加味丹玄口康對大鼠口腔黏膜下纖維化及其自噬水平的影響

賀 珺 張 婷 胡 亮 潘世杰 鄒 紅 連科荃 譚 勁 胡兆勇▲

1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖南長沙 410208；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院口腔科，湖南長沙 410007

口腔黏膜下纖維化（oral submucosal fibrosis，OSF）是常見的慢性口腔黏膜炎癥性疾病，為癌前病變之一，1.2%～23.0%的OSF 患者會(huì)發(fā)展為口腔鱗狀細(xì)胞癌，其主要病因是長期咀嚼檳榔[1-2]。近年來，隨著檳榔產(chǎn)業(yè)的急速擴(kuò)張和咀嚼檳榔流行范圍的迅速擴(kuò)大，OSF及其癌變患者的絕對數(shù)量劇增，并向低齡人群蔓延，成為嚴(yán)重的社會(huì)公共衛(wèi)生問題[3]。因此，探究OSF 的發(fā)病機(jī)制及尋找干預(yù)OSF 的有效方法具有重要意義。自噬是一種自我降解過程，指細(xì)胞利用溶酶體降解自身受損的細(xì)胞器和蛋白質(zhì)的生命現(xiàn)象[4-5]。自噬被認(rèn)為是細(xì)胞外基質(zhì)沉積、組織重塑和纖維形成的重要調(diào)節(jié)因子，在多種器官纖維化疾病中起著關(guān)鍵作用，參與肺、肝、腎纖維化等疾病[6-9]，且研究表明自噬可能與OSF 密切相關(guān)，但其具體作用仍有待進(jìn)一步闡明[10]。因此，本課題組對大鼠OSF 的自噬水平進(jìn)行探究。目前關(guān)于OSF 尚無標(biāo)準(zhǔn)化的治療方案[11]，本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，王宗康等[12]在古方桃紅四物湯基礎(chǔ)上加減的加味丹玄口康可有效干預(yù)OSF，阻礙OSF 發(fā)展及癌變，但關(guān)于加味丹玄口康是否通過調(diào)節(jié)自噬水平干預(yù)OSF 的研究尚少見報(bào)道。因此，本研究通過建立OSF 大鼠模型，探討加味丹玄口康干預(yù)OSF 是否與調(diào)控大鼠口腔黏膜的自噬程度有關(guān)，為臨床應(yīng)用加味丹玄口康治療OSF 提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選取SPF 級(jí)SD 雄性大鼠24 只，4～8周齡，體重180～200 g，由湖南中醫(yī)藥大學(xué)（以下簡稱“我校”）動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心統(tǒng)一訂購于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，并飼養(yǎng)于我校動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心無菌環(huán)境中，飼養(yǎng)溫度為20～24℃，濕度為55%～65%，予光照12 h/d，健康狀況良好，動(dòng)物許可證號(hào)為SCXK（湘）2019-0004，動(dòng)物檢疫合格，質(zhì)量合格證編號(hào)為43072722 1100100512。本研究由我校實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（LL2022011206）。

1.1.2 藥物與主要試劑 加味丹玄口康顆粒：丹參10 g（批號(hào)：2017003C），玄參10 g（批號(hào)：2108005C），生地黃10 g（批號(hào)：2108020S），白芍10 g（批號(hào)：2105009S），生黃芪10 g（批號(hào)：2102003C），當(dāng)歸10 g（批號(hào)：2106029C），紅花5 g（批號(hào)：2103003C），白花蛇舌草10 g（批號(hào)：2101001S），夏枯草10 g（批號(hào)：2109004S），茵陳10 g（批號(hào)：2108001C），薄荷10 g（批號(hào)：2102001C），桔梗10 g（批號(hào)：2107001S）均由湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院提供；檳榔堿（批號(hào)：DST DQ009201）由成都德斯特生物公司提供；上皮鈣黏素（批號(hào)：00092361）、微管相關(guān)蛋白輕鏈3Ⅰ/Ⅱ（light chain 3-Ⅰ/Ⅱ，LC3-Ⅰ/Ⅱ）一抗（批號(hào)：10021292）、選擇性自噬接頭蛋白p62 一抗（批號(hào)：00109471）由Proteintech 公司提供；細(xì)胞裂解液（批號(hào)：P0013）、山羊抗兔二抗（批號(hào)：ZK-0295G-SA）由Abiowell 公司提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 造模、給藥和取材 將24 只大鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分為空白組、模型組和加味丹玄口康組，每組8只。空白組不作干預(yù)，模型組和加味丹玄口康組建立OSF 模型：采用異氟烷麻醉大鼠，在大鼠雙側(cè)頰黏膜組織注射10 mg/ml 的檳榔堿0.2 ml，1 次/2 d，同時(shí)每日使用小牙刷沾取適量檳榔堿均勻施力刷大鼠雙側(cè)頰黏膜，持續(xù)8 周，觀察到大鼠頰黏膜出現(xiàn)白色病變等確認(rèn)造模成功[13-15]。前期研究表明，加味丹玄口康干預(yù)OSF 的有效劑量為8 ml/（kg·d），藥物濃度為0.23 g/ml[12]，造模成功后加味丹玄口康組給予該劑量加味丹玄口康灌胃，空白組和模型組每日給予等量生理鹽水，1 次/d，持續(xù)4 周。給藥結(jié)束后，使用2%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠，取大鼠雙側(cè)頰黏膜組織，保存于4%多聚甲醛溶液、戊二醛溶液，于-80℃冰箱中待用。

1.2.2 大鼠口腔黏膜組織病理學(xué)檢測 采用4%多聚甲醛溶液固定大鼠口腔黏膜組織、脫水、石蠟包埋、常規(guī)切片、烘干、再脫蠟，蘇木精-伊紅染色、Masson 染色后鏡下觀察三組口腔黏膜組織病理變化和膠原沉積情況。

1.2.3 透射電鏡觀察自噬小體 取大鼠頰黏膜組織，以2.5%戊二醛、25%鋨酸分別固定2 h 后，脫水、包埋、切片，65℃條件下各聚合48 h 以上、3%醋酸鈾-枸櫞酸鉛雙染色，透射電鏡下觀察自噬小體。

1.2.4 免疫組織化學(xué)染色檢測上皮鈣黏素、LC3 陽性表達(dá)細(xì)胞 將大鼠口腔黏膜石蠟切片烤片后，進(jìn)行梯度脫蠟，EDTA/檸檬酸鹽修復(fù)，滴加過氧化酶阻斷劑孵育10 min，PBS 洗滌后滴加5%BSA 封閉1 h，上皮鈣黏素一抗（1∶2 000）、LC3 一抗（1∶300）孵育過夜，經(jīng)PBS 洗滌，二抗孵育，滴加DAB 顯色液顯色，復(fù)染封片，顯微鏡下觀察，Image J 軟件對陽性信號(hào)定量分析。

1.2.5 Western blot 檢測上皮鈣黏素、LC3-Ⅱ、p62表達(dá) 剪取大鼠頰黏膜組織加入RIPA 裂解緩沖液和PMSF，冰上裂解、離心提取組織總蛋白，BCA 法檢測蛋白濃度，經(jīng)電泳分離后轉(zhuǎn)移到PVDF 膜，5%脫脂牛奶封閉2 h，TBST 洗滌后分別加入上皮鈣黏素（1∶5 000）、LC3-Ⅱ（1∶2 000）、p62（1∶2 000）、GAPDH（1∶10 000）相應(yīng)一抗溶液中孵育4℃過夜，洗滌，加入二抗（1∶15 000）室溫孵育2 h，TBST 洗滌后進(jìn)行顯影，凝膠圖像儀觀察并照相，Image J 軟件分析條帶灰度值。

1.2.6 RT-PCR 檢測LC3-Ⅱ、p62 mRNA 表達(dá) 提取組織中總RNA，測定樣本RNA 濃度，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，獲得模板cDNA，對目標(biāo)基因進(jìn)行擴(kuò)增，取2×Novo-ScriptPlus 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix 10 μl、gDNAPurge1μl、RNaseFreeWater 及模板RNA（0.1 ng～1.0 μg）配至20 μl，移液器輕輕混勻后短暫離心至離心管管底，反應(yīng)程序?yàn)?0℃反應(yīng)15 min、85℃反應(yīng)5 s。將合成的第一鏈cDNA 直接用于qPCR，2×NovoStartSYBR qPCR Super Mix Plus 10 μl，正向引物終濃度為0.2～1.0 μmol/L，反向引物終濃度為0.2～1.0 μmol/L，模板1～2 μl、ROX 0.4 μl，RNase Free Water 加至20 μl，兩步法擴(kuò)增程序，95℃1 min、35 次循環(huán)（95℃20 s，60℃1 min）。LC3-Ⅱ正向引物為5’-GATGTCCGACTTATTCGAGAGC-3’，片段長度為20 bp；反向引物為5’-TTGAGCTGTAAGCGCCTTCTA-3’，片段長度為22 bp。p62 正向引物為5’-ATCAGCTTCTGGTCCATCGG-3’，片段長度為20 bp；反向引物為5’-GCTTCTTTTCCCTGTGCT-3’，片段長度為20 bp。GAPDH 正向引物為5’-CAGGAGGCATTGCTGATGAT-3’，片段長度為20 bp；反向引物5’-GAAGGCTGGGGCTCATTT-3’，片段長度為20 bp。熒光定量PCR 儀檢測熒光信號(hào)，以GAPDH 作為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算目標(biāo)基因mRNA 相對表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較采用t 檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組口腔黏膜組織病理觀察

蘇木精-伊紅染色結(jié)果顯示，空白組口腔黏膜結(jié)構(gòu)正常；與空白組比較，模型組口腔黏膜上皮明顯萎縮，膠原纖維顯著變粗、增多，上皮釘突變平；加味丹玄口康組口腔黏膜上皮層較模型組增厚，膠原纖維減少。Masson 染色結(jié)果顯示，空白組口腔黏膜上皮結(jié)構(gòu)基本完整，膠原纖維沉積較少；與空白組比較，模型組大鼠口腔黏膜上皮萎縮，固有層內(nèi)大量膠原纖維沉積，血管和細(xì)胞成分減少，固有層下出現(xiàn)肌組織萎縮；與模型組比較，加味丹玄口康組口腔黏膜上皮層萎縮程度減輕，膠原纖維明顯減少。見圖1～2。

圖1 三組口腔黏膜組織蘇木精-伊紅染色（100×）

圖2 三組口腔黏膜組織Masson 染色（100×）

2.2 三組口腔黏膜組織自噬小體比較

模型組自噬小體數(shù)量低于空白組，加味丹玄口康組自噬小體數(shù)量高于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖3～4。

圖3 三組口腔黏膜組織自噬小體透射電鏡圖（整體：3 000×；局部：10 000×）

圖4 三組口腔黏膜組織自噬小體數(shù)量比較（n=8）

2.3 三組口腔黏膜組織上皮鈣黏素、LC3 陽性細(xì)胞數(shù)比較

圖5 三組口腔黏膜組織免疫組織化學(xué)染色（400×）

圖6 三組口腔黏膜組織上皮鈣黏素、LC3 陽性細(xì)胞數(shù)比較（n=8）

模型組上皮鈣黏素、LC3 陽性細(xì)胞數(shù)低于空白組，加味丹玄口康組上皮鈣黏素、LC3 陽性細(xì)胞數(shù)高于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖5～6。

2.4 三組口腔黏膜組織上皮鈣黏素、LC3-Ⅱ、p62 蛋白表達(dá)比較

模型組上皮鈣黏素、LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)低于空白組，p62 蛋白表達(dá)高于空白組，加味丹玄口康組上皮鈣黏素、LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)高于模型組，p62 蛋白表達(dá)低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖7。

圖7 三組口腔黏膜組織上皮鈣黏素、LC3-Ⅱ、p62 蛋白表達(dá)比較（n=8）

2.5 三組口腔黏膜組織LC3-Ⅱ、p62 mRNA 表達(dá)比較

模型組LC3-ⅡmRNA 表達(dá)低于空白組，p62 mRNA 表達(dá)高于空白組，加味丹玄口康組中LC3-ⅡmRNA 表達(dá)高于模型組，p62 mRNA 表達(dá)低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖8。

圖8 三組口腔黏膜組織LC3-Ⅱ、p62 mRNA 表達(dá)比較（n=8）

3 討論

自噬作為一種蛋白質(zhì)和細(xì)胞器降解的細(xì)胞途徑，與人類疾病有著密切聯(lián)系[16-17]。臨床一般認(rèn)為自噬是機(jī)體的防御機(jī)制之一，可清除細(xì)胞內(nèi)的有害物質(zhì)和衰老、損傷的細(xì)胞器，消耗自身成分產(chǎn)生脂肪酸、氨基酸等，為處于饑餓狀態(tài)的細(xì)胞提供能量，然而自噬也可能作為一種細(xì)胞死亡機(jī)制，通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期來抑制細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡，具有復(fù)雜的雙向作用[18-19]。LC3-Ⅱ可結(jié)合到胞內(nèi)自噬體的膜上，其含量的多少與自噬泡數(shù)量呈正相關(guān)，在發(fā)生自噬時(shí)，p62 所形成的復(fù)合物在自噬溶酶體內(nèi)被降解，因此組織整體的p62 水平與自噬水平呈負(fù)相關(guān)，這些蛋白可作為自噬水平的標(biāo)志物[20-21]。

近年來，越來越多的研究表明，自噬影響肺、腎、肝等多種器官纖維化的發(fā)生發(fā)展，調(diào)控自噬成為減輕器官纖維化的一個(gè)潛在治療靶點(diǎn)[7-9]。在肺纖維化患者組織中存在缺陷的自噬反應(yīng)，抑制肺泡上皮細(xì)胞中的自噬可促進(jìn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，從而促進(jìn)肺纖維化的發(fā)生[7]。在敲除自噬活性基因小鼠的腎纖維化研究中發(fā)現(xiàn)，下調(diào)自噬活性會(huì)導(dǎo)致阻塞腎臟的膠原沉積和成熟促纖維化因子水平增加，促進(jìn)自噬可減輕細(xì)胞衰老從而抑制腎纖維化[8]。在肝纖維化中，肝星狀細(xì)胞中的自噬可通過抑制纖維化細(xì)胞外囊泡的釋放來減輕肝纖維化，但是當(dāng)肝細(xì)胞過度自噬，如肝細(xì)胞發(fā)生自噬性細(xì)胞死亡和細(xì)胞焦亡，Hh 配體會(huì)被釋放，肝星狀細(xì)胞可能被Hh 信號(hào)激活，最終導(dǎo)致肝纖維化[9，22]。

OSF 研究中也存在相關(guān)報(bào)道，抑制自噬可改善由活性轉(zhuǎn)化生長因子β 受體Ⅰ型信號(hào)傳導(dǎo)誘導(dǎo)的纖維化，促進(jìn)成纖維細(xì)胞凋亡、抑制其增殖，在OSF 中起重要作用[10]。以上研究表明，自噬可能與OSF 的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。因此本研究通過建立OSF 大鼠模型，觀察大鼠OSF病變，檢測自噬相關(guān)表達(dá)因子來判斷OSF與自噬的關(guān)系。本研究結(jié)果顯示，與空白組比較，模型組口腔黏膜組織發(fā)生明顯病變，膠原纖維大量沉積；自噬小體數(shù)量減少，上皮鈣黏素、LC3-Ⅱ蛋白和LC3-ⅡmRNA 表達(dá)降低，p62 蛋白及其mRNA 表達(dá)升高，提示在OSF 大鼠口腔黏膜組織中自噬水平下降，自噬抑制可能在OSF 發(fā)生中具有一定作用，其具體機(jī)制有待進(jìn)一步探究。

從中醫(yī)辨證來看，OSF 多為嗜食辛辣刺激之品，濕熱邪毒郁積局部，日久邪氣由表及里，且自身正氣不足，致局部氣機(jī)不暢，血液運(yùn)行受阻，氣血瘀滯于口腔黏膜，加之邪毒蘊(yùn)結(jié)不散，化痰，毒、虛、瘀、痰互結(jié)而發(fā)病[23-24]。針對OSF 病機(jī)的加味丹玄口康由丹參、玄參、當(dāng)歸、紅花、生地、白花蛇舌草、夏枯草、生黃芪、薄荷、白芍等組成，其中丹參、當(dāng)歸、紅花有活血祛瘀、通經(jīng)止痛功效，白花蛇舌草、夏枯草有助于解毒散瘀，生黃芪、白芍可益氣扶正，全方具備扶正活血祛痰解毒功效，對OSF 具有較好的干預(yù)效果[25-27]。且研究表明，丹參、當(dāng)歸、紅花中的多種活性成分如丹酚酸A、當(dāng)歸多糖等在不同疾病中均可通過促進(jìn)自噬發(fā)揮保護(hù)作用，抑制疾病進(jìn)展[28-31]。在本研究中，對OSF 大鼠給予加味丹玄口康干預(yù)，結(jié)果顯示，與模型組比較，加味丹玄口康組口腔黏膜上皮層增厚，膠原纖維沉積明顯減少，自噬小體數(shù)量增多，上皮鈣黏素、LC3-Ⅱ蛋白和LC3-ⅡmRNA 表達(dá)升高，p62 蛋白及其mRNA表達(dá)降低，提示加味丹玄口康可改善OSF，可能通過升高自噬水平發(fā)揮抑制大鼠OSF 的作用。

綜上所述，OSF 大鼠口腔黏膜組織的自噬水平存在一定程度下降，加味丹玄口康可有效改善OSF，可能與升高自噬水平有關(guān)。然而本研究尚存在局限性，未完全明晰自噬在OSF 進(jìn)展的不同時(shí)期所發(fā)揮的具體作用機(jī)制，以及加味丹玄口康影響自噬水平的具體調(diào)節(jié)機(jī)制未知，未來還需進(jìn)行更多研究探討。