膝三針對膝骨關節炎模型大鼠軟骨形態學及行為學改變的影響

李仁重 孫 奎

1.安徽中醫藥大學第二臨床醫學院，安徽合肥 230061；2.安徽中醫藥大學第二附屬醫院 安徽省針灸醫院骨二科，安徽合肥 230061

膝骨關節炎（knee osteoarthritis，KOA）是一種慢性退行性關節疾病，涉及關節軟骨和滑膜關節周圍的組織，表現為疼痛、腫脹、僵硬和功能障礙，其發病與肥胖、性別、衰老等多種因素有關[1]。KOA 的患病率、致殘率高，60 歲以上人群的患病率可達50%，致殘率高達53%，降低了老年人的生活質量，同時增加了社會的經濟負擔[2]。目前西醫主要采用以減輕疼痛、消炎等控制癥狀為主的治療方法，長期服用西藥可能會帶來諸多不良反應，且無明顯的軟骨保護作用[3]。中醫治療KOA 具有效果全面和安全可靠的獨特優勢，而針刺又是中醫治療KOA 較為有效的方法之一，并以其療效顯著、操作簡便、經濟安全、防治結合而受到廣大患者的青睞[4]。本研究在前期工作的基礎上，觀察膝三針對KOA 模型大鼠行為學和軟骨組織的形態學的影響，為針刺治療該病提供依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

28 只3～4 周齡雄性SPF 級SD 大鼠，體重180～220 g[實驗動物合格證號：110322211102387552，生產許可證號：SCXK（京）2019-0008，北京華阜康生物科技股份有限公司]，室溫（20±1）℃、濕度（55±15）%、晝夜各12 h 更替、自由進食水適應性飼養3 d。采用隨機數字表法將其分為空白組、模型組各8 只，針刺組、西藥組各6 只?？瞻捉M和模型組各隨機取2 只用于模型驗證。實驗中對動物的處理符合中國科技部頒發的《關于善待實驗動物的指導性意見》（2021093001）。

1.2 試劑和儀器

主要試劑：雙氯芬酸二乙胺乳膠劑（批準文號：H19990291，北京諾華制藥有限公司）；無菌針灸針φ0.3 mm×40.0 mm（注冊證號：20172270468，北京珞亞山川醫療器械有限公司）；蘇木精染液（批號：ZLI-961，北京中杉金橋生物技術有限公司）；伊紅染色液（批號：G1100）、Scott 藍化液（批號：G1865）均來自Solarbio 公司；超凈高級封片膠（批號：YZB，BASO公司）。

主要儀器：ABM-100 型小動物麻醉（上海玉研科學儀器有限公司）；BYC-310 型藥品冷藏柜（山東博科生物技術有限公司）；CX43 型顯微鏡（OLYMPUS）；2235 型切片機（德國，Leica）；HGZF-101-1 型電熱鼓風干燥箱（上海躍進醫療器械有限公司）。

1.3 模型的建立

除空白組外，其他三組大鼠參照陳益丹等[5]前交叉韌帶橫斷術方法制備KOA 模型。4 周后大鼠的左側后肢出現了腫脹、屈伸功能障礙等現象。從空白組與模型組各隨機取2 只大鼠進行左膝關節X 線掃描。與空白組比較，若模型組左膝關節間隙明顯變窄，關節面變模糊，部分有融合及骨贅形成，提示造模成功。

1.4 干預方法

①空白組：常規飼養，不予任何干預。②模型組：造模后常規飼養，不予任何干預。③針刺組：造模5 周后進行大鼠左膝關節針刺干預，每天1 次，連續5 d 休息2 d，共治療3 周。操作：參照《實驗針灸學》[6]尋找大鼠左膝關節的內膝眼、犢鼻、鶴頂作為進針點。常規備皮消毒后，選用0.3 mm×40.0 mm 毫針，諸穴均直刺3～5 mm，針尖抵達軟骨表面，實際刺激其關節軟骨。使用平補平瀉捻轉手法（捻轉角度為90°～180°，速度為60～120 次/min）各30 s 后留針30 min，治療結束拔針并用無菌棉球按壓止血。④西藥組：為陽性對照組，左膝局部外搽雙氯芬酸二乙胺乳膠劑，與針刺治療同時進行。

1.5 觀察指標與檢測方法

①左膝關節X 線掃描：對空白組與模型組選出的大鼠進行麻醉，使用X 線成像系統對大鼠左膝關節進行掃描。②一般情況觀察及Lequesne MG 評分：治療前（4 周后驗證造模成功后）及治療后均由同1名不參與實驗的課題組成員進行評估。觀察各組大鼠的精神狀態、活動情況等，并用Lequesne MG 的膝關節評估方法[7]對大鼠膝關節局部反應（分為4 級）、步態改變（分為4 級）、關節活動范圍（分為4 級）及腫脹程度（分為3 級）進行評估，Lequesne MG 評分為4 個指標之和。癥狀越明顯，級別與分數越高。③膝關節軟骨大體觀察：術后8 周處死各組大鼠，取其膝關節處軟骨組織進行大體觀察。④蘇木精-伊紅染色法觀察大鼠膝關節軟骨細胞形態：將觀察后的大鼠膝關節軟骨組織用4%中性甲醛溶液固定，用濃度梯度醇脫水，用二甲苯透明，石蠟包埋，切片，顯微鏡下觀察。根據Mankin’s 評分[8]進行評估，評分越高提示軟骨破壞越嚴重。

1.6 統計學方法

采用SPSS 25.0 統計學軟件進行數據分析。符合正態分布的計量資料以均數±標準差（±s）表示，采用方差分析或t 檢驗。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 左膝關節X 線檢查結果

空白組大鼠關節間隙可見，未見骨贅形成，脛骨近端和股骨遠端骨結構均勻可見，未發現軟骨下硬化和骨囊腫。而模型組大鼠關節間隙變窄，脛骨平臺平面出現粗糙，股骨遠端出現硬化，有骨贅形成。兩組X線情況比較，提示造模成功。見圖1。

圖1 大鼠膝關節X 線情況比較

2.2 各組大鼠治療前后Lequesne MG 評分比較

治療前，模型組Lequesne MG 評分高于空白組（P＜0.05）；治療后，模型組的Lequesne MG 評分高于空白組（P＜0.05），而針刺組低于模型組（P＜0.05）。治療后，模型組、針刺組、西藥組Lequesne MG 評分低于治療前，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 各組大鼠治療前后Lequesne MG 評分比較（分，±s）

表1 各組大鼠治療前后Lequesne MG 評分比較（分，±s）

注與空白組同期比較，aP＜0.05；與模型組同期比較，bP＜0.05?！?”表示無數據。

2.3 膝關節軟骨大體觀察

肉眼可見空白組大鼠關節軟骨表面光滑呈淡藍色半透明狀，無裂紋及軟骨缺失，關節間隙未見狹窄，邊緣規整，未見明顯纖維化及裂紋形成，無軟骨下骨外露且無骨贅形成；模型組可見軟骨表面粗糙，灰暗失去光澤，關節間隙狹窄，有明顯纖維束狀改變，軟骨軟化和軟骨下骨外露現象，邊緣明顯骨贅形成；針刺組可見軟骨表面輕微粗糙，略暗淡有光澤，較平滑，有輕微軟骨軟化及軟骨剝脫現象。見圖2。

2.4 各組大鼠軟骨形態學比較

2.4.1 細胞形態比較 空白組大鼠膝關節軟骨表面光滑整齊，表層軟骨細胞平坦而小，數量較多，排列整齊，層次清晰，細胞核清晰可見，染色質分布均勻；模型組大鼠膝關節軟骨表面有較多裂隙，軟骨基質著色不均，軟骨面粗糙，表層和中間區域的軟骨細胞數量減少且排列紊亂，可見軟骨細胞增生與腫脹，細胞核皺縮，潮線模糊、斷裂；針刺組大鼠膝關節軟骨表面相對整齊，軟骨組織結構尚清晰可見，軟骨膜附近可見少量成軟骨細胞，軟骨細胞數量略有增加，排列較有序，潮線染色較淺，結構基本清晰。見圖3。

圖3 四組軟骨細胞蘇木精-伊紅染色比較（A、B、C、D：40×；E、F、G、H：200×）

2.4.2 軟骨組織病理Mankin’s 評分 與空白組比較，模型組評分明顯增高，差異有統計學意義（P＜0.05）；與模型組比較，針刺組評分明顯下降，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表2。

表2 各組大鼠關節軟骨Mankin’s 評分比較（分，±s）

表2 各組大鼠關節軟骨Mankin’s 評分比較（分，±s）

注 與空白組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05。

3 討論

KOA 是一種慢性退行性肌肉骨骼疾病，常因關節勞損、肥胖、機械創傷等多種因素引起。其特點是進行性軟骨侵蝕，軟骨下骨轉換和骨贅形成，以及關節內的其他病理改變[9-10]。中醫認為KOA 屬于“骨痹”范疇，《素問·長刺節論》曰：“病在骨，骨重不可舉，骨髓酸痛，寒氣至，名曰骨痹。”病因病機多因年老體衰，感受外邪、肝腎虧虛和痰濁瘀血，導致骨失滋養，進而出現筋骨關節及肌肉疼痛、麻木、屈伸不利等癥狀[11]。

目前KOA 主要以細胞因子、炎癥因子、基因表達、信號通路等方面的研究為主[12]。研究發現，KOA 的發生與內質網應激（endoplasmie retieulum stress，ERS）引起的軟骨細胞的凋亡有關[13]。ERS 通過激活未折疊蛋白反應（unfolded protein response，UPR）在軟骨細胞凋亡啟動的過程中起著重要的調控作用[14]。PERK 通路是UPR 的一種，在KOA 進展中，ERS 標志物PERK和CHOP 的表達水平增加；CHOP 可通過調節軟骨細胞凋亡，進而加速關節軟骨退變，損傷軟骨組織[15-16]。芮靖琳等[17]發現嚴重或長時間的ERS 將激活PERKCHOP 信號通路誘導細胞凋亡。KOA 的發生與軟骨細胞的凋亡關系密切，而抑制軟骨細胞凋亡則能夠有效地阻止KOA 的進展[18]。因此，對于PERK-CHOP 信號通路的調控與KOA 病程的發展密切相關。

由于西醫治療KOA 的局限性，故針對中醫藥治療KOA 的研究越來越多，中醫融合了多種治療方法，包括針刺[19]。目前，針刺已被廣泛接受為一種重要的主流補充和替代療法，改善膝關節功能，緩解疼痛，延緩關節退化，達到聯系臟腑、調整氣血、協調陰陽、扶正祛邪的目的，從而防止KOA 的發展[20]。膝三針是在長期臨床實踐基礎上，集歷代名醫的經驗總結出的針對膝關節疾病的療法，由內膝眼、犢鼻，陰陵泉、陽陵泉及血海、梁丘和鶴頂等穴位組成[21]。其中內膝眼、犢鼻和鶴頂是最常見的壓痛點，屬于局部取穴，體現了“腧穴所在，主治所及”的選穴原則，具有疏通氣血，祛風散寒，通利關節，除痹止痛之功效[22-23]。臨床實踐發現膝三針療法能直達膝關節病灶，產生較快的針刺止痛作用[24]。孫奎等[25]選取膝三針的穴位進行針刺，采用WOMAC 問卷、VAS、關節功能評分進行評估，得出了膝三針療法能較理想的改善膝關節疼痛、僵硬等癥狀，提高生活能力，防止病情復發。本研究以膝三針療法為切入點，觀察膝三針對KOA 模型大鼠膝關節軟骨形態學及行為學的影響。

本研究采用前交叉韌帶橫斷術建立大鼠KOA 模型，HE 染色可見空白組大鼠膝關節軟骨基質中軟骨細胞和分布均勻，有多個軟骨細胞，軟骨下有明顯潮紅；與空白組比較，模型組可見軟骨層變薄、軟骨表面缺損破壞，軟骨細胞較少，Mankin’s 評分明顯增加；與模型組比較，針刺組的軟骨層更厚，軟骨細胞更多，軟骨下的組織更清晰，Mankin’s 評分降低，提示針刺可以在一定程度上減少軟骨的退變，修復軟骨組織的損傷。治療后針刺組Lequesne MG 評分較模型組明顯下降，提示針刺能緩解KOA 的行為學惡化。

由大鼠模擬人類患KOA，如關節功能障礙、疼痛，并引起軟骨退化的病理改變，得出膝三針療法改善了KOA 大鼠的關節活動度與活動步態，有效地減輕了關節痛、功能障礙、變形等，抑制軟骨細胞退變，保護了關節軟骨，從而達到有效治療KOA 的作用。膝三針療法調控PERK-CHOP 信號通路是減少軟骨退變、修復軟骨組織損傷的可能機制，為進一步的機制研究提供方向。