上調miR-145-5p對急性腦梗死模型大鼠干預作用及機制

彭旭 姜波濤 張丹 劉杰 李雙

(長沙市第一醫院神經內科,湖南 長沙 410000)

臨床醫學將因突發性的腦組織供血中止導致腦組織壞死的癥狀定義為急性腦梗死,在腦卒中患者中占比接近90%,是最常見的腦血管疾病〔1,2〕。急性腦梗死多發于中老年人群,患者主要臨床表現為半身不遂、突發性眩暈、頭痛等,具有病起突然、嚴重程度高、治療難度大、預后差等特征〔3,4〕。目前臨床尚無特效的治療急性腦梗死的藥物,因此研究其發病分子機制,探尋新的治療靶點成為重點研究方向〔5〕。有研究表示,miR-145-5p在急性腦梗死中呈異常表達,其表達變化與急性腦梗死患者病情密切相關,但是關于調控miR-145-5p對急性腦梗死干預效果的研究鮮有報道〔6〕。本研究建立急性腦梗死大鼠模型,調控大鼠miR-145-5p表達,旨在探究調控miR-145-5p表達對急性腦梗死模型大鼠的干預效果及相關作用機制。

1 材料與方法

1.1材料 選取40只SD健康雄性大鼠〔北京科興中維生物技術有限公司,使用許可證號:SYXK(京)2020-0054〕,鼠齡10～12 w,平均(10.9±0.7)w;體質量221～252 g,平均(236.5±12.4)g。所有大鼠于(23.2±1.9)℃環境中喂養。本研究獲長沙市第一醫院倫理委員會批準。主要試劑:antago miR-145-5p、ago miR-145-5p(北京中杉金橋生物技術有限公司);兔抗大鼠Toll樣受體(TLR)4抗體(Gibco公司);大鼠抗小鼠核因子(NF)-κB p65抗體(Dako公司);大鼠抗小鼠腫瘤壞死因子(TNF)-α抗體(Invitrogen公司);小鼠抗兔白細胞介素(IL)-1β抗體(Sigma公司);小鼠抗大鼠B淋巴細胞瘤(Bcl)-2、Bcl-2相關X蛋白(Bax)抗體(Selleck公司);兔抗大鼠微管相關蛋白(LC3)-Ⅱ抗體(Hyclone公司);小鼠抗兔自噬效應蛋白(Beclin)-1抗體(BD公司)。

1.2建模及分組干預 隨機挑選10只為正常組,其余30只建立急性腦梗死模型:固定后進行麻醉處理,大鼠失去意識后頸部消毒,將中央部位皮膚切開,顯微鏡下分離頸外動脈(ECA)、頸總動脈(CCA)、頸內動脈(ICA),近心端結扎近端ECA,應用微動脈夾夾住ICA,CCA進行結扎固定,阻斷腦組織中動脈后將微動脈夾取下,并對ICA進行固定,縫合創口并消毒。大鼠建模后出現病灶對側前肢無法伸直、行走時向病灶對側旋轉、按住尾巴向病灶對側旋轉等狀況視為建模成功,將實驗過程中死亡大鼠剔除,建模成功25只,隨機分為上調組9只,腦梗死組、下調組各8只。下調組腹腔注射antago miR-145-5p 30 mg/kg,上調組腹腔注射ago miR-145-5p 30 mg/kg,正常組、腦梗死組腹腔注射等量生理鹽水。4組均連續干預7 d。

1.3學習、記憶能力檢測 設計Y型迷宮,并將大鼠置于其中自由活動10 min,60 V電壓對大鼠電刺激6 s,電刺激開始后大鼠直接逃至安全區為正確反應,大鼠逃至安全區后停留0.5 min后再次置入電刺激區域反復訓練。連續訓練10次中9次符合正確反應標準為訓練合格,記錄各組學習合格所用訓練次數。Y型迷宮訓練次日再次訓練,記錄各組10次訓練正確反應次數。

1.4腦梗死面積、含水量檢測 取各組腹部靜脈血3 ml,離心半徑10 cm,轉速2 500 r/min離心處理15 min,-30 ℃保存。分別于干預3、5、7 d時間點對腦梗死面積、含水量進行檢測:在各時間點,各組麻醉后頸椎脫臼法處死2只,取腦組織冷藏0.5 h,2 mm厚度切片,使用2%紅四氮唑(TTC)溶液染色,0.5 h后4%甲醛固定,拍照后對梗死面積進行計算。含水量檢測:將腦組織表面水分吸除后稱重,置于烤箱中烤至恒重,稱取干質量,腦含水量=(濕質量-干質量)/濕質量。

1.5HE染色 大鼠腦組織固定后使用4%甲醛浸泡1 d,石蠟包埋、切片,烤干后進行脫蠟處理,不同濃度酒精復水、蘇木素染色,分化、沖洗后進行乙醇梯度脫水,伊紅染色、乙醇梯度脫水、脫蠟后封片,顯微鏡觀察。

1.6Western印跡法檢測TLR4/NF-κB通路、凋亡、自噬相關蛋白表達 使用裂解液對大鼠腦組織切片進行干預后提取50 μg蛋白,煮沸、蛋白定量后十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)、轉膜后室內封閉2.5 h,之后1∶2 000添加一抗進行孵育,4 ℃孵育,1 d后取出TBST清洗3次,1∶5 000添加二抗,孵育1 h,再次TBST清洗3次,顯色、曝光、成像,檢測條帶灰度值,檢測TLR4、NF-κB p65、Bcl-2、Bax、LC3-Ⅱ、Beclin-1相對表達量。

1.7酶聯免疫吸附試驗檢測炎癥因子水平 標記酶標板,稀釋標準品,設置空白孔、對照孔、觀察孔,空白孔添加終止液、顯色劑,對照孔添加稀釋后標準品,觀察孔添加血清標本、抗體,封膜、充分搖晃后置于37 ℃保溫箱中培養,2 h后取出去膜清洗,吸干水分,添加顯色劑后震蕩,顯色后添加終止液,450 nm處測吸光值,計算TNF-α、IL-1β水平。

1.8統計學處理 采用SPSS26.0軟件,多組對比行F檢驗,組間對比行獨立樣本t檢驗。

2 結 果

2.1各組腦組織病理學觀察 正常組腦組織細胞排列緊密、規則,結構、形態均正常,無病理變化。腦梗死組、下調組腦組織細胞排列較為雜亂無序,且結構、形態異常,出現細胞核破裂現象,炎性細胞浸潤明顯。上調組腦組織細胞排列較為規則,細胞結構、形態改善,炎性細胞浸潤情況明顯減輕。見圖1。

2.2各組學習、記憶能力比較 腦梗死組、下調組、上調組達標所需訓練次數高于正常組、記憶能力低于正常組,差異有統計學意義(P<0.05);上調組達標所需訓練次數低于腦梗死組、下調組,記憶能力高于腦梗死組、下調組,差異有統計學意義(P<0.05);下調組達標所需訓練次數高于腦梗死組,記憶能力低于腦梗死組,差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 各組學習、記憶能力比較

2.3各組腦組織梗死面積、含水量情況 與腦梗死組比較,干預3、5、7 d后下調組梗死面積、腦組織含水量升高,上調組梗死面積、腦組織含水量降低,差異有統計學意義(P<0.05);與下調組比較,干預3、5、7 d后上調組梗死面積、腦組織含水量降低,差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 各組腦組織梗死面積、含水量比較

2.4各組TLR4/NF-κB通路蛋白及下游炎癥因子水平比較 腦梗死組、下調組、上調組TLR4、NF-κB p65表達及TNF-α、IL-1β水平均顯著高于正常組;下調組上述指標均顯著高于腦梗死組;上調組上述指標均顯著低于腦梗死組、下調組(P<0.05)。見表3,圖2。

表3 各組TLR4/NF-κB通路蛋白及下游炎癥因子水平及凋亡、自噬相關蛋白表達比較

圖2 各組TLR4/NF-κB通路蛋白表達

2.5各組凋亡、自噬相關蛋白表達對比 腦梗死組、下調組、上調組Bcl-2、LC3-Ⅱ、Beclin-1表達顯著高于正常組,Bax表達顯著低于正常組(P<0.05);下調組Bcl-2、LC3-Ⅱ、Beclin-1表達顯著高于腦梗死組,Bax表達顯著低于腦梗死組(P<0.05);上調組Bcl-2、LC3-Ⅱ、Beclin-1表達顯著低于腦梗死組、下調組,Bax表達顯著高于腦梗死組、下調組(P<0.05)。見表3,圖3。

圖3 各組凋亡、自噬相關蛋白表達

3 討 論

急性腦梗死患者病死率較高,且其發病機制尚未研究透徹,因此許多學者嘗試通過基礎醫學等途徑對急性腦梗死發病機制、干預方法進行研究〔7,8〕。miRNA在生物體中大量存在,在機體免疫系統、神經系統、組織細胞增殖、凋亡等過程中具有重要作用〔9〕。miR-145-5p為miRNA家族的重要組成成員,miR-145-5p表達變化與癌細胞生物學活性密切相關〔10,11〕。調控miR-145-5p表達能夠促進小膠質細胞活化,從而起到腦保護作用。

大量臨床研究表明,急性腦梗死患者神經功能、認知功能會受到嚴重損傷〔12,13〕。有研究通過動物實驗研究表明,對腦梗死大鼠進行干預,能夠改善其神經功能及學習記憶能力〔14〕。本研究說明急性腦梗死大鼠神經功能出現一定程度的損傷,導致學習記憶能力明顯下降,上調miR-145-5p表達能夠改善大鼠學習記憶能力,改善大鼠神經功能,可能是由于上調miR-145-5p表達促進大鼠小膠質細胞活化,從而減輕大鼠神經功能損傷嚴重程度。本研究結果體現上調miR-145-5p表達能夠發揮一定的腦保護作用。本研究說明上調miR-145-5p表達能夠抑制急性腦梗死大鼠腦組織炎癥反應。大量研究表示,隨著急性腦梗死的發生發展,機體腦組織出現一定程度的炎癥反應,腦組織炎癥反應是導致機體神經功能損傷的主要因素〔15,16〕。TLR4/NF-κB通路蛋白表達變化與機體炎癥反應具有密切聯系,TNF-α、IL-1β均為TLR4/NF-κB通路下游炎癥因子,二者水平變化與機體炎癥反應密切相關。本研究說明急性腦梗死大鼠腦組織出現一定程度的炎癥反應,上調miR-145-5p表達能夠調控TLR4/NF-κB通路蛋白表達,抑制下游炎癥因子水平,減輕大鼠腦組織炎癥反應嚴重程度,從而起到腦保護作用。

本研究推測由于上調miR-145-5p表達能夠抑制大鼠腦組織神經細胞凋亡,從而發揮腦保護作用。急性腦梗死癥狀的發生發展伴隨腦組織細胞凋亡、自噬是機體神經功能損傷的主要原因〔17,18〕。Bcl-2、Bax為線粒體凋亡通路的重要成員,二者表達變化與細胞增殖、凋亡能力變化密切相關〔19,20〕。LC3-Ⅱ、Beclin-1是常用的評價細胞自噬的指標,二者表達與細胞自噬密切相關〔21,22〕。本研究說明上調miR-145-5p表達能夠調控細胞凋亡、自噬蛋白表達,抑制急性腦梗死大鼠腦組織細胞凋亡、自噬,具有一定的腦保護作用。