參芪解郁方對(duì)產(chǎn)后抑郁大鼠炎癥反應(yīng)的抑制作用

李凈婭 秋 超 張麗萍

浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院 浙江省中醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，浙江杭州 310000

產(chǎn)后抑郁（postpartum Depression，PPD）是產(chǎn)褥期常見的精神疾患，嚴(yán)重危害產(chǎn)婦的身心健康，其發(fā)病機(jī)制目前仍不明確。參芪解郁方是治療輕型PPD 的有效方劑[1]，前期研究證實(shí)其可改善PPD 模型大鼠的行為學(xué)表現(xiàn)[2]，作用機(jī)制涉及整體調(diào)節(jié)大鼠的下丘腦-垂體-腎上腺軸和下丘腦-垂體-性腺軸的激素分泌及其受體表達(dá)[3-4]。近幾年研究發(fā)現(xiàn)，該方可保護(hù)PPD大鼠的免疫器官并可調(diào)節(jié)大鼠外周血T 細(xì)胞比例[5-7]。近期多項(xiàng)研究證實(shí)，炎癥反應(yīng)激活與抑郁癥的發(fā)病密切相關(guān)[8-11]，課題組也發(fā)現(xiàn)參芪解郁方可下調(diào)PPD 大鼠體內(nèi)的白細(xì)胞介素-1 和白細(xì)胞介素-6 水平[12]，但其抑炎機(jī)制不明確，研究還不夠深入。

因此，本研究擬將研究靶點(diǎn)定位于大鼠前額葉小膠質(zhì)細(xì)胞以進(jìn)一步觀察參芪解郁方對(duì)PPD 的炎癥抑制作用，探索該方的抑炎機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康SD 雌性大鼠24 只，SPF 級(jí)，2 月齡，體重（200±10）g。購于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為[SCXK（滬）2017-0005]，使用許可證號(hào)為[SYXK（浙）2020-0024]。實(shí)驗(yàn)中動(dòng)物自由攝食飲水，自然光照，光照周期12 h（7∶00～19∶00），室溫20～22℃，相對(duì)濕度為60%～70%，室內(nèi)保持安靜。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)符合浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)要求，并通過杭州鷹旸生物醫(yī)藥研發(fā)中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（EYOUNG-20201117-12）。

1.2 主要儀器、試劑與藥品

1.2.1 主要儀器 加熱石蠟包埋系統(tǒng)（Leica，型號(hào)：G1150H）；正置熒光顯微鏡（Leica，型號(hào)：DM3000）；成像系統(tǒng)（日本尼康，型號(hào)：Nikon DS-U3）；酶標(biāo)儀（MD，型號(hào)：C MaxPlus）。

1.2.2 主要試劑AIF1/IBA Antibody（維百奧生物科技有限公司，江蘇，批號(hào)：DF7552）；山羊抗兔IgG Hand＆L（HRP）預(yù)吸附二抗（美國Abcam Co.，Ltd.，批號(hào)：ab97080）；大鼠腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒（江蘇酶免實(shí)業(yè)有限公司，批號(hào)：MM-0180R1）；大鼠皮質(zhì)醇（Cortisol，Cor）ELISA試劑盒（江蘇酶免實(shí)業(yè)有限公司，批號(hào)：MM-0574R1）。

1.2.3 藥品 苯甲酸雌二醇注射液（批號(hào)：190504，規(guī)格：2 ml∶4 mg×10 支），黃體酮注射液（批號(hào)：190509，規(guī)格：1 ml∶50 mg×10 支），購自上海全宇生物科技動(dòng)物藥業(yè)有限公司；參芪解郁方（藥物保密），飲片配方顆粒來源于華潤三九有限公司，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院最終加工制成該方藥顆粒劑；鹽酸帕羅西汀膠囊（北京福元醫(yī)藥股份有限公司，批號(hào)：22005122，規(guī)格：20 mg×20 片）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 分組與處理24 只大鼠先適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，以隨機(jī)數(shù)字表法將其分為4 組（每組6只大鼠）：假手術(shù)組、PPD 模型組、參芪解郁方組和西藥對(duì)照組。

1.3.2 模型建立 參照既往文獻(xiàn)[2，6，7，13]采用激素模擬妊娠狀態(tài)后突然停撤法建立PPD 大鼠模型。

摘除3 組大鼠（PPD 模型組、參芪解郁方組和西藥對(duì)照組）雙側(cè)輸卵管及卵巢，連續(xù)5 d 美蘭染色的陰道涂片提示無動(dòng)情周期表示去勢(shì)手術(shù)成功。假手術(shù)組僅摘取卵巢周圍少許脂肪組織，保留卵巢和輸卵管完整。

對(duì)已摘除卵巢的3 組大鼠，連續(xù)16 d 每日皮下注射溶于0.1 ml 甘油的雌二醇注射液（2.5 μg）和0.1 ml黃體酮注射液（5 mg），后7 d 每日僅注射溶于0.1 ml甘油的雌二醇注射液50 μg，以模擬大鼠“妊娠”狀態(tài)下的激素分泌水平，第24 天（即“產(chǎn)后”第2 天）停止激素注射。假手術(shù)組動(dòng)物連續(xù)每日注射相同劑量的甘油（前16 d 0.2 ml，后7 d 0.1 ml）。行為學(xué)曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)（水平格數(shù)和站立次數(shù)）評(píng)分下降，提示模型制備成功。

1.3.3 藥物干預(yù) 參芪解郁方組：對(duì)造模后的大鼠連續(xù)3 周灌胃給予溶于蒸餾水的參芪解郁方顆粒劑。其用量參照既往文獻(xiàn)[2，6-7]，濃度1.25 g 生藥/ml，灌胃劑量均為1 ml/100 g；西藥對(duì)照組：對(duì)造模后大鼠連續(xù)3周灌胃給予溶于蒸餾水的經(jīng)典抗抑郁藥物——鹽酸帕羅西汀。其用量參照既往文獻(xiàn)[2，6-7]，濃度為0.25 mg/ml，灌胃劑量均為1 ml/100 g；假手術(shù)組及PPD 模型組大鼠則連續(xù)3 周灌胃給予2 ml 蒸餾水。

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1 行為學(xué)測(cè)試 對(duì)灌胃3 周后大鼠行曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)。場(chǎng)箱（80 cm×80 cm×40 cm）底面用黑線均勻劃分為25塊方格。每只動(dòng)物測(cè)定1 次，5 min/次，記錄大鼠水平格數(shù)（大鼠穿越過的格子數(shù)）及站立次數(shù)。

1.4.2 采用ELISA 檢測(cè)大鼠前額葉TNF-α、皮質(zhì)醇Cor 水平 藥物干預(yù)3 周并行為學(xué)檢測(cè)后，取大鼠左側(cè)前額葉腦組織，每組6 只。將前額葉腦組織充分勻漿后提取腦組織蛋白后，根據(jù)ELISA 步驟說明檢測(cè)TNF-α 和Cor 水平。

1.4.3 采用免疫組織化學(xué)染色法測(cè)定大鼠前額葉小膠質(zhì)標(biāo)志性抗體Iba1 取材后選取大鼠右側(cè)背外側(cè)前額葉，放入10%中性甲醛中固定24 h 后，經(jīng)石蠟包埋切片、梯度二甲苯及梯度酒精脫蠟處理。經(jīng)微波加熱法抗原修復(fù)（0.1 mol/L，pH=6.0 的枸櫞酸液修復(fù)液，微波爐100 火力3 min，50 火力7 min）后進(jìn)行免疫雜交（一抗AIF1/Iba1 Antibody 1∶50，二抗工作液1∶50）后DAB 顯色劑顯色，再進(jìn)行蘇木精復(fù)染，脫水，透明并中性樹膠封片。每組選取3 張額葉切片，每個(gè)切片200 倍高倍鏡顯微鏡下隨機(jī)選取2 個(gè)視野，每組6 個(gè)視野，采用Image Pro Plus 進(jìn)行圖像分析，測(cè)定陽性區(qū)域的平均光密度（aerosol optical depth，AOD）。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 23.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t 檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)情況比較

PPD 模型組水平格數(shù)和站立次數(shù)低于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；參芪解郁方組大鼠水平格數(shù)和站立次數(shù)高于PPD 模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

表1 各組大鼠曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)情況（±s）

注 與假手術(shù)組比較，aP＜0.05；與PPD 模型組比較，bP＜0.05。PPD：產(chǎn)后抑郁。

2.2 各組大鼠前額葉中TNF-α、Cor 及Iba1 的表達(dá)

PPD 模型組TNF-α、Cor 及Iba1 指標(biāo)高于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；參芪解郁方組的TNF-α、Cor 及Iba1 指標(biāo)低于PPD 模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表2～3、圖1。

表2 各組大鼠前額葉中TNF-α 和Cor 的表達(dá)（pg/ml，±s）

表2 各組大鼠前額葉中TNF-α 和Cor 的表達(dá)（pg/ml，±s）

注 與假手術(shù)組比較，aP＜0.05；與PPD 模型組比較，bP＜0.05。PPD：產(chǎn)后抑郁；Cor：皮質(zhì)醇；TNF-α：腫瘤壞死因子-α。

表3 各組大鼠前額葉中Iba1 的表達(dá)（±s）

表3 各組大鼠前額葉中Iba1 的表達(dá)（±s）

注 與假手術(shù)組比較，aP＜0.05；與PPD 模型組比較，bP＜0.05。PPD：產(chǎn)后抑郁；AOD：陽性區(qū)域的平均光密度。

3 討論

本研究結(jié)果提示，參芪解郁方能改善PPD 大鼠的行為學(xué)表現(xiàn)。參芪解郁方是在歸脾湯的基礎(chǔ)上加減而來，全方由黃芪、黨參、當(dāng)歸、炒棗仁、山萸肉、郁金、陳皮、佛手等組成，諸藥配伍共奏補(bǔ)益心脾，頤腦醒神之功，對(duì)于輕型產(chǎn)后抑郁有顯著效果[1]。

本研究結(jié)果提示，參芪解郁方可抑制PPD 大鼠前額葉小膠質(zhì)細(xì)胞的表達(dá)，降低炎癥細(xì)胞因子及Cor 的水平。有研究顯示，抑郁癥患者前額葉存在結(jié)構(gòu)受損及5-羥色胺、Cor 等腦源性神經(jīng)影響因子改變[14-17]，從而引起注意、記憶及情緒控制和交接的失常[18-19]，前額葉損傷可引起抑郁[20]，通過針對(duì)前額葉的經(jīng)顱磁刺激治療可提高抑郁癥患者情緒調(diào)節(jié)能力[21]。結(jié)合以往研究結(jié)果提示，前額葉小膠質(zhì)細(xì)胞可能是參芪解郁方的抗抑郁作用位點(diǎn)。

另外，既往研究發(fā)現(xiàn)動(dòng)物腦內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞的活化伴隨著白細(xì)胞介素-1β 水平的增加導(dǎo)致了其抑郁行為[22]，通過抑制炎癥細(xì)胞因子來調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞的激活可以產(chǎn)生抗抑郁作用[23]。Cor 是一種為應(yīng)對(duì)壓力而產(chǎn)生的類固醇激素，有臨床研究發(fā)現(xiàn)，日間Cor 節(jié)律紊亂及高炎癥水平可能是抑郁癥軀體癥狀產(chǎn)生的神經(jīng)生物學(xué)基礎(chǔ)[24]。還有實(shí)驗(yàn)研究顯示，過量的Cor 激活了動(dòng)物腦內(nèi)的膠質(zhì)細(xì)胞，增加了神經(jīng)炎癥[25]。

研究結(jié)果提示，參芪解郁方可能通過抑制產(chǎn)后抑郁大鼠前額葉的Cor 水平，抑制炎癥反應(yīng)及小膠質(zhì)細(xì)胞增生產(chǎn)生抗抑郁作用。本研究僅為初步的探索性研究，下一步需要更為深入、多靶點(diǎn)、多層面的研究來探討參芪解郁方對(duì)于產(chǎn)后抑郁的抑炎作用機(jī)制。