Hairless基因敲除小鼠發生炎性衰老的可能機制

杜春燕 左培培 章金濤 朱奎成

(鄭州大學 1醫學科學院,河南 鄭州 450052;2華中阜外醫院;3國家心血管病中心華中分中心)

炎性衰老是指機體隨年齡增長出現的長期慢性促炎癥反應進行性升高的病理性狀態,其顯著特征是機體隨年齡的增長出現炎癥穩態的失衡,從而引發細胞和機體逐漸向促炎過程的傾斜,進而發生的炎性衰老癥狀〔1～3〕。炎性衰老過程中,白細胞介素(IL)-6、IL-1β、腫瘤壞死因子(TNF)-α及C反應蛋白(CRP)等體內多種炎癥因子水平普遍升高,機體為對抗外來威脅而進行正常的抗炎作用日益減弱,最終表現為慢性衰老狀態〔4〕。

鄭州大學實驗動物中心(原河南醫科大學實驗動物中心)在1990年發現一種KM無毛突變小鼠,將其命名為豫醫無毛小鼠(YYHL),該小鼠為Hairless(Hr)基因自發突變小鼠,主要特征為無毛小鼠剛出生時仔鼠正常,從14 d開始脫毛,大約持續到21日齡被毛全部脫完,此時皮膚顏色呈肉色,到120日齡時無毛小鼠的皮膚顏色逐漸加深,并有許多油脂黏附其上,皮膚角化過度,眼球變得混濁、不突出,老齡鼠視力低,接觸性、敏感性、行動性均降低,壽命約為野生小鼠的1/2,6月齡無毛小鼠衰老特征明顯,因此無毛小鼠可作為衰老動物模型。

鄭州大學實驗動物中心微生物檢測室于2016年采用TALENs技術成功構建C57背景來源的Hr敲除小鼠(Hr-KO),該鼠與野生型鼠雜交獲得陽性F1子代,然后進行同窩交配,當傳至F2代時,小鼠14 d開始脫發,至30 d左右毛發完全脫凈,并終身保持無毛〔5〕。這與豫醫無毛小鼠形狀類似,通過對其壽命觀察,發現其同樣表現出壽命較正常小鼠短,多為8～9個月。無毛小鼠出現的早期衰老表明其可作為良好的衰老動物模型,用于衰老的相關研究。本文擬探討Hairless基因敲除小鼠發生炎性衰老的可能機制。

1 材料與方法

1.1動物 6月齡雄性SPF級WT(野生型C57BL/6J)小鼠12只,購自河南省實驗動物中心,合格證號編號為SCXK(豫)2017-0001。12只6月齡雄性SPF級Hr-KO小鼠由鄭州大學醫學科學院實驗動物平臺。

1.2儀器和試劑 超低溫冷凍冰箱購自青島海爾特種電器有限公司,全自動酶標儀購自上海賽默飛儀器有限公司,實時熒光定量聚合酶鏈反應(qRT-PCR)儀購自美國BIO-RAD公司,病理相關設備購自德國LEICA公司,水迷宮系統、大小鼠跑步機購自江蘇賽昂斯生物科技有限公司,組織破碎研磨儀購自寧波新芝生物科技股份有限公司。蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒購自北京索萊寶生物科技有限公司,RNA抽提試劑盒、逆轉錄試劑盒均購自大連Takara公司,IL-6、IL-1β、TNF-α 酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒購自上海廣銳生物科技有限公司,超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)試劑盒購自上海恒遠生物科技有限公司。

1.3皮膚形態學觀察 肉眼觀察兩組小鼠皮膚面貌和形態學特征。

1.4組織HE染色 取1～2 cm2小鼠背部皮膚組織,脫水、浸蠟、包埋后切片,按照HE染色試劑盒說明進行透明、復水、染色、封片,在光學顯微鏡下觀察病理組織切片并做圖像采集。

1.5水迷宮實驗檢測小鼠學習和記憶能力 行為學實驗開始前應進行游泳訓練,可讓小鼠在水池內自由游泳,每天訓練2次,上、下午各1次,每次1 min〔6〕。正式實驗時,在水池內固定位置安置平臺,離池壁約20 cm。將小鼠放入水中,每天測試1次,每次2 min,連續4 d,記錄小鼠尋找并爬上平臺所需的時間。2 min內未成功發現平臺的,時間標為2 min。定位航行實驗結束24 h后,撤除水下平臺,任選1個入水點將小鼠面向池壁放入水中,所有小鼠均在同一點入水,記錄動物在2 min內第1次跨越平臺時間和跨越平臺次數等指標。實驗期間,室內應保持安靜,水溫保持在24～25 ℃。水池周圍的參照物在實驗期間保持不變。

1.6跑步實驗檢測小鼠運動耐力 實驗前1 w內,應進行跑步機適應訓練,連續訓練3 d。跑道坡度調節為10 °,打開電源開關,將小鼠放入跑道,開啟電源,將電流調至合適位置,起始速度設置為10 m/min,按下啟停開始,持續時間為10 min。第4天進行正式實驗,初始速度定為12 m/min,持續時間為20 min,然后以0.3 m/min的速度加速,直到小鼠力竭〔7〕。應詳細記錄每個跑道的電擊次數及每個速度下的實際跑步時間。力竭判定標準:動物落入電擊區域,經連續電擊后無反應。

1.7ELISA檢測IL-6、IL-1β、TNF-α、SOD、MDA水平 剪尾法取小鼠新鮮血液,室溫下在EP管中靜置1 h后3 000 r/min離心15 min,取上清。取小鼠背部皮膚1 cm2左右,生理鹽水沖洗干凈,置于生理鹽水,4 ℃下研磨制成10%勻漿,3 000 r/min離心15 min,取上清液。分別按說明書檢測血清中IL-6、IL-1β、TNF-α及皮膚組織中SOD、MDA水平。

1.8實時熒光定量-聚合酶鏈反應(qRT-PCR)檢測皮膚組織中彈性蛋白原(tropoelastin)和纖維蛋白(fibrillin)-1表達水平 取小鼠背部皮膚1 cm2,采用組織破碎儀破碎后利用Trizol法提取組織總RNA,反轉錄后得到cDNA,按照反轉錄試劑盒說明書進行操作,配制反應體系,上機條件設置如下:95 ℃ 2 min,95 ℃ 30 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,循環35次。以GAPDH為內參基因。Tropoelastin正向引物:5′-CCCCAAGCTGCCTGGTG-3′,反向:5′-AACCAGCCTTGCCCGC-3′,fibrillin-1正向引物:5′-TGTGTCCAGCGGGGCATTTG-3′,反向:5′-CCCTGCGAG-ATGTGTCCTGC-3′,GAPDH正向引物:5′-TGTGTCCGTCGTCGTGGATCTGA-3′,反向:5′-TTGCTGTT-GAAGTCGCAGGAG-3′。

1.9統計學方法 采用SPSS16.0軟件進行t檢驗。

2 結 果

2.1動物皮膚觀察 通過肉眼直接觀察可見,與WT組相比,Hr-KO組小鼠全身無毛,且皮膚皺紋和褶痕顯著,皮膚呈暗黃色,衰老特征明顯。見圖1。

圖1 兩組皮膚形態學比較

2.2HE染色觀察小鼠皮膚病理改變 組織學染色發現,與WT組比較,Hr-KO組小鼠毛發生長缺陷,皮膚內毛囊瓦解,并形成許多橢圓囊及真皮包囊,表皮增厚明顯,且皮膚不同部位有炎癥細胞浸潤。見圖2。

圖2 兩組皮膚病理改變(HE染色,×400)

2.3各組皮膚組織中tropoelastin和fibrillin-1 mRNA表達水平 Hr-KO組tropoelastin和fibrillin-1 mRNA表達水平均明顯低于WT組(均P<0.05)。見表1。

表1 兩組tropoelastin和fibrillin-1 mRNA表達水平、水迷宮實驗運動時間、距離和穿越平臺次數、跑臺力竭運動距離及電擊次數比較

2.4兩組學習和記憶能力比較 與WT組相比,Hr-KO組潛伏時間明顯較長,運動距離明顯變長,穿越平臺次數明顯較少(P<0.05)。見表1。

2.5兩組運動能力比較 與WT組相比,Hr-KO組力竭運動距離明顯較短,且整個實驗過程中,被電擊次數明顯較多(P<0.05),見表1。

2.6各組血清中IL-6、IL-1β、TNF-α水平及皮膚組織中SOD、MDA水平比較 與WT組比較,Hr-KO組血清中炎癥因子IL-6、IL-1β、TNF-α表達水平均明顯升高;Hr-KO組SOD水平明顯低,且Hr-KO組MDA水平明顯高(均P<0.05)。見表2。

表2 各組血清中炎癥因子及皮膚組織中SOD、MDA水平比較

3 討 論

衰老是一個十分復雜的生命過程,是一種必然發生的生理學現象,伴隨著出現各個組織、器官及細胞的生理功能的逐漸退化和喪失〔8～11〕。

炎癥是驅動人類衰老的進程的重要因素之一〔12〕。自由基、炎癥和衰老三者關系密切且錯綜復雜,已逐漸成為衰老相關研究的熱點問題。炎性衰老過程中,機體慢性炎癥反應呈進行性升高的狀態,其基本機制主要是衰老機體促炎癥細胞因子網絡與抗炎癥細胞因子網絡平衡失調,體內炎性因子水平呈慢性升高狀態,最終表現為促炎反應的升高。體內外許多因素被證實與衰老有關,可分為內源性因素和外源性因素,其中內源性因素影響最大的是自由基對身體的傷害,當機體發生氧化應激時,自由基可導致生物分子的氧化損傷,進而引起機體內源性損傷相關分子模式(DAMPS)的產生和細胞因子的大量釋放〔13,14〕。細胞因子進而激發模式識別受體(PRRS)的活化,激活下游的核因子(NF)-κB、非受體型酪氨酸蛋白激酶(JAK)和絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)等信號通路,從而導致細胞因子和趨化因子釋放,招募和激活炎性細胞,激活炎癥信號通路,釋放炎性因子,最終引起機體系統性慢性炎癥反應〔15〕。本文利用Hr-KO無毛小鼠作為衰老的動物模型,初步探討了敲除Hr基因形成的無毛早衰小鼠在皮膚、學習記憶能力和運動能力等方面與健康小鼠的差異,分析比較了兩組動物在炎癥因子和抗氧化分子SOD、MDA表達水平的差異,為進一步揭示炎癥、氧化損傷與衰老的關系提供了參考。