS技術(shù)也被稱為下一代測序技術(shù)(next generation sequencing, NGS)。與第一代DNA測序技術(shù)(sanger sequencing)相比,NGS技術(shù)大幅降低和縮短了測序的難度和時(shí)長,可大規(guī)模并行分析、通量高、成本低[105]。限制在于讀長短,不能超過500 bp。表3中對比了目前NGS 最具代表性的3個(gè)測序技術(shù)[105]。

表3 NGS技術(shù)對比Tab.3 Comparison of NGS Technologies

在實(shí)際應(yīng)用中,HTS技術(shù)常基于16S rRNA,或配合PCR技術(shù)應(yīng)用于水源水水質(zhì)對微生物群落的影響[107-108]和多樣性的檢測[106];研究工藝段細(xì)菌群落及對管網(wǎng)出水的影響[109-111];研究消毒劑對微生物群落的影響[112];研究供水管網(wǎng)中微生物特性[113]、生物膜種群結(jié)構(gòu)[114-116];研究不同水源和處理工藝對管網(wǎng)生物膜微生物群落的影響[117-118];研究不同水力水文條件(輸送距離[119]、水齡和管道材料[120-121]、水力狀況[122])對細(xì)菌群落的影響;對水源、工藝、管網(wǎng)的細(xì)菌群落進(jìn)行時(shí)空分布分析[123]和溯源追蹤[124];檢測水處理和管網(wǎng)中抗生素耐藥基因(ARGs)[125]。

4 檢測方法對比

上述3類檢測技術(shù)綜合對比如圖1所示,其中,深色單元格多代表該技術(shù)限制/不足較多,淺灰色單元格多代表該技術(shù)短板較少,DST、FCM、ATP和HTS是使用中各方面限制較少也較常用的檢測方法。

圖1 三大類檢測技術(shù)對比Fig.1 Comparison of Three Kinds of Detected Methods

日常檢測中,水廠需及時(shí)掌握各工藝流程微生物狀況或估算微生物再生能力時(shí),可選擇HPC、DST、FCM,其中DST和FCM對操作人員和環(huán)境的要求都不高,檢測速度快,且因DST特異性高,可以滿足重點(diǎn)關(guān)注致病菌和指示菌的檢測,與FCM配合可達(dá)到準(zhǔn)確量化的目的。應(yīng)對水質(zhì)突發(fā)污染事件檢測時(shí),可選擇FCM、PCR、ATP,其中ATP對不同水源識(shí)別和污染入侵敏感,可及時(shí)檢測到異常并發(fā)出預(yù)警,PCR配合ATP能定性分析污染來源和類別,協(xié)助制定解決方案。需監(jiān)測水處理工藝和管網(wǎng)中微生物穩(wěn)定性、開展水質(zhì)風(fēng)險(xiǎn)評估、研究可改進(jìn)工藝時(shí),可按需求和實(shí)際情況選擇多種檢測方法聯(lián)合進(jìn)行。

5 結(jié)論

(1) 各個(gè)檢測方法的特點(diǎn)和性質(zhì)決定其適用于不同檢測目的,應(yīng)用實(shí)際中較少出現(xiàn)單獨(dú)使用一種方法的情況,多采用不同方法相互配合。

(2) 隨著“智慧水務(wù)”概念的推廣實(shí)踐,越來越多基于實(shí)時(shí)、在線的計(jì)算機(jī)技術(shù)被引入水務(wù)行業(yè),水廠工藝和輸水管網(wǎng)微生物方面的智能化和自動(dòng)化管理也將得到更廣泛應(yīng)用。特別是HTS、快速檢測技術(shù)的發(fā)展,大量研究證實(shí)了其可靠性和準(zhǔn)確度,如何進(jìn)一步將這些技術(shù)發(fā)展和應(yīng)用,實(shí)現(xiàn)高效、實(shí)時(shí)、準(zhǔn)確地在線監(jiān)測和建立預(yù)警系統(tǒng)是下一步的研究方向。

(3)基于新技術(shù)在飲用水微生物方面的研究成果,在規(guī)劃水廠的建立和處理工藝時(shí),全流程微生物安全應(yīng)納入考慮,在水廠運(yùn)行制度中也需加入科學(xué)、精準(zhǔn)的微生物安全風(fēng)險(xiǎn)預(yù)警措施,提升水廠水質(zhì)生物安全保障能力。