基于TXNIP/NLRP3炎性小體通路研究清熱涼血方對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎大鼠腸黏膜屏障的保護(hù)作用

范咸玉 鄒建文 陳旭 吳剛

(都江堰市醫(yī)療中心消化內(nèi)科,四川 成都 611830)

潰瘍性結(jié)腸炎(UC)是一種炎癥性腸疾病,在結(jié)腸中發(fā)生,伴有腹痛、直腸出血和腹瀉,具有發(fā)展為結(jié)直腸癌的風(fēng)險(xiǎn)〔1〕。UC的發(fā)生和發(fā)展涉及的確切機(jī)制尚未完全闡明。許多研究發(fā)現(xiàn),腸道免疫系統(tǒng)受損失衡和腸黏膜屏障損傷可能有助于UC的發(fā)生、發(fā)展〔2〕。不平衡的黏膜免疫系統(tǒng)導(dǎo)致促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生,這又反過(guò)來(lái)導(dǎo)致慢性炎癥、潰瘍及結(jié)腸黏膜病變,誘發(fā)腸屏障損傷,引起腸道菌群移位和內(nèi)毒素血癥〔3〕。核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白(NLRP)3炎性小體已經(jīng)被證實(shí)在UC中具有致病作用,這使得NLRP3炎性小體成為UC治療的潛在靶標(biāo)〔4〕。清熱涼血方(QRLX)是在中醫(yī)理論指導(dǎo)下結(jié)合多年臨床經(jīng)驗(yàn)及現(xiàn)代藥理學(xué)研究而形成的自擬方藥,由白頭翁、紫草、生地榆、黃連、黃柏、槐角、白芍、甘草組成,具有清熱解毒,涼血活血的功效。現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)QRLX具有增強(qiáng)免疫、抗炎、抗氧化等多種藥理作用〔5〕,吳超等〔6〕發(fā)現(xiàn)QRLX可清除氧自由基,抑制脂質(zhì)過(guò)氧化,減少急性放射性腸炎大鼠結(jié)腸黏膜損傷。而QRLX是否對(duì)UC有保護(hù)作用尚不明確,本研究旨在探究QRLX對(duì)UC大鼠腸黏膜損傷的影響與機(jī)制。

1 材料和方法

1.1動(dòng)物 從北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司〔許可證號(hào)為SCXK(京)2019-0009〕購(gòu)入78只雄性SD大鼠,8周齡,體質(zhì)量(190±10)g。所有大鼠在溫度(24±2)℃,濕度(55±5)%的環(huán)境下飼養(yǎng),并保持12 h光/暗循環(huán)。

1.2試劑 QRLX:白頭翁、紫草、生地榆各30 g、黃連、黃柏、槐角、白芍、甘草各15 g。以上藥材均為中藥配方顆粒,購(gòu)自華潤(rùn)三九醫(yī)藥股份有限公司;使用時(shí)將所有配方顆粒混勻后加入蒸餾水配制成混懸液。柳氮磺吡啶(SASP)腸溶片(上海信誼天平藥業(yè)有限公司);葡聚糖硫酸鈉(DSS,分子量:36 000～50 000 Da,貨號(hào):9011-18-1,美國(guó)MP Biomedicals);異硫氰酸熒光素-葡聚糖(FITC-dextran,美國(guó)Sigma-Aldrich公司,貨號(hào):53471-1G);大鼠內(nèi)毒素(ET,RA20354)、D乳酸(LA,RA20770)及二胺氧化酶(DAO,RA20028)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒(武漢貝茵萊生物科技有限公司);蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒(上海碧云天生物科技公司,C0105S);兔抗緊密連接蛋白(ZO)-1(ab96587)和occludin(ab216327)、硫氧還蛋白相互作用蛋白(TXNIP,ab188865)、NLRP3(ab263899,英國(guó)Abcam公司);小鼠抗切割型半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶(cl-caspase)-1 p10(sc-56036)、cl-caspase-1 p20(sc-398715)抗體(美國(guó)Santa Cruz公司)。

1.3造模與分組 采用DSS誘導(dǎo)UC大鼠模型〔7,8〕。具體操作為在造模大鼠飲用水中加入5%(W/V)的DSS,連續(xù)7 d,隨后提供常規(guī)飲用水3 d,對(duì)照組接受常規(guī)飲用水。模型建立后,觀察大鼠一般狀態(tài),并隨機(jī)選取6只大鼠取結(jié)腸組織進(jìn)行HE染色,觀察模型是否成功。結(jié)果顯示造模大鼠精神萎靡、倦怠少動(dòng)、食欲減退同時(shí)出現(xiàn)便血、腹瀉現(xiàn)象,腸黏膜上皮細(xì)胞水腫,絨毛兩邊上皮成塊脫落,有明顯潰瘍,且大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn),說(shuō)明模型制備成功。將造模大鼠分為UC組、SASP組(270 mg/kg)、清熱涼血方低(QRLX-L,14.8 g/kg)、中(QRLX-M,29.6 g/kg)、高劑量組(QRLX-H,59.2 g/kg),每組12只;另取12只大鼠為對(duì)照(Control)組。分組完成后,Control組和UC組不進(jìn)行藥物干預(yù),僅灌胃蒸餾水;SASP組和QRLX各劑量組灌胃相應(yīng)劑量的藥物,每天分早晚2次給藥,共給藥2 w。

1.4取材及指標(biāo)檢測(cè)

1.4.1腸道滲透性檢測(cè) 在末次給藥20 h時(shí),在每組中選取6只大鼠,灌胃FITC-dextran(PBS溶解,灌胃劑量440 mg/kg),4 h后,經(jīng)眼眶靜脈取血并離心取血清,用熒光分光光度計(jì)(激發(fā)波長(zhǎng)485 nm,發(fā)射波長(zhǎng)528 nm)測(cè)量血清吸光度值。

1.4.2血漿腸屏障功能受損標(biāo)志物DAO活性、D-LA、ET含量測(cè)定 給藥結(jié)束24 h后,戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉剩余6只大鼠,取血2 ml放入普通肝素抗凝管中,另取1 ml放入無(wú)熱原的ET測(cè)定專用管中,于4 ℃冰箱中放置2 h。離心(3 000 r/min,5 min)取血漿,檢測(cè)血漿DAO活性、D-LA、ET水平。

1.4.3HE染色觀察結(jié)腸組織病理學(xué)變化 取血完成后,取部分結(jié)腸組織固定在4%多聚甲醛中,石蠟包埋、切片,進(jìn)行蘇木素和伊紅染色,光學(xué)顯微鏡下觀察結(jié)腸組織形態(tài)學(xué)變化。

1.4.4ELISA檢測(cè)結(jié)腸組織中白細(xì)胞介素(IL)-1β、IL-18含量 另取部分結(jié)腸組織,加生理鹽水研磨制備10%組織勻漿液,ELISA檢測(cè)結(jié)腸組織勻漿中IL-1β、IL-18含量。

1.4.5免疫組化法觀察腸屏障功能相關(guān)蛋白o(hù)ccludin、ZO-1的表達(dá) 取1.4.3石蠟包埋的結(jié)腸組織切片,抗原修復(fù)后,4 ℃下與occludin、ZO-1一抗(1∶100)孵育過(guò)夜,二抗顯色后于光學(xué)顯微鏡下觀察occludin、ZO-1陽(yáng)性表達(dá)情況,用Image pro-Plus(IPP)6.0計(jì)算平均光密度(AOD)。

1.4.6Western印跡檢測(cè)TXNIP/NLRP3通路相關(guān)蛋白表達(dá) RIPA裂解液提取結(jié)腸組織總蛋白,十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離等量(30 μg)蛋白樣品,經(jīng)轉(zhuǎn)膜、封閉后,將膜在4 ℃下與一抗(TXNIP、NLRP3、cl-caspase-1 p10、cl-caspase-1 p20、β-actin,1∶1 000稀釋)孵育過(guò)夜,隔日,洗去一抗,將膜在室溫下與二抗(1∶5 000)孵育2 h,顯影,ImageJ軟件對(duì)蛋白條帶灰度值進(jìn)行分析。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS22.0軟件進(jìn)行方差分析和Tukey檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1各組腸道滲透性比較 與Control組〔(224.16±28.51)ng/ml〕相比,UC組血清FITC-dextran濃度〔(579.25±34.82)ng/ml,P<0.05〕顯著升高;與UC組相比,SASP組、QRLX-H組、QRLX-M組、QRLX-L組血清FITC-dextran濃度明顯降低〔(386.37±32.35)、(391.62±36.80)、(484.30±41.56)、(521.24±50.13)ng/ml,均P<0.05〕,且QRLX各劑量組呈一定的劑量依賴性;與SASP組相比,QRLX-H組血清FITC-dextran濃度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.2各組血漿DAO、D-LA、ET水平 與Control組相比,UC組DAO活性、D-LA、ET水平明顯升高(P<0.05);與UC組相比,SASP組、QRLX-H組、QRLX-M組上述指標(biāo)明顯降低(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組血漿DAO、D-LA、ET水平比較

2.3各組結(jié)腸組織病理學(xué)變化 Control組結(jié)腸未見(jiàn)明顯病理?yè)p傷;UC組腸黏膜水腫變薄,絨毛兩邊上皮成塊脫落,大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn),腸黏膜固有層內(nèi)腺體有灶性壞死,形成糜爛點(diǎn);SASP組、QRLX-H組、QRLX-M組病理?yè)p傷明顯改善,可見(jiàn)部分腸黏膜上的絨毛輕度腫脹,腸黏膜輕微脫落,少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn),潰瘍?cè)顢?shù)量及潰瘍面積減少;其中以SASP組、QRLX-H組改善效果更為明顯。見(jiàn)圖1。

圖1 各組結(jié)腸組織形態(tài)學(xué)(HE染色,×100)

2.4各組結(jié)腸組織中IL-1β、IL-18水平 與Control組相比,UC組IL-1β、IL-18水平明顯升高(P<0.05);與UC組相比,SASP組、QRLX-H組、QRLX-M組IL-1β、IL-18水平明顯降低(P<0.05),且QRLX各組存在一定劑量依賴性;與SASP組相比,QRLX-M組、QRLX-L組結(jié)腸勻漿中IL-1β、IL-18水平明顯升高(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 各組結(jié)腸組織中IL-1β、IL-18水平、occludin、ZO-1及TXNIP/NLRP3通路相關(guān)蛋白表達(dá)比較

2.5各組腸屏障功能相關(guān)蛋白o(hù)ccludin、ZO-1表達(dá) 與Control組相比,UC組結(jié)腸occludin、ZO-1蛋白分布不均且染色變淡,表達(dá)顯著減少(P<0.05);與UC組相比,SASP組、QRLX-H組、QRLX-M組結(jié)腸occludin、ZO-1蛋白分布較為均勻,表達(dá)明顯升高(P<0.05),且QRLX各組存在一定劑量依賴性;與SASP組相比,QRLX-M組、QRLX-L組occludin、ZO-1蛋白表達(dá)明顯降低(P>0.05)。見(jiàn)表2、圖2。

圖2 各組結(jié)腸組織occludin、ZO-1蛋白(免疫組織染色,×200)

2.6各組結(jié)腸組織TXNIP/NLRP3通路相關(guān)蛋白的表達(dá) 與Control組相比,UC組TXNIP、NLRP3、cl-caspase-1 p10、cl-caspase-1 p20表達(dá)明顯升高(P<0.05);與UC組相比,SASP組、QRLX-H組、QRLX-M組上述蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.05);與SASP組比較,QRLX-L組上述蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.05)。見(jiàn)表2、圖3。

3 討 論

UC的治療包括外科治療和藥物治療,除了常規(guī)使用抗炎藥美沙拉嗪和SASP、糖皮質(zhì)激素及氨基水楊酸外,許多新藥如抗腫瘤壞死因子抗體也被廣泛應(yīng)用于臨床實(shí)踐〔9,10〕。然而,UC在治療后的一定時(shí)間內(nèi)常出現(xiàn)復(fù)發(fā)。

中醫(yī)學(xué)將UC中歸屬于“痢疾”“泄瀉”“腸癖”等范疇,其發(fā)病與“濕熱”“熱毒”密切相關(guān),病機(jī)主要為濕熱蘊(yùn)結(jié)于腸道,在腸道相互裹挾,導(dǎo)致腸道傳導(dǎo)失司、氣血壅滯、腸絡(luò)受損而致下痢膿血〔4,6〕。QRLX由白頭翁、紫草、生地榆、黃連、黃柏、槐角、白芍、甘草組成。其中白頭翁歸大腸經(jīng),善清胃腸濕熱;紫草甘寒,涼血活血清熱解毒,4者共為君藥,可清熱涼血解毒。生地榆治療便血效果顯著,可清熱、涼血、生肌;黃連可除脾胃腸道濕熱,黃柏主入下焦,槐角清熱瀉火,四者共為臣藥引藥直達(dá)腸道。甘草、白芍可緩熱毒所致陰津虧損,甘草還可調(diào)和藥性,以上諸藥合用共奏清熱涼血解毒的功效。現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)白頭翁可抑制炎癥反應(yīng),改善UC患者結(jié)腸黏膜潰瘍程度〔11〕;且其主要成分白頭翁皂苷B4能抑制炎癥因子IL-6、TNF-α的釋放,有顯著地保護(hù)及修復(fù)實(shí)驗(yàn)性UC大鼠潰瘍的作用〔12〕。紫草中的紫草素具有顯著的抗炎、調(diào)節(jié)免疫作用〔13,14〕;且地榆、黃柏、黃連及其主要成分小檗堿均可降低炎癥反應(yīng),促進(jìn)腸道黏膜屏障功能改善,是治療UC方藥中常用的中藥〔15,16〕。以上研究提示QRLX具有治療UC的潛力。

本研究說(shuō)明,UC大鼠腸黏膜出現(xiàn)明顯損傷;血漿ET、D-LA和DAO水平是腸屏障功能受損的標(biāo)志物,正常情況下在血漿中含量很少,當(dāng)腸道屏障功能損害時(shí),腸道內(nèi)ET、DAO、D-LA大量釋放入血〔17〕;腸occludin和ZO-1是腸上皮細(xì)胞的骨架結(jié)構(gòu),構(gòu)成腸黏膜的第一道防線,維持腸屏障功能的完整性〔18〕。本研究結(jié)果說(shuō)明,UC大鼠出現(xiàn)明顯的腸屏障功能障礙,提示QRLX可顯著減輕UC大鼠的腸黏膜損傷,改善大鼠腸屏障功能障礙。

IL-1β和IL-18是UC的重要致病因素,其分泌受激活的caspase-1的調(diào)節(jié),而caspase-1的成熟及釋放受NLRP3炎癥小體的嚴(yán)格調(diào)控〔19〕。NLRP3炎性小體是一種多蛋白復(fù)合物,由NLRP3蛋白、凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白(ASC)與前半胱天冬酶(pro-caspase)-1組成。NLRP3蛋白是NLRP3炎性小體的活性核心;研究已經(jīng)證實(shí),NLRP3炎性小體在UC中被激活〔4〕。TXNIP在細(xì)胞質(zhì)和線粒體中表達(dá),正常情況下,TXNIP以與TRX結(jié)合的形式存在,當(dāng)機(jī)體受到內(nèi)源或外源性刺激時(shí),TRX與TXNIP分離,促使TXNIP與NLRP3結(jié)合,導(dǎo)致NLRP3炎癥小體激活〔20〕;隨后,pro-caspase-1會(huì)裂解產(chǎn)生活性cleaved-caspase-1(p10、p20),并將pro-IL-1β和pro-IL-18裂解為成熟的IL-1β和IL-18,調(diào)控慢性炎癥〔21〕。近年研究發(fā)現(xiàn)TXNIP可能是治療炎癥性腸病的潛在治療靶標(biāo)〔7〕。Jia等〔22〕發(fā)現(xiàn)二甲雙胍可抑制TXNIP表達(dá),阻止了TXNIP與NLRP3的結(jié)合,抑制NLRP3炎性小體的激活,可保護(hù)腸屏障功能免受腸道缺血再灌注損傷并降低氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)。本研究結(jié)果提示,QRLX降低IL-1β和IL-18水平,抑制炎癥反應(yīng)的作用可能是通過(guò)抑制TXNIP/NLRP3炎性小體通路實(shí)現(xiàn)的。