金雀異黃素對腦卒中大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞激活及HMGB1/TLR4通路的影響

趙漢清 馮鵬超 張霞 杜瑩瑩 賈評

(河北北方學(xué)院附屬第二醫(yī)院 1中醫(yī)科,河北 張家口 075100;2中醫(yī)針灸科;3消化科;4急診科;5藥劑科)

腦卒中是全球人類發(fā)病率、死亡率增加的主要原因之一,小膠質(zhì)細(xì)胞作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)的常駐免疫細(xì)胞,是抵御損傷的第一道防線,當(dāng)腦缺血發(fā)生時(shí),其會被立即激活,發(fā)揮重要作用〔1、2〕。在缺血性腦卒中的病理階段,M1型小膠質(zhì)細(xì)胞可產(chǎn)生白細(xì)胞介素(IL)-1β等促炎介質(zhì)損害神經(jīng)系統(tǒng),而M2型小膠質(zhì)細(xì)胞的特征是產(chǎn)生IL-10等抗炎因子及血管內(nèi)皮生長因子等生長因子來促進(jìn)血管生成,起到神經(jīng)保護(hù)作用〔2〕,因此,有效抑制小膠質(zhì)細(xì)胞激活,促進(jìn)其M1/M2的轉(zhuǎn)化對疾病的治療具有重要意義,所以,了解腦卒中小膠質(zhì)細(xì)胞的激活及轉(zhuǎn)化機(jī)制十分必要。高遷移率族蛋白(HMG)B1作為具有促炎活性的細(xì)胞因子樣介質(zhì),已被報(bào)道與缺血性腦神經(jīng)炎癥和損傷有關(guān)〔3〕,有研究發(fā)現(xiàn),降低HMGB1/Toll樣受體(TLR)4介導(dǎo)的炎癥通路激活可抑制氧糖剝奪和再灌注誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞活化及炎癥因子的釋放,從而改善小膠質(zhì)細(xì)胞損傷〔4,5〕。金雀異黃素可通過降低氧化應(yīng)激及免疫炎癥反應(yīng),在腦缺血模型中發(fā)揮腦保護(hù)作用〔6,7〕。有研究發(fā)現(xiàn),金雀異黃素可通過阻斷HMGB1信號來促進(jìn)糖尿病小鼠眼角膜和神經(jīng)傷口的恢復(fù),但關(guān)于金雀異黃素在腦卒中對該通路的影響還未見報(bào)道〔8〕。因此本研究通過探究金雀異黃素對腦卒中大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞激活及HMGB1/TLR4的影響。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物 自河南省實(shí)驗(yàn)動物中心購買的50只SD大鼠(體質(zhì)量200～250 g,SPF級),許可證:SCXK(豫)2017-0001,于室溫(25±13)℃且通風(fēng)良好的飼養(yǎng)環(huán)境中喂養(yǎng)7 d(光照/黑暗為12 h/12 h)。

1.2主要試劑 二喹啉甲酸(BCA)試劑盒(SLF-23227,武漢極捷生物科技有限公司);兔抗OX-42抗體(bs-7131R,杭州昊鑫生物科技股份有限公司);辣根過氧化物酶(HRP)-IgG抗體、兔抗離子鈣結(jié)合銜接分子(Iba)1、HMGB1、TLR4、β-actin、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)抗體(ab13243、ab5076、ab18256、ab13556、ab8227、ab15323,Abcam);兔抗精氨酸酶(Arginase)抗體(93668,Cell Signaling Technology);IL-1β、IL-10試劑盒(EK0418,上海和序生物科技有限公司);IL-1β試劑盒(YM-SZ1583,上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司);原位缺口末端標(biāo)記法(TUNEL)細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(YT136,北京百奧萊博科技有限公司);Omega Fluor 凝膠成像系統(tǒng)(環(huán)亞生物科技有限公司);帝肯酶標(biāo)儀Tecan光吸收酶標(biāo)儀Sunrise(湖南中瑞互信醫(yī)療科技有限公司)。

1.3分組與模型構(gòu)建 將SD大鼠(50只)隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、低劑量組(5 mg/kg金雀異黃素)、高劑量組(10 mg/kg金雀異黃素)〔7〕、高劑量+甘草酸組(10 mg/kg金雀異黃素+0.03 g/kg HMGB1抑制劑)〔9〕各10只。腦卒中模型大鼠構(gòu)建:戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠,乙醇消毒后固定大鼠使頸部暴露,切開皮膚,暴露左側(cè)頸內(nèi)、外動脈,在內(nèi)外動脈分叉膨大處切口,于切口端頸內(nèi)動脈插入尼龍線(20 mm),將尼龍線與頸內(nèi)動脈結(jié)扎后縫合皮膚,注射青霉素以防止感染,使用Longa評分于大鼠造模2 h后驗(yàn)證模型是否成功,若評分為1～3分則表明造模成功〔10〕,造模成功率100%;對照組大鼠僅暴露左側(cè)頸內(nèi)、外動脈,不進(jìn)行插線及結(jié)扎;造模成功后次日,低劑量組、高劑量組、高劑量+甘草酸組大鼠腹腔注射相應(yīng)劑量藥物,假手術(shù)組、模型組注射等量生理鹽水共2 w(1次/d)。

1.4大鼠神經(jīng)行為學(xué)評分 于造模結(jié)束及實(shí)驗(yàn)結(jié)束參照Longa評分對大鼠神經(jīng)功能進(jìn)行評分:0分:正常、無神經(jīng)缺損體征出現(xiàn);1分:對側(cè)前爪不能完全伸展;2分:提尾后向外側(cè)方向轉(zhuǎn)圈;3分:行走時(shí)向?qū)?cè)跌倒;4分:無法自發(fā)行走、意識昏迷〔11〕。

1.5TUNEL法檢測腦組織神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況 隨機(jī)選出5只大鼠取其腦組織按照常規(guī)方法制作石蠟切片(4 μm),一部分使用蛋白酶K(2%)孵育(20 min)后PBS洗滌,加入TUNEL反應(yīng)液孵育(1 h),用含4′,6-二脒基-2苯基吲哚(DAPI)的抗熒光猝滅液封片,熒光顯微鏡觀察并拍照,觀察腦組織凋亡陽性細(xì)胞數(shù),ImageJ軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì);其余切片進(jìn)行免疫組化實(shí)驗(yàn)。

1.6免疫組化法檢測腦組織中Iba1表達(dá) 將1.5所得切片(n=5)置于過氧化氫中孵育10 min以消除內(nèi)源性過氧化物酶活性,孵育山羊血清(30 min)后加Iba1一抗孵育過夜,于次日孵育生物素標(biāo)記的二抗(20 min),磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗后滴加二氨基聯(lián)苯胺(DBA)顯色、中性樹脂封片后Image Pro Plus6.0觀察并進(jìn)行棕黃色陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)(×400)。

1.7酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測腦組織IL-1β、IL-10水平 取出剩余全部大鼠的腦組織于冰上進(jìn)行勻漿,離心(12 500 r/min、25 min)后取上清液,一部分使用ELISA試劑盒測定IL-1β、IL-10含量,其余進(jìn)行后續(xù)Western印跡。

1.8Western印跡檢測Arginase、iNOS蛋白及HMGB1/TLR4通路蛋白表達(dá) 通過蛋白濃度檢測試劑盒對1.7所得上清液中蛋白濃度進(jìn)行定量,取30 μg蛋白樣品加入已配制好的分離膠中進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE),轉(zhuǎn)膜、封閉(5%牛血清白蛋白,1 h),一抗(兔抗Arginase、iNOS、HMGB1、TLR4、β-actin抗體,1∶2 000)孵育過夜,二抗(山羊抗兔HRP-IgG)孵育1 h,電化學(xué)發(fā)光(ECL)顯影后使用蛋白凝膠成像儀進(jìn)行觀察,使用ImageJ分析各蛋白條帶灰度值,計(jì)算Arginase、iNOS、HMGB1、TLR4水平。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS25.0軟件進(jìn)行方差分析,兩兩比較采用SNK-q法。

2 結(jié) 果

2.1金雀異黃素對各組神經(jīng)功能的影響 與假手術(shù)組比較,模型組神經(jīng)功能缺損評分顯著增加(P<0.05);與模型組比較,低劑量組及高劑量組神經(jīng)功能缺損評分顯著降低(P<0.05);與高劑量組比較,高劑量+甘草酸組神經(jīng)功能缺損評分顯著降低(P<0.05),見表1。

表1 各組神經(jīng)功能、大腦神經(jīng)細(xì)胞凋亡率、IL-1β及IL-10水平

2.2金雀異黃素對腦組織IL-1β及IL-10水平的影響 與假手術(shù)組比較,模型組IL-1β水平顯著升高,IL-10水平則顯著降低(P<0.05);與模型組比較,低劑量組及高劑量組IL-1β水平顯著降低,IL-10水平顯著升高(P<0.05);與高劑量組比較,高劑量+甘草酸組IL-1β水平顯著降低,IL-10水平顯著升高(P<0.05),見表1。

2.3金雀異黃素對各組神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響 與假手術(shù)組比較,模型組大腦神經(jīng)細(xì)胞凋亡率顯著增加(P<0.05);與模型組比較,低劑量組及高劑量組神經(jīng)細(xì)胞凋亡率顯著降低(P<0.05);與高劑量組比較,高劑量+甘草酸組神經(jīng)細(xì)胞凋亡率顯著降低(P<0.05),見表1、圖1。

圖1 各組大腦神經(jīng)細(xì)胞凋亡(×400)

2.4金雀異黃素對各組腦組織Iba1表達(dá)及小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)的影響 與假手術(shù)組比較,模型組腦組織Iba1陽性細(xì)胞數(shù)顯著增加(P<0.05);與模型組比較,低劑量組及高劑量組Iba1陽性細(xì)胞數(shù)顯著降低(P<0.05);與高劑量組比較,高劑量+甘草酸組Iba1陽性細(xì)胞數(shù)顯著降低(P<0.05),見表1;假手術(shù)組小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量極少,存在分支狀突起且突起細(xì)長,胞體瘦長,均未活化;模型組小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量增加、突起增多變粗連接成網(wǎng)狀、體積增大,呈活化狀態(tài);與模型組比較,低劑量組及高劑量組小膠質(zhì)細(xì)胞突起變細(xì),數(shù)量減少;與高劑量組比較,高劑量+甘草酸組小膠質(zhì)細(xì)胞活化數(shù)進(jìn)一步減少,見圖2。

圖2 各組小膠質(zhì)細(xì)胞(免疫組化染色,×400)

2.5金雀異黃素對腦組織Arginase及iNOS表達(dá)的影響 與假手術(shù)組比較,模型組iNOS表達(dá)水平顯著升高,Arginase表達(dá)顯著降低(P<0.05);與模型組比較,低劑量組及高劑量組iNOS表達(dá)顯著降低,Arginase表達(dá)顯著升高(P<0.05);與高劑量組比較,高劑量+甘草酸組iNOS表達(dá)顯著降低,Arginase表達(dá)顯著升高(P<0.05),見表2、圖3。

1～5:假手術(shù)組、模型組、低劑量組、高劑量組、高劑量+甘草酸組;下圖同圖3 各組腦組織Arginase及iNOS表達(dá)

表2 各組腦組織Arginase及iNOS表達(dá)

2.6各組腦組織HMGB1/TLR4通路蛋白表達(dá) 與假手術(shù)組比較,模型組HMGB1、TLR4表達(dá)水平顯著升高(P<0.05);與模型組比較,低劑量組及高劑量組HMGB1、TLR4表達(dá)顯著降低(P<0.05);與高劑量組比較,高劑量+甘草酸組HMGB1、TLR4表達(dá)顯著降低(P<0.05),見圖4、表3。

圖4 各組腦組織HMGB1/TLR4通路蛋白表達(dá)

表3 各組腦組織HMGB1/TLR4通路蛋白表達(dá)

3 討 論

腦卒中包括缺血性與出血性,其中以缺血性為主,由腦血管血流受阻所導(dǎo)致〔12〕。缺血性腦卒中已成為全球人類死亡的第二大主要原因,并且具有極高的致殘率,對患者及其家庭造成極大的負(fù)擔(dān)〔12〕。小膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的重要免疫細(xì)胞,活化的小膠質(zhì)細(xì)胞是大腦中細(xì)胞因子、生長因子、趨化因子的主要來源,而這些分子與腦卒中繼發(fā)性腦損傷及腦組織修復(fù)密切相關(guān),因此了解其活化機(jī)制,對尋找新的腦卒中治療藥物及研究其治療機(jī)制極其關(guān)鍵。

金雀異黃素是一種存在于大豆食品中的異黃酮植物雌激素,已被證明可防止缺血性腦卒中造成的腦損傷〔7,13〕。金雀異黃素能夠通過促進(jìn)磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)-蛋白激酶B(Akt)-雷帕霉素靶蛋白(mTOR)通路激活來減輕去卵巢模型大鼠腦組織神經(jīng)元凋亡,從而起到神經(jīng)保護(hù)作用〔14〕。當(dāng)受到刺激后,小膠質(zhì)細(xì)胞會被迅速激活并分化為M1或M2型,M1小膠質(zhì)細(xì)胞通過分泌促炎因子,參與組織損傷,M2通過分泌抗炎因子或神經(jīng)營養(yǎng)因子來促進(jìn)組織修復(fù)〔12〕。金雀異黃素-3′-磺酸鈉作為金雀異黃素的磺化產(chǎn)物可通過促進(jìn)α7煙堿乙酰膽堿受體表達(dá)來抑制NF-κB信號傳導(dǎo),以此減少小膠質(zhì)細(xì)胞M1極化,從而減輕神經(jīng)炎癥,防止缺血性腦卒中大鼠腦損傷的發(fā)生〔13〕。本研究結(jié)果表明,金雀異黃素能夠有效抑制腦卒中大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞激活,促進(jìn)其M1/M2型轉(zhuǎn)化,改善腦損傷。

HMGB1作為危險(xiǎn)相關(guān)分子模式分子,是TLR4信號激活的重要配體,前者在永久性大腦中動脈栓塞大鼠血清中大量積累〔15,16〕。HMGB1與跨膜受體RAGE及TLR4結(jié)合可激活核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB,增強(qiáng)炎癥反應(yīng)〔17〕。桃紅四物湯可通過抑制HMGB1/TLR4/NF-κB通路來降低NLRP3炎癥小體的激活水平,從而抑制大腦中動脈閉塞再灌注大鼠的細(xì)胞焦亡〔17〕。多效性肽phoenixin 14通過抑制HMGB1/TLR4通路激活來減少大腦中動脈栓塞模型大鼠腦梗死體積及小膠質(zhì)細(xì)胞活化,從而起到腦保護(hù)作用〔18〕。金雀異黃素能通過下調(diào)HMGB1和其受體TLR4及IL-1β表達(dá)來促進(jìn)糖尿病小鼠神經(jīng)傷口的愈合〔8〕。本研究結(jié)果表明,金雀異黃素能夠有效抑制腦卒中大鼠HMGB1/TLR4通路的激活。除此之外,本研究結(jié)果還表明,金雀異黃素可能通過抑制HMGB1/TLR4通路來抑制腦卒中大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞激活,促進(jìn)M1/M2型的轉(zhuǎn)變。

綜上,金雀異黃素可抑制腦卒中大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞激活,促進(jìn)其M1向M2型的轉(zhuǎn)變,以此改善腦損傷,其作用機(jī)制可能與金雀異黃素抑制HMGB1/TLR4通路有關(guān)。本研究不僅為腦卒中治療機(jī)制的研究提供參考,還對金雀異黃素在腦卒中作用機(jī)制的研究具有重要意義,但由于時(shí)間及模型數(shù)量的限制,未進(jìn)行更加深入的探究,但在接下來會繼續(xù)對研究內(nèi)容進(jìn)行補(bǔ)充。