紫草素通過調(diào)控miR-214表達抑制宮頸癌細胞增殖、遷移、侵襲

吳明媛 趙偉 趙遠 毋亞坤 張瀚文

(焦作市人民醫(yī)院,河南 焦作 454000)

宮頸癌主要指發(fā)生在子宮陰道部及宮頸管的惡性腫瘤。一般采用化療、放療治療宮頸癌,但是效果較差,預后不良〔1,2〕。早期宮頸癌常無明顯癥狀和體征,宮頸可光滑或難與宮頸柱狀上皮異位區(qū)別。晚期癥狀根據(jù)癌灶累及范圍出現(xiàn)不同的繼發(fā)性癥狀。如尿頻、尿急、便秘、下肢腫痛等;癌腫壓迫或累及輸尿管時,可引起輸尿管梗阻、腎盂積水及尿毒癥;晚期可有貧血、惡病質(zhì)等全身衰竭癥狀〔3,4〕。紫草素具有抗癌、抗炎、抗菌等作用,臨床也可以用于治療急、慢性肝炎、肝硬化〔5,6〕。紫草素可以抑制腫瘤細胞的增殖,促進細胞凋亡,但其分子機制尚不是很明白〔7〕。本實驗主要探究紫草素對宮頸癌細胞增殖、遷移和侵襲及其miR-214表達的影響。

1 材料與方法

1.1藥物 紫草素購自中國食品藥品檢定研究院,純度>99%。

1.2實驗動物 20只6周齡雌性 BALB/c 裸鼠(每組n=5)購自河南實驗動物中心(中國鄭州)。

1.3材料 宮頸癌細胞株Hela(中國科學院上海細胞庫);胎牛血清(FBS)、DMEM培養(yǎng)基(美國Hyclone公司,批號NXA0544、NZE1147);胰蛋白酶(美國Sigma公司,批號2242B80);MTT試劑(美國Sigma公司,批號1313B12);Transwell小室(美國Corning公司,批20130204)。

1.4儀器 Q5實時定量PCR擴增儀(美國Cell Signaling公司);PTC-200型熱循環(huán)儀(美國Bio-Rad公司);5415D型離心機(德國Eppendorf公司);F-4500型熒光定量檢測儀(日本HITACHI公司)。

1.5藥物處理 使用二甲基亞砜(DMSO)溶解紫草素,并使DMSO的終質(zhì)量濃度小于0.01 g/L,-20 ℃避光保存。

1.6細胞培養(yǎng)與分組 宮頸癌細胞Hela用含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng),待細胞生長至80%融合度時,用0.25%胰蛋白酶消化,取對數(shù)生長期細胞進行實驗。用不同濃度(4、8、16、32、64 μmol/L)的紫草素處理Hela細胞,記為4 μmol/L組、8 μmol/L組、16 μmol/L組、32 μmol/L組、64 μmol/L組;正常培養(yǎng)的細胞作為對照(Con)組。將miR-NC、miR-214轉(zhuǎn)染至Hela細胞,記為miR-NC組、miR-214組;將anti-miR-NC、anti-miR-214轉(zhuǎn)染至Hela細胞,再用64 μmol/L紫草素處理,記為紫草素+anti-miR-NC組、紫草素+anti-miR-214組。

1.7MTT檢測細胞增殖 細胞培養(yǎng)24 h,每孔加入20 μl MTT溶液,4 h后,加入150 μl/孔 DMSO溶液,反應10 min,把酶標儀的波長設置為490 nm,檢測各孔的吸光度(OD)值。

1.8平板克隆形成實驗檢測細胞增殖 取細胞1×103個/孔接種于6孔板,直至出現(xiàn)肉眼可見的克隆,終止培養(yǎng),加入4%多聚甲醛固定15 min,分別加入結(jié)晶紫染液染色5 min,磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌,觀察克隆形成數(shù)。

1.9Transwell實驗檢測細胞遷移和侵襲 細胞侵襲實驗:將基質(zhì)膠加入小室的上室,孵育5 h,隨后加入各組細胞(3×104個/孔),在小室的下室加入含有PBS的培養(yǎng)液(600 μl/室),繼續(xù)培養(yǎng)24 h,多聚甲醛固定20 min,0.1%結(jié)晶紫染液染色10 min,計算侵襲細胞數(shù)。細胞遷移實驗:基質(zhì)膠不加入小室的上室,其他操作方法與侵襲實驗一樣。

1.10qPCR檢測miR-214表達 TRIzol試劑提取細胞中總RNA,使用cDNA試劑盒逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,實時熒光定量試劑盒進行熒光定量。miR-214:上游引物 5′-CACTCTATATAGTGTATCTTTC-3′,下游5′-GGCTTTTAGTGTACGTCGTAATG-3′;U6 上游引物 5′-ACGTCACGAGCCGTCTCTCGTGA-3′,下游 5′-GG-CTCCAACGTACCGATCAGTA-3′。使采用2-ΔΔCt方法分析miR-214表達水平。

1.11Western印跡檢測基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2、MMP-9蛋白表達 提取細胞總蛋白質(zhì),用二喹啉甲酸(BCA)試劑盒測量蛋白質(zhì)濃度。15%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白,并將其轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜。室溫條件下,將膜在5%脫脂乳中封閉2 h,然后,將膜與抗MMP-2(1∶1 000稀釋液)、MMP-9(1∶1 000稀釋液)、β-actin(1∶1 000稀釋液)的一抗在4 ℃孵育過夜。次日,將膜與二抗(1∶2 000稀釋度)在室溫下孵育2 h。分析各條帶灰度值。

1.12腫瘤異種移植 裸鼠實驗經(jīng)醫(yī)院動物研究委員會批準。將各組處理過后的細胞(1×107個)皮下注射到 BALB/c 裸鼠中。每7天用卡尺測量腫瘤體積。注射35 d后處死所有小鼠,從所有裸鼠中分離腫瘤標本用于進一步分析。

1.13統(tǒng)計學分析 采用SPSS21.0軟件進行獨立樣本t檢驗和單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1紫草素對宮頸癌Hela細胞增殖的影響 與Con組比較,8、16、32、64 μmol/L紫草素顯著降低細胞OD值和克隆形成數(shù),且呈劑量依賴性(P<0.05)。以64 μmol/L紫草素進行后續(xù)試驗。見表1。

表1 紫草素對宮頸癌Hela細胞增殖的影響

2.2紫草素對宮頸癌Hela細胞遷移和侵襲的影響 與Con組比較,紫草素顯著降低細胞遷移、侵襲數(shù)及MMP-2、MMP-9蛋白表達(P<0.05)。見表2、圖1、圖2。

1～6:Con組、紫草素組、miR-NC組、miR-214組、紫草素+anti-miR-NC組、紫草素+anti-miR-214組圖1 Western印跡檢測各組MMP-2、MMP-9蛋白

圖2 Transwell檢測各組細胞的遷移和侵襲(結(jié)晶紫染色,×200)

表2 紫草素對宮頸癌Hela細胞miR-214表達及遷移和侵襲的影響

2.3紫草素對宮頸癌Hela細胞中miR-214表達的影響 與Con組比較,紫草素顯著升高miR-214表達水平(P<0.05)。見表2。

2.4miR-214過表達對宮頸癌Hela細胞增殖的影響 與miR-NC組比較,miR-214組miR-214表達水平顯著升高(P<0.05),OD值和克隆形成數(shù)顯著降低(P<0.05)。見表3。

表3 miR-214過表達對宮頸癌Hela細胞增殖、遷移、侵襲的影響

2.5miR-214過表達對宮頸癌Hela細胞遷移和侵襲的影響 與miR-NC組比較,miR-214組miR-214表達水平顯著升高(P<0.05),細胞遷移、侵襲數(shù)及MMP-2、MMP-9蛋白表達顯著降低(P<0.05)。見圖1、圖2、表3。

2.6抑制miR-214表達逆轉(zhuǎn)了紫草素對宮頸癌Hela細胞增殖、遷移和侵襲的影響 與紫草素+anti-miR-NC組比較,紫草素+anti-miR-214組miR-214表達水平顯著降低(P<0.05),OD值和克隆形成數(shù)顯著升高(P<0.05),細胞遷移、侵襲數(shù)及MMP-2、MMP-9蛋白表達顯著升高(P<0.05)。見圖1、圖2、表4。

表4 抑制miR-214表達逆轉(zhuǎn)了紫草素對宮頸癌Hela細胞增殖、遷移和侵襲的影響

2.7紫草素對宮頸癌Hela細胞體外移植瘤的影響 與Con組〔(1 002.00±4.16)/mm3〕比較,紫草素組腫瘤體積〔(586.67±3.48)/mm3〕顯著減小(P<0.05);與紫草素+anti-miR-NC組〔(580.00±4.73)/mm3〕比較,紫草素+anti-miR-214組腫瘤體積〔(839.67±2.33)mm3〕顯著變大(n=5,P<0.001)。見圖3。

1～4:Con組、紫草素組、紫草素+anti-miR-NC組、紫草素+anti-miR-214組圖3 各組35 d時Hela細胞體外移植瘤

3 討 論

紫草素來源于紫草科植物紫草的根。紫草素通過磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)信號通路可以抑制皮膚鱗狀細胞癌細胞生長〔8〕。紫草素可以促進含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(caspase)-9活化從而誘導大腸癌細胞凋亡〔9〕。二甲雙胍和紫草素可以抑制人鼻咽癌細胞CNE-2Z增殖并促進凋亡〔10〕。紫杉醇聯(lián)合紫草素對U87腦膠質(zhì)瘤細胞有較好的抑制效果〔11〕。本實驗研究表明,紫草素顯著降低宮頸癌細胞增殖、遷移和侵襲數(shù),對治療宮頸癌有較好的療效。Dan等〔12〕研究表明,β-羥基異戊基紫草素通過PI3K/AKT/雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信號傳導誘導人宮頸癌細胞凋亡。Wang等〔13〕研究表明,紫草素通過PI3K/Akt/mTOR信號通路誘導人宮頸癌HeLa細胞凋亡和自噬。郝臻鳳〔14〕研究表明,紫草素通過調(diào)節(jié)小腦變性相關(guān)蛋白1反義轉(zhuǎn)錄物(ciRS-7)/miR-7/局部黏著斑激酶(FAK)軸抑制宮頸癌侵襲和遷移。楊陽等〔15〕研究表明,紫草素影響宮頸癌SiHa細胞增殖周期。于海榮等〔16〕研究表明,紫草素可以抑制人宮頸癌Hela細胞增殖。miR-214是一種非編碼小RNA,已有研究發(fā)現(xiàn),miR-214在多種腫瘤和癌癥中有表達,并促進或抑制了腫瘤和癌癥的發(fā)生發(fā)展。miR-214在甲狀腺乳頭狀癌患者的血清中高表達,促進了其增殖〔17〕。miR-214與腫瘤的關(guān)系密切〔18〕。miR-214通過靶向β-catenin通路抑制肝癌生長〔19〕。本實驗研究發(fā)現(xiàn),miR-214在宮頸癌中高表達可以抑制細胞的增殖、遷移和侵襲。已有研究宮頸癌的分子機制說明,miR-214對宮頸癌HeLa細胞惡性表型的影響,可以抑制宮頸癌的生長〔20〕。miR-214通過靶定GALNT7抑制宮頸癌細胞的生長和侵襲〔21〕。

本實驗研究結(jié)果說明,紫草素可以通過上調(diào)miR-214表達抑制宮頸癌細胞增殖、遷移和侵襲。有類似的報道,β-羥基異戊酰紫草素通過干預miR-10a-5p影響非小細胞肺癌的發(fā)生發(fā)展〔22〕。本實驗研究結(jié)果說明,紫草素可以通過上調(diào)miR-214表達減小腫瘤體積。有研究顯示紫草素干預miR-130a-5p調(diào)節(jié)軸抑制乳腺癌侵襲遷移〔23〕。