基于Wnt/β-catenin信號通路探討骨補丸延緩老年膝骨關節炎軟骨退變機制

包杭生 關宏剛 梁鈺英 馮宗權 劉偉明 陳國濤 周活龍 王鼎 鄒勇根

(佛山市中醫院骨傷科,廣東 佛山 528000)

膝骨關節炎(KOA)在老齡人群中具有高發病率、高危害性,成為廣大學者關注的焦點〔1〕。調查發現,60歲以上的女性中幾乎有一半是KOA患者〔2〕。我國健康與養老追蹤調查數據庫顯示癥狀性KOA發病率為8.1%,女性高于男性〔3〕。老年KOA嚴重者將影響患者生活質量〔4〕。研究認為,KOA是由各種復雜因素在炎癥因子及其相關信號通路的介導下引發的骨性疾病〔5〕。Wnt/β-連環蛋白(catenin)信號通路通過細胞凋亡途徑發揮調控效應〔6〕,其相關蛋白和受體與KOA的發生發展密切相關〔7〕。

KOA中醫學稱為膝痹〔8〕。《張氏醫通》記載有“膝痛”:膝者筋之府,屈伸不能,行則僂附,筋將憊矣。故膝痛無有不因肝腎虛者,虛則風寒濕氣襲之。《圣濟總錄》記載:腎脂不長,則髓涸而氣不行,骨乃痹而其證內寒也。故KOA多以正氣內虛、肝腎不足為主要病機,以補益肝腎、強筋壯骨為主要治則。骨補丸(曾用名骨寶丸)是佛山市中醫院骨傷科長期臨床實踐總結的常用院內制劑,具有補腎填精益髓、強筋壯骨通絡的功效,適用于肝腎虧虛型老年KOA,已由前期動物與臨床研究證實〔9～11〕。基于中醫藥調控Wnt/β-catenin信號通路可能是防治KOA的關鍵機制〔12〕,本文從該信號通路探討骨補丸改善關節功能、抑制滑膜炎癥、延緩軟骨退變、促進軟骨修復的臨床療效及其作用機制。

1 資料與方法

1.1一般資料 以隨機數字表法將2021年1～6月佛山市中醫院治療的128例肝腎虧虛型老年KOA患者分成試驗組、對照組各64例。男46例,女82例;年齡60～79歲,平均(66.32±5.21)歲;病程1～10年,平均(4.22±3.38)年;X片Kellgren-Lawrence(KL)分級:Ⅰ級21例,Ⅱ級43例,Ⅲ級41例,Ⅳ級23例。兩組一般資料(性別、年齡、病程、KL分級等)差異均無統計學意義(P>0.05),具有可比性。見表1。本課題通過佛山市中醫院倫理委員會批準(研究方案版本號20200202),取得所有受試對象知情同意(知情同意書版本號20200205),并在醫學研究登記備案信息系統備案(備案編號MR-44-21-007340)。

表1 兩組一般資料

1.2診斷標準 KOA診斷標準:根據《骨關節炎診療指南(2018年版)》制定〔13〕:①近1個月內反復的膝關節疼痛;②X線片(站立位或負重位)示關節間隙變窄、軟骨下骨硬化和(或)囊性變、關節邊緣骨贅形成;③年齡≥60歲;④晨僵時間≤30 min;⑤活動時有骨摩擦音(感)。滿足①+(②、③、④、⑤條中的任意2條)者。肝腎虧虛證候診斷標準:參照《中醫骨傷科臨床診療指南·膝痹病(膝骨關節炎)》制定〔14〕:①主癥:關節隱隱作痛;②次癥:腰膝酸軟無力,酸困疼痛,遇勞更甚。舌質紅,少苔,脈沉細無力。

1.3納入標準 ①符合上述西醫疾病診斷標準及中醫證候診斷標準;②X線片示KL分級為Ⅰ～Ⅳ級;③就診之前4 w內未服用任何含有骨補丸組成的中藥或中成藥;④患者知情同意。

1.4排除標準 ①膝關節腫瘤、風濕、類風濕、結核、化膿、骨髓炎、痛風、骨折或嚴重創傷急性期;②嚴重肝腎功能損害,轉氨酶>正常上限值的3倍,血尿素氮和血清肌酐>正常上限值的2倍;③循環、呼吸、消化、血液、內分泌系統等嚴重原發性疾病;④語言、聽力、認知功能障礙、精神疾病等無法進行有效溝通;⑤已知對試驗藥物(骨補丸組方中的任意一味中藥或中成藥、玻璃酸鈉、氨基葡萄糖類、非甾體抗炎藥)過敏;⑥研究者認為其他需要排除的因素。

1.5終止臨床試驗標準 ①用藥依從性<80%;②發生嚴重不良事件,如皮膚嚴重過敏、消化道大出血等;③受試者不能堅持治療,主動要求退出。

1.6試驗藥品 ①骨補丸:規格每袋裝6 g,批準文號粵藥制字Z20060052,佛山市中醫院院內制劑中心生產;②玻璃酸鈉注射液:商品名阿爾治,關節內注射劑,規格2.5 ml(25 mg),進口藥品注冊證號H20090719,日本生化學工業株式會社高萩工長生產;③鹽酸氨基葡萄糖膠囊:商品名奧泰靈,0.75 g/粒,醫藥產品注冊證號HC20140007,香港澳美制藥廠生產;④塞來昔布膠囊:商品名西樂葆,200 mg/片,進口藥品注冊證號H20120355、H20120354,輝瑞制藥有限公司生產包裝;⑤安慰劑:仿造骨補丸外形,原料為面粉,達到可食用級別滅菌后包裝,規格每袋裝6 g,佛山市中醫院院內制劑中心提供。

1.7治療方法 ①西醫常規治療:兩組均給予玻璃酸鈉關節腔內注射,1次/w,連續4 w。口服鹽酸氨基葡萄糖膠囊,2次/d,每次1粒,飯后服用,連續4 w。口服塞來昔布膠囊,1次/d,每次1粒,飯后服用,連續4 w;②試驗組:口服骨補丸,3次/d,1袋/次,飯后服用,連續4 w;③對照組:口服安慰劑,3次/d,1袋/次,飯后服用,連續4 w。

1.8觀察指標 ①功能量表評分:分別于治療前、治療后由同一組臨床醫師采用西安大略和麥馬斯特大學骨關節炎指數(WOMAC)〔15〕、日本骨科協會評估治療分數(JOA)〔16〕、膝關節Lysholm功能評分〔17〕3種不同功能量表評分。WOMAC評分由關節疼痛、僵硬和關節功能3個項目組成,總分96分,分值與功能呈負相關。JOA評分由疼痛及步行能力、疼痛及上下樓梯能力、屈度角度及強直與高度攣縮、腫脹4個項目組成,總分100分,分值與功能呈正相關。Lysholm評分由跛行、支撐、交鎖、膝軟、疼痛、腫脹、爬樓梯、下蹲8個項目組成,總分100分,分值與功能呈正相關。②超聲影像測量滑膜厚度:分別于治療前、治療后由同一組超聲醫師采用Philips iu22型超聲儀測量。取仰臥位,伸直下肢,顯露膝關節,設置探頭頻率為8～15 MHz,掃查膝關節前上方,探測膝關節髕上囊滑膜,收集滑膜厚度數據,測量3次取平均值。③磁共振成像(MRI)影像測量髕骨面、滑車面軟骨T2值:分別于治療前、治療后由同一組MRI醫師采用Philips Achieva 3.0T TX多源發射MRI儀測量。使用SENSE8通道相控陣膝關節線圈,T2圖成像采用6回波自旋回波(SE)序列1次掃描,參數為:重復時間(TR)/回波時間(TE)=2 400 ms/15、30、45、60、75、90 ms,層厚5 mm,間隔0.5 mm,視野(FOV)16 cm×16 cm,矩陣320×512,重復次數(NSA)=1,掃描時間5 min 54 s。將掃描圖像傳遞到Philips EWS工作站,獲取膝關節軟骨的T2-mapping偽彩圖像,選取髕骨面、滑車面2個興趣區的關節軟骨T2值,均測量3次取平均值。④Wnt/β-catenin信號通路因子:分別于治療前、治療后抽取左肘正中靜脈血5 ml,放置于無菌乙二胺四乙酸(EDTA)-Na2抗凝管中,實時熒光定量聚合酶鏈反應檢測Wnt-3a、β-catenin、骨形態發生蛋白(BMP)-2 mRNA的表達量。設定β-catenin作為內參,依據2-△△Ct方法計算獲取相對定量數值。本檢測委托廣州金域醫學檢驗中心完成。⑤安全指標:如實記錄任何不良事件,包括全身不良反應、局部皮膚不良反應、消化道不良反應等出現的時間及癥狀體征,是否需停藥及處理措施等。

1.9統計學方法 采用SPSS22.0軟件,計數資料采用Pearsonχ2檢驗。計量資料若服從正態分布,且各組總體方差齊,則選擇參數統計,組內比較采用配對設計t檢驗,組間比較采用獨立樣本設計t檢驗;否則選擇非參數統計。

2 結 果

2.1功能量表評分 病例均獲得隨訪。兩組治療前WOMAC、JOA、Lysholm評分比較,差異均無統計學意義(P>0.05)。治療后兩組各指標分別與治療前比較,差異有統計學意義(P<0.05);治療后試驗組以上指標改善顯著優于對照組(P<0.05)。見表2。

表2 兩組功能量表評分分,n=64)

2.2影像學測量指標 兩組治療前滑膜厚度、髕骨面軟骨T2值、滑車面軟骨T2值比較,差異均無統計學意義(P>0.05)。治療后,兩組以上指標分別與治療前比較,差異均有統計學意義(P<0.05);治療后試驗組以上指標改善顯著優于對照組(P<0.05)。見表3。

表3 兩組影像學測量指標

2.3Wnt/β-catenin信號通路因子 兩組治療前Wnt-3a、β-catenin、BMP-2 mRNA比較,差異均無統計學意義(P>0.05)。治療后兩組以上指標分別與治療前比較,差異均有統計學意義(P<0.05);治療后試驗組以上指標改善明顯優于對照組(P<0.05)。見表4。

表4 兩組Wnt/β-catenin信號通路因子比較

2.4安全指標 試驗期間,兩組均無不良反應事件發生。

3 討 論

老年KOA是常見而多發的慢性進行性關節疾病〔18〕,具體發病原因和發病機制尚未完全闡明〔19〕。KOA主要病理過程是關節滑膜的增生、肥厚,軟骨的降解、破壞,軟骨下骨的囊性變、繼之硬化,邊緣性骨贅形成〔20〕,這一過程由炎癥因子在相關信號通路的介導下實現。研究證實,Wnt/β-catenin信號通路通過調控關節軟骨發育、骨化、重塑、骨折修復等,參與KOA的發生與發展〔21〕。Wnt家族有19個成員蛋白〔22〕,其中Wnt-3a是骨代謝的主要調節因子,Wnt-3a促進成骨細胞增殖或早期成骨細胞分化,并抑制成骨細胞的成熟或礦化〔23〕。β-catenin是Wnt/β-catenin通路中最關鍵的成骨因子,β-catenin作為多功能胞質蛋白,其異常表達能夠加劇骨質破壞和吸收進程,干擾骨質重建〔24〕。BMP-2則是唯一可以誘導間充質細胞朝向骨組織分化的因子,廣泛參與成骨過程,與成骨速率呈明顯負相關〔25〕,其活躍濃度提示KOA炎癥反應的嚴重程度。本研究提示,Wnt/β-catenin通路是調控骨代謝的重要途徑,Wnt-3a、β-catenin、BMP-2在該通路中發揮獨特作用,下調這三者的表達水平可延緩KOA病程發展,對這三者的調控可成為KOA的治療標靶〔26〕。

骨補丸由熟地黃、山茱萸、山藥、淫羊藿、龜板膠、鹿角膠、仙茅、杜仲等多種中藥組成。骨補丸以六味地黃湯之“三補”為其組方框架,熟地黃、山茱萸、山藥為君藥,淫羊藿、龜板膠、鹿角膠為臣藥,仙茅、杜仲為佐使藥,具有補益精髓、壯骨通絡之功效。從單味中藥分析,陳燁等〔27〕證實,山茱萸顆粒能抑制Wnt4、β-catenin的表達,抑制Wnt/β-catenin信號通路的激活。孫雯雯等〔28〕發現,山藥提取物能下調Wnt/β-catenin通路中關鍵基因Wnt1的表達。代云龍等〔29〕認為,淫羊藿苷能夠降低基質金屬蛋白酶(MMP)-9的mRNA相對表達量與β-catenin蛋白表達量,可能具有抑制Wnt/β-catenin信號通路活性的作用。李春等〔30〕觀察,龜板提取物具有雙向調控毛囊干細胞Wnt/BMP信號通路作用,隨著龜板提取物劑量的增加,β-catenin表達水平下降。本研究提示,骨補丸能夠調控Wnt/β-catenin信號通路,有效干預老年KOA病程進展,結合功能量表評分及影像學測量指標比較,骨補丸可能通過下調Wnt/β-catenin信號通路Wnt-3a、β-catenin、BMP-2表達水平,發揮其改善關節功能、抑制滑膜炎癥、延緩軟骨退變、促進軟骨修復的治療作用。

本研究不足之處:一是由于隨訪時間有限,樣本量偏少,缺乏多中心研究;二是由于中藥成分的不確定性及Wnt/β-catenin信號通路機制的復雜性,骨補丸調控Wnt/β-catenin信號通路是由其單味中藥提取物還是整方復合制劑來干預KOA的機制尚未完全明確。因此,下一步應進行多中心大樣本長期隨訪的前瞻對照試驗,對骨補丸成分進行詳細分析并結構排列,以骨補丸具體影響Wnt/β-catenin信號通路效應成分及作用標靶作為切入點,以獲得更精準的靶向藥物。