芪倍合劑對UC小鼠模型TGF-β1/Smad2信號通路及Th17/Treg平衡、炎性細胞因子表達的影響

董良鵬 杜學芳 張超群 韓宇 張彩鳳

(新鄉醫學院第一附屬醫院,河南 新鄉 453100)

潰瘍性結腸炎(UC)是一種原因不明的慢性非特異性炎癥反應,涉及直腸和結腸〔1〕。免疫反應在UC的發生和進展中起至關重要的作用,在UC期間,有助于炎癥的T輔助細胞(Th)17群體通常會增加,而抑制Th17活性的調節T細胞(Treg)則會減少〔2〕。UC的腸道炎性反應會受到轉化生長因子(TGF)-β1/Smad2通路的調節,研究顯示結腸黏膜中TGF-β和Smad2表達上調會促進炎性損傷〔3〕。此外,T細胞分化和成熟也受到TGF-β1/Smad2通路調節,其會促進Th17/Treg向Th17偏移〔4〕?，F階段治療UC的方法主要為對癥治療,近年來中藥在治療UC和改善免疫中取得了長足進展,一項臨床研究顯示芪倍合劑(豫藥制字Z04070018)具有治療UC的作用〔5〕,但具體機制尚不清楚。本文主要分析芪倍合劑對UC大鼠的影響并探究作用機制,為臨床更好地應用芪倍合劑治療UC提供理論依據。

1 材料與方法

1.1實驗材料 BALB/c小鼠(SPF,雄性,6～7周齡,體質量22～26 g,編號:SCXK 廣東 2011-0015)。試劑及儀器包括葡聚糖硫酸鈉(DSS,Sigma,美國)、芪倍合劑(新鄉醫學院第一附屬醫院,100 ml/瓶)、逆轉錄和SYBR Green PCR Master Mix q聚合酶鏈反應(PCR)試劑盒(Roche公司,瑞士)、蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒(碧云天公司,中國)、流式細胞儀(Becton Dickinson公司,美國)、BD Mouse Foxp3固定緩沖液、通透緩沖液和小鼠Treg/Th17表型抗體試劑(BD Biosciences公司,美國)、免疫磁珠(Invitrogen公司,美國)、anti-TGF-β1和anti-Smad2(Abcam公司,美國)、聚偏氟乙烯(PVDF)膜(Bio-Rad公司,美國)、倒置熒光顯微鏡(Olympus公司,日本)。

1.2分組、建模和干預 小鼠在溫度22～25 ℃,12 h明/暗循環、相對濕度約為55%的潔凈動物室內飼養,自由飲水和飲食。適應性喂養1 w后,將30只小鼠隨機分為對照組、UC組和UC+芪倍合劑組,每組10只。UC組和UC+芪倍合劑組根據參考文獻〔6〕使用DSS誘導小鼠UC,將小鼠飲用水換為2.5%(W/V)的DSS溶液,連續7 d,然后換為正常飲用水3 d。UC+芪倍合劑組使用芪倍合劑灌腸,根據參考文獻〔6〕通過體質量換算得到芪倍合劑劑量為1.5 ml,每日1次,連續7 d,對照組和UC組給予等量生理鹽水。使用Murthy評分系統記錄每日疾病活動指數(DAI)〔7〕,大鼠出現糞便稠度變化和便血為建模成功。

1.3酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測炎性因子 在小鼠處死前進行眼眶取血,離心20 min(120 000 r/min)后獲得血清,通過試劑盒加入抗體檢測腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細胞介素(IL)-1、IL-4水平,然后在450 nm下測量吸光度(OD)值,根據標準曲線計算TNF-α、IL-1、IL-4水平。

1.4HE染色檢測結腸黏膜病變 通過頸脫臼處死小鼠,立即取新鮮的結腸組織在10%中性甲醛緩沖液中,包埋在石蠟中,分別使用蘇木素和伊紅染料,在顯微鏡下觀察。

1.5流式細胞術檢測Th17/Treg水平 將外周血經過密度梯度離心后抽吸淋巴細胞層,獲得單個淋巴細胞懸浮液。細胞用20 μl預冷的1×BD鼠Foxp3固定緩沖液處理,并在暗室中于4 ℃固定30 min,然后洗滌固定劑并收集細胞。隨后加入200 μl預熱的1×BD鼠Foxp3通透緩沖液,并將細胞在37 ℃暗室中孵育30 min。洗去通透緩沖液,將細胞與20 μl小鼠Treg/Th17表型抗體試劑或對照抗體在室溫下孵育30 min。然后將抗體洗掉,將細胞重懸并通過FACSCalibur流式細胞儀進行分析。

1.6Western印跡檢測蛋白表達 采用密度梯度離心分法離單個核細胞〔9〕,然后使用免疫磁珠分離淋巴細胞。將細胞和結腸黏膜組織裂解后分離總蛋白,并通過二喹啉甲酸(BCA)法測定蛋白濃度,將等量總蛋白通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離(120 V,90 min),經轉膜后分別加入anti-TGF-β1和anti-Smad2(1∶500稀釋)孵育過夜,然后加入二抗在室溫下孵育1 h。以磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)為內參,使用電化學發光(ECL)試劑盒通過灰度分析蛋白相對表達水平。

1.7統計學處理 采用SPSS19.0軟件進行單因素方差分析,兩兩比較通過LSD-t檢驗。

2 結 果

2.1各組DAI評分比較 建模后UC組和UC+芪倍合劑組均出現便血情況。與對照組比較,干預后UC組DAI評分顯著升高(P<0.05);與UC組比較,干預后UC+芪倍合劑組DAI評分顯著降低(P<0.05)。見表1。

表1 各組DAI評分、TNF-α、IL-1、IL-4、Th17、Treg及Th17/Treg水平比較

2.2各組炎性因子水平比較 與對照組比較,UC組TNF-α、IL-1水平顯著升高而IL-4水平顯著降低(P<0.05)。與UC組比較,UC+芪倍合劑組TNF-α、IL-1水平顯著降低而IL-4水平顯著升高(P<0.05),見表1。

2.3各組結腸黏膜病變情況 對照組結腸黏膜完全正常;UC組表現出急性炎癥,伴有黏膜糜爛、水腫、隱窩減少,并且在黏膜下層和固有層中存在中性粒細胞和其他炎性細胞。與UC組比較,UC+芪倍合劑組結腸黏膜基本正常,炎性浸潤明顯減少,見圖1。

圖1 各組結腸黏膜病變(HE染色)

2.4各組Th17/Treg水平比較 流式細胞儀結果顯示,與對照組比較,UC組Th17水平升高,Treg水平降低,Th17/Treg升高,差異有統計學意義(P<0.05)。與UC組比較,UC+芪倍合劑組Th17水平和Th17/Treg顯著降低,Treg水平顯著升高(P<0.05)。見表1和圖2。

圖2 流式細胞術檢測芪倍合劑對UC小鼠Th17/Treg水平的影響

2.5各組結腸黏膜及淋巴細胞TGF-β1/Smad2水平比較 結腸黏膜及淋巴細胞中,UC組TGF-β1/Smad2水平顯著高于對照組;UC+芪倍合劑組TGF-β1/Smad2水平顯著低于UC組(P<0.05),見圖3和表2。

圖3 Western印跡檢測芪倍合劑對UC小鼠結腸黏膜及淋巴細胞中TGF-β1/Smad2水平的影響

表2 各組結腸黏膜及單個淋巴細胞TGF-β1/Smad2水平比較

3 討 論

UC臨床癥狀包括腹瀉、腹痛和直腸出血,輕癥UC可見彌漫性炎癥、黏膜充血和水腫,重癥UC會出現局灶性出血。該病通常是臨床復發和緩解交替出現的階段。目前,UC的發病機制仍不清楚。遺傳因素、腸道環境、免疫反應、細胞凋亡和感染均可能與UC有關〔8〕。臨床上治療UC的主要方法為抗炎和對癥治療,但是對于炎癥反應控制不良的患者需要進行手術。

現階段尚無關于治療UC的特效方法,中藥在UC的治療中得到了越來越廣泛的應用,芪倍合劑主要成分為黃芪、附子和大黃,研究顯示芪倍合劑具有改善腸道應激的作用〔9〕。一項臨床研究顯示在雙歧桿菌四聯活菌片的基礎上聯合芪倍合劑可以更有效緩解炎癥反應,并具有提高機體免疫力的作用〔5〕。本研究結果顯示芪倍合劑可以顯著抑制機體的炎性因子水平,并緩解結腸黏膜的炎性反應。黃芪是芪倍合劑的主要成分,可以解毒生肌,固表益氣,已經有研究顯示其活性單體黃芪甲苷具有緩解UC大鼠模型炎性反應、保護結腸黏膜完整性的作用〔10〕。附子具有溫陽散寒止痛、回陽救逆的作用,臨床研究顯示聯合附子可以提高美沙拉嗪對UC的療效〔11〕。大黃具有瀉火涼血、活血化瘀之功效,在UC中也具有顯著作用〔12〕。這提示芪倍合劑具有抑制炎性反應,治療UC的作用。

越來越多的證據表明UC涉及異常的免疫反應,獲得性免疫在UC發病機制中起著至關重要的作用,UC患者Th17細胞水平被上調,其可通過分泌細胞因子促進炎性反應,Th17的作用與Treg拮抗,UC中Treg水平下降,調節Treg/Th17平衡,不但可以改善免疫和炎性反應,還可改善預后〔13,14〕。TGF-β1/Smad2通路是參與免疫炎癥反應的重要通路,TGF-β1/Smad2通路的激活一方面可以促進結腸黏膜釋放細胞因子,招募炎性因子引起結腸黏膜的炎性損傷〔15〕,另一方面,淋巴細胞中TGF-β1/Smad2通路激活可以使Treg/Th17平衡向Th17偏移,引起免疫異常〔16〕;與本研究結果一致。研究顯示芪倍合劑可以有效調節Treg/Th17細胞平衡改善機體免疫反應〔17〕。黃芪中的活性成分可以調節膠原性關節炎小鼠模型中Treg/Th17平衡,減少Th17細胞的活化〔18〕。黃芪也可以調節TGF-β1途徑抑制纖維化〔19〕。附子也具有抑制TGF-β1/Smad2通路的作用〔20〕。本研究結果提示,芪倍合劑可以通過抑制結腸黏膜中TGF-β1/Smad2通路保護結腸黏膜,也可以通過抑制淋巴細胞的TGF-β1/Smad2通路調節Treg/Th17細胞平衡調控免疫反應。關于芪倍合劑調控TGF-β1/Smad2的機制則需要進一步研究。