Hedgehog信號通路在肝細胞癌發生發展中作用的研究進展

韋麗軍，潘麗英，黃贊松，鐘國強，林巖

1 右江民族醫學院附屬醫院消化內科 廣西肝膽疾病臨床醫學研究中心，廣西百色533000；2 右江民族醫學院研究生學院

肝癌是全球第六大常見癌癥和第三大癌癥死亡原因。肝細胞癌（HCC）是肝癌最常見的病理類型，占75%～85%［1］。HCC起病隱匿，早期癥狀不典型，大多數患者確診時已處于中晚期，通常失去了手術治療的機會，只能采取姑息性治療，但其長期療效并不能令人滿意［2］。迄今為止，HCC發病的機制分子仍不十分清楚，普遍認為與多種信號通路的異常激活或抑制有關［3-5］，如MAPK、Notch、Wnt、PI3K/AKT/mTOR、Hedgehog等信號通路。以往對于Hedgehog信號通路的研究較少，近年隨著研究不斷深入，Hedgehog信號通路在HCC中的作用逐漸被揭示。Hedgehog基因最初在果蠅的突變基因篩選中被發現，其在進化上高度保守。Hedgehog信號通路是胚胎發育分化所必需的，在胚胎發育早期處于激活狀態，但當組織器官發育成熟后，該信號通路從激活狀態逐漸轉變為失活狀態［6］。近年研究發現，在多種惡性腫瘤中Hedgehog信號通路異常激活，其異常激活能夠促進腫瘤細胞的增殖、侵襲、遷移和多藥耐藥［7］。邵香香等［8］研究認為，Hedgehog信號通路激活是胚胎肝細胞分化、增殖和極性所必需的，并在HCC的發生、發展中發揮重要作用。本文結合文獻就Hedgehog信號通路在HCC發生、發展中作用的研究進展作一綜述。

1.edgehog信號通路概述

1.1.edgehog信號通路組成 Hedgehog基因最初是在篩選果蠅的突變基因時被發現的，該基因突變會導致果蠅胚胎呈多刺小球狀，如同刺猬一般，故名“Hedgehog”［9］。Hedgehog信號通路是胚胎發育分化的重要通路［9］，主要由分泌型糖蛋白配體Hh、跨膜蛋白受體Ptch、跨膜蛋白Smo、核轉錄因子Gli、類運動蛋白Cos2、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶Fu和抑制因子Sufu等組成。目前，在哺乳動物中發現了3種Hedgehog同源基因，分別為SHH、IHH、DHH。這些同源基因雖然生理作用相似，但在胚胎發育分化中的作用不同。SHH可參與胚胎器官發育，如大腦、脊柱、中軸骨骼和四肢的形成等；IHH對軟骨生長板發育和調節至關重要；DHH主要負責雄性性腺分化和神經外膜發育［10］。SHH是目前研究最深入的配體，作為細胞間的信號因子，可通過自分泌或旁分泌機制調控細胞命運。

1.2.edgehog信號通路功能 在Hh缺失的情況下，Ptch可抑制Smo活性，從而抑制下游信號通路，這時信號通路下游的Gli與胞質蛋白結合，阻止Gli進入細胞核，從而抑制下游靶基因的轉錄。當Hedgehog信號通路活化后，Hh與Ptch結合導致Ptch失活并解除對Smo的抑制作用，活化的Smo將Hedgehog激活信號傳遞到細胞質中，最終通過Sufu將Gli從細胞質中釋放出來，從而使Gli轉運到細胞核，通過結合轉錄靶點而調節靶基因的表達。Ptch作為一種12次跨膜蛋白，既是Hh配體的受體，也是Smo的阻遏物。在哺乳動物中有兩種Ptch的同源物，即Ptch1、Ptch2。Smo是一種與G蛋白偶聯受體同源的7次跨膜蛋白，也是Hedgehog信號傳遞所必需的受體，通常被Ptch抑制。Gli家族是一類多功能轉錄因子，屬于C2 H2型鋅指結構蛋白。在Hedgehog信號通路中，Gli1作為轉錄激活因子，而Gli2、Gli3既可作為轉錄激活因子又可作為轉錄抑制因子［11］。Gli是Hedgehog信號通路末端的核執行因子，負責調控下游靶基因。Sufu是Hedgehog信號通路的負性調節因子，通過與Gli結合，阻止Gli進入細胞核，也可在細胞核內輔助其他蛋白抑制Gli活性，從而負反饋調控Hedgehog信號通路。參與Hedgehog信號轉導的核內因子包括Ci/Gli、Fu、Sufu、Cos2、蛋白激酶A（PKA）等。其中，Hh、Smo、Ci/Gli、Fu起正調控作用，Ptch、Cos2、PKA起負調控作用。

Hedgehog信號通路在人體各種組織中廣泛存在，但該信號通路激活受到嚴格調控，通過正負反饋調節靶基因的表達，從而形成復雜的調控網絡。在腫瘤的發生、發展中，Hedgehog信號通路的激活途徑有經典型和非經典型兩種。經典型Hedgehog信號通路包括Hh配體（SHH、IHH、DHH）、Ptch受體（Ptch1、Ptch2）、Smo受體、Sufu和Gli轉錄因子（Gli1、Gli2、Gli3）。Hedgehog信號傳遞受靶細胞膜上Ptch、Smo兩種受體控制。在無Hh配體和Ptch受體的情況下，Smo激活可導致Hedgehog靶基因的活化；Smo基因突變時，可出現與Hh基因突變相同的表征。在Hedgehog信號通路存在的情況下，Hh與Ptch結合導致Ptch失活并解除對Smo的抑制作用，具有活性的Smo將Hedgehog激活信號傳遞到細胞質中，最終通過Sufu將Gli從細胞質中釋放出來，從而使Gli轉運到細胞核，通過結合轉錄靶點而調節靶基因的表達。相反，在缺乏Hh配體的情況下，Ptch抑制Smo從而導致下游基因的失活。非經典型Hedgehog信號通路分為三種類型：Ⅰ型是Ptch介導的Hedgehog信號通路，不依賴于下游Smo/Gli，進一步又分為兩個亞型：ⅠA和ⅠB型，其中ⅠA型是Ptch介導的不依賴于下游Smo/Gli的細胞凋亡、ⅠB型是一種Ptch介導的不依賴于Smo/Gli的細胞周期調控；Ⅱ型是Smo介導的Hedgehog信號通路；Ⅲ型是Gli介導Hedgehog信號通路，不依賴于Gli的任何上游信號。目前，對于非經典型Hedgehog信號通路的作用機制仍不十分清楚。事實上，非經典型Hedgehog信號通路似乎是經典型Hedgehog信號通路不起作用時的一條備用通路。此外，非經典型Hedgehog信號通路似乎是細胞毒性或炎癥應激下機體利用的一種逃逸方式［11］。

2.edgehog信號通路在HCC發生、發展中的作用

Hedgehog信號通路在正常細胞的生長、分化中發揮關鍵調控作用，一旦某一基因成分發生突變或異常，Hedgehog信號通路就會被激活。當Hedgehog信號通路激活時，Hh與Ptch結合解除了Ptch對Smo的抑制作用，Smo進入細胞質并激活下游轉錄因子Gli，從而誘導目的基因的表達，進而調控細胞生長、增殖和分化。在成人健康肝細胞中幾乎不表達Hh配體，而在酒精中毒、脂肪變性、膽汁淤積或病毒感染等慢性損傷時，肝細胞會產生Hh配體激活Hedgehog信號通路。SICKLICK等［12］研究表明，與非腫瘤細胞相比，腫瘤細胞Smo過表達并激活了Hedgehog信號通路。國內羅小軍等［13］研究發現，SHH和Gli2在HCC細胞系（HepG2、Huh7）和HCC組織中高表達。這些研究結果證實，Hedgehog信號通路激活能夠參與HCC的發生、發展。

2.1.控腫瘤細胞增殖 惡性增殖是腫瘤細胞的特征之一。在脊椎動物中，SHH與Ptch1結合解除了對信號轉導蛋白和Smo的抑制作用，然后傳遞Hedgehog信號以激活下游蛋白，誘導目的基因的表達。Gli2不僅能調節與細胞增殖直接相關的基因轉錄，如MYC、CCND1/2、CCNB1和CCNE，還能調節編碼轉錄因子的基因表達，如FOXM1。FOXM1可調節細胞周期蛋白表達。TPX2是一種促癌基因，是FOXM1的直接下游靶點。WANG等［14］研究報道，抑制Hedgehog信號通路可下調TPX2表達，從而減輕SHH誘導的HCC細胞增殖；敲低FOXM1，TPX2表達會降低，HCC細胞生長受到抑制。由此推測，FOXM1可能通過靶向調控TPX2表達驅動HCC細胞增殖。此外，有研究發現，通過選擇性Smo抑制劑抑制Hedgehog信號通路，可誘導DNA合成減少，顯著降低HCC細胞的增殖、侵襲和遷移，并且其抑制作用呈劑量和時間依賴性［15］。

在我國，乙型肝炎病毒（HBV）感染是導致HCC發生的主要原因。HBV X基因編碼的HBx蛋白在HBV相關HCC中發揮重要作用。作為一種多功能的反式激活蛋白，HBx不僅可改變抑癌基因的表型而介導HCC細胞形成，還可促進HCC細胞增殖并抑制其凋亡［16］。已有研究證實，HBx不僅能誘導SHH、Ptch1和Gli2產生，還能直接與Gli1作用，增加Hh靶基因的反式激活，從而促進HCC的發生、發展［17］。研究表明，表達HBx蛋白的轉基因（HBxTg）小鼠在5～6月齡時出現肝炎和脂肪變性，8～9月齡時出現增生性結節，12月齡時100%出現HCC［18］。隨著鼠齡增長，HBxTg小鼠HBx、Gli2、SHH表達均有所增加。HBxTg小鼠經Smo抑制劑Vismodegib（GDC-0449）治療后Gli2、SHH表達下調，腫瘤生長明顯受到抑制［18］。

越來越多證據表明，非編碼RNA與HCC的發生、發展密切相關，如miRNA、circRNA［19］。LI等［20］研究報道，上調miR-132表達可抑制SHH表達，從而抑制HCC細胞增殖并誘導其凋亡。除此之外，circ-0036412被發現可通過Hedgehog信號通路促進HCC細胞增殖并阻遏細胞周期進程［21］。以上研究表明，Hedgehog信號通路可通過多種機制調控HCC細胞的增殖、凋亡、遷移等生物學過程。

2.2.控腫瘤細胞侵襲和遷移 惡性腫瘤具有侵襲性和轉移性特征。上皮間質轉化（EMT）在惡性腫瘤細胞的黏附、侵襲和遷移中具有重要作用。EMT的重要特征是上皮標志物（如E-cadherin）表達降低或缺失和間充質標志物（如N-cadherin、Vimentin、波形蛋白）表達增加。有研究表明，CCL2可通過激活Hedgehog信號通路誘導HCC細胞侵襲和EMT。HCC細胞經Smo抑制劑處理，E-cadherin表達上調，Snail、Vimentin表達下調，從而降低了HCC細胞的侵襲能力；Gli1下調可阻斷CCL2誘導的Snail、Vimentin表達上調和E-cadherin表達下調［22］。許秋然等［23］研究亦發現，Gli1表達與Vimentin表達呈正相關關系，與E-cadherin表達呈負相關關系，表明Hedgehog信號通路可誘導與HCC細胞侵襲和遷移相關的EMT過程。Snail是一種編碼具有鋅指結構的轉錄因子，參與多種腫瘤細胞EMT后獲得侵襲和遷移能力。YANG等［24］研究發現，Snail不僅可通過下調E-cadherin表達降低細胞黏附力，還可通過上調MMP-2、MMP-9表達誘發HCC細胞EMT并促進其侵襲和遷移。MMPs屬于鋅依賴性內肽酶家族，幾乎能降解所有的細胞外基質成分，在惡性腫瘤的侵襲和轉移中發揮重要作用。有研究報道，SHH信號可通過激活PI3K/AKT、FAK/AKT信號通路上調MMP-2、MMP-9表達，誘導HCC細胞的侵襲和遷移［25］。Hedgehog信號通路能夠促進腫瘤細胞EMT表型和上調MMPs表達，從而促進腫瘤細胞的侵襲和遷移。

2.3.控腫瘤細胞自噬 自噬是一種保守的分解代謝過程，負責清除受損的細胞器或錯誤折疊的蛋白質，以維持細胞內穩態。自噬功能障礙與多種疾病密切相關，尤其是在惡性腫瘤發生、發展和治療耐藥中具有關鍵作用。有研究報道，與正常肝組織相比，HCC組織自噬程度增強；此外，HCC細胞對周圍組織的侵襲與其細胞內更高水平的自噬程度有關［26］。有研究報道，在肝星狀細胞LX-2中，Gli抑制劑GANT61抑制Hedgehog信號通路可誘導自噬，除可減輕肝纖維化外，還可改善肺和腎纖維化；除此之外，GANT61激活自噬可誘導細胞凋亡并抑制其增殖［27］。LIU等［28］研究發現，抑制Hedgehog信號傳導可誘導肝星狀細胞自噬。Smo抑制劑環巴胺或Ptch1/Gli1 siRNA抑制Hedgehog信號通路可誘導自噬增強。而嘌呤胺刺激Hedgehog信號通路可降低自噬，證實Hedgehog信號通路對肝星狀細胞自噬具有負性調控作用。WANG等［29］研究證實，GANT61通過抑制Hedgehog信號通路誘導自噬增強，而Hh配體或Hh激動劑通過激活Hedgehog信號通路而阻止其誘導自噬增強。抑制GANT61誘導的自噬可阻礙GANT61誘導的細胞凋亡、細胞毒性和腫瘤抑制作用，表明GANT61誘導的自噬對HCC細胞具有殺傷作用。此外，使用GANT61處理癌細胞發現，Gli1、Gli2和Ptch1 mRNA表達降低，并且其效果與劑量有關，Hedgehog信號的阻斷抑制了癌細胞的惡性增殖和克隆形成［30］。SQSTM1是一種致癌基因，其編碼蛋白為p62。p62是一種多功能蛋白，可作為蛋白接頭誘導自噬進而導致特定靶蛋白降解。GANT61或環巴胺可誘導SQSTM1/p62、LC3-Ⅱ積累，LC3-Ⅱ是自噬標志物之一，但Hh抑制劑不會影響自噬相關基因的表達；Hh激動劑通過激活Hedgehog信號通路降低自噬程度，從而抑制HCC細胞的增殖［30］。這表明Hedgehog信號通路可通過調節自噬活性，調控HCC細胞的增殖和凋亡。

2.4.響腫瘤微環境（TME） TME是腫瘤細胞存在的周圍微環境，在腫瘤發生、發展中發揮重要的調控作用。腫瘤相關巨噬細胞（TAMs）是TME的重要組成部分，常被認為是腫瘤預后不良的生物標志物。TAMs有兩種激活亞型：經典型（M1型）和替代型（M2型）。M1型激活可產生多種促炎癥細胞因子，在病原菌耐藥和腫瘤控制中發揮重要作用。M2型激活可釋放大量免疫抑制性細胞因子，從而促進免疫抑制和腫瘤進展，并導致化療耐藥。TAMs常見于HCC間質中，能夠極化為M2樣表型。M2樣TAMs在HCC中發揮免疫抑制作用，可促進腫瘤細胞的增殖、侵襲、遷移等生物學過程［31］。Hedgehog信號傳導可促進TAMs產生，從而導致免疫抑制。骨髓中的Smo不僅是HCC生長所必需的，也是M2極化所必須的，在HCC發生、發展中起重要作用［32］。缺氧通過將TAMs極化為M2表型，從而促進HCC細胞增殖并刺激腫瘤血管生成。缺氧還可激活HIF-1，而HIF-1可促進腫瘤血管生成、免疫逃逸等。有研究發現，在HCC組織中HIF-1α表達與Gli表達呈正相關關系，缺氧能夠顯著促進HCC細胞EMT，其機制與激活非經典型Hedgehog信號通路有關［33］。敲低HIF-1α表達可抑制缺氧誘導的Smo、Gli1表達，從而抑制HCC細胞EMT。使用Smo抑制劑或Gli1 siRNA可逆轉缺氧條件下HCC細胞EMT［34］。激活Hedgehog信號通路能夠影響TME，從而在HCC細胞的增殖、侵襲、遷移以及腫瘤血管生成中起關鍵作用。因此，進一步探索TME將為針對HCC的免疫治療或靶向治療提供新的方向。

3.edgehog信號通路在HCC治療中的作用

越來越多證據表明，Hedgehog信號通路與HCC的發生、發展有關。因此，調控Hedgehog信號通路中的受體或轉錄因子有可能成為靶向治療HCC的潛在策略。目前，Smo受體及其下游轉錄因子Gli已經作為靶點被用于抗HCC藥物研發。天然抑制劑環巴胺可通過抑制Smo來阻斷Hedgehog信號通路。有研究報道，環巴胺能夠促進HCC細胞的凋亡，并抑制其生長和增殖［35］。與單純放療相比，環巴胺聯合放療能夠明顯縮小腫瘤體積［36］。因此，使用SHH抑制劑聯合放療可能會增加HCC細胞對放療的敏感性。目前，靶向Smo受體的藥物已被美國FDA批準用于治療胰腺癌、乳腺癌、結腸癌等，如Vismodegib（GDC-0449）、Sonidegib（NVP-LDE225）和Saridegib（IPI-926）［17］。既往研究發現，環巴胺和Vismodegib均能抑制HCC生長［36］。GANT61是Gli的選擇性抑制劑，能夠顯著抑制HCC細胞的增殖。在移植Huh7細胞的HCC異種移植模型中，GANT61能夠抑制腫瘤形成和生長［37］。以上研究均提示，針對Hedgehog信號通路的靶向治療有可能成為HCC新的治療策略。

綜上所述，Hedgehog信號通路是一條非常經典的細胞信號傳導通路，在胚胎發育和組織維持、更新、再生過程中發揮關鍵作用；在HCC中Hedgehog信號通路異常激活，其異常激活可通過調控腫瘤細胞的增殖、侵襲和遷移等生物學行為，從而促進腫瘤的發生、發展，并且針對Hedgehog信號通路的靶向治療有可能成為HCC新的治療策略。