辣椒根腐病生防菌的篩選鑒定及生防作用

李樹江 張韻霞 劉 羽 周闖闖 張芝琴 馮 道 楊友聯 吳 迪 張曉勇*

（1 六盤水師范學院生物科學與技術學院，貴州六盤水 553004；2 六盤水市農業科學研究院，貴州六盤水 553000）

辣椒根腐病是典型的土傳病害，可引起辣椒根系和近地面莖稈木質部、韌皮部壞死，導致辣椒不能輸送水分和營養物質，在發病初期植株葉片會出現白天萎蔫，晚上恢復狀態的現象，發病后期地下部分根系和莖稈全部壞死，地上部分干枯死亡，引起辣椒嚴重減產（郝蓉蓉 等，2015）。多種病原菌可引起辣椒根腐病，其中鐮刀菌屬（Fusarium）病原菌最多，如串珠鐮刀菌（F.moniliforme）、半裸鐮刀菌（F.semitectum）、茄鐮刀菌（F.solani）、尖孢鐮刀菌（F.oxysporum）、爪哇鐮刀菌（F.javanicum）、擬枝孢鐮刀菌（F.sporotrichioides）、黃色鐮刀菌（F.culmorum）、 木賊鐮刀菌（F.eguiseti）、短肥鐮刀菌（F.brachygibbosum）和藤倉鐮刀菌（F.fujikuroi）（陳彥 等，2008；方曉翠，2016；Li et al.，2018；Naz et al.，2018）等，存在著明顯的多樣性。目前農業生產上主要運用農業防治和化學防治方法來防控辣椒根腐病，但長期大量施用化學殺菌劑極易造成土壤污染、農作物農殘超標、引起土壤菌群失調和提高病原菌的抗藥性等諸多問題，最終加重土壤的連作障礙（姜飛 等，2010；張秀玲，2013）。

生物防治是近年研究的熱點，相較化學防治方法，生物防治具有生產安全、健康環保、無公害等優點（李凱和袁鶴，2012）。近年來國內外針對辣椒根腐病的生物防治技術開展了大量研究，如解淀粉芽孢桿菌（Bacillusamyloliquefaciens）、枯草芽孢桿菌（B.subtilis）、黃綠木霉（Trchoderma aureoviride）和短密木霉菌（T.brevicompactum）等相關微生物活體菌劑可通過與病原菌營養競爭、微寄生、分泌抑菌物質以及誘導植物產生抗性等對辣椒根腐病發揮良好的防治效果，已被廣泛運用于農業生產中（高亮，2015；朱萍萍 等，2015；李曉宇，2018；申君 等，2022）。

本試驗擬開展辣椒根腐病高效生防菌的篩選，通過形態學、分子生物學方法對生防菌進行鑒定，對生防菌的抑菌活性和對辣椒根腐防治效果進行檢測，并探究生防菌最佳培養條件，以期為辣椒根腐病生物防治提供理論及技術支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試辣椒根腐病病原菌為六盤水地區辣椒根腐病主要種茄鐮刀菌（F.solani），由六盤水師范學院微生物課題組分離及鑒定。將茄鐮刀菌單點接種于PDA 培養基內，在25 ℃條件下培養3 d 進行活化。

供試辣椒品種為澳冠8899 線椒（河北省青縣艾森蔬菜優良品種推廣中心選育）。

1.2 生防菌株的分離和篩選

試驗于2021 年5—12 月在六盤水師范學院基礎生物學實驗中心開展。從健康辣椒根際土壤和腐殖質中分離辣椒根腐病生防菌。將土樣放置于室內自然風干后，隨機稱取1.0 g 土樣加入盛有9 mL無菌水的小三角瓶中，加入10 粒直徑為2 mm 的滅菌玻璃珠，于150 r · min-1、25 ℃的搖床中震蕩60 min 獲得1 × 10-1倍的土壤懸濁液，再對懸濁液進行梯度稀釋后獲得1 × 10-4倍的稀釋液，靜置10 min 后取100 μL 上清液，在雙抗PDA（100 mL 的PDA 培養基滅菌冷卻至60 ℃時分別加入10 mg 硫酸鏈霉素和青霉素并混勻）平板上涂布均勻后置于25 ℃下培養，24 h 后用無菌解剖刀從菌落邊緣挑取菌塊至PDA 平板中進行1～2 次純化，獲得生防菌待篩菌株（陳夢 等，2021）。

以辣椒根腐病病原菌茄鐮刀菌（F.solani）作為指示菌，以三點對峙培養法篩選對茄鐮刀菌生長具有高效抑制效果的菌株。用孔徑4 mm 無菌打孔器打取活化的茄鐮刀菌菌落邊緣菌塊，接種于直徑9 cm 的PDA 平板的中央，在中央菌塊的上、左、右3 個方向且距離培養皿邊緣1 cm 處分別接種待篩菌株直徑為4 mm 的菌塊。于25 ℃、自然光照下培養，待指示菌下側菌絲長至平板的邊緣后，測量對峙側的菌落半徑（mm），并計算生防菌對病原菌的抑制率（朱萍萍 等，2015），3 次重復。

抑菌率 = （對照側半徑-對峙側半徑）/對照側半徑×100%

在生防菌與茄鐮刀菌菌絲對峙區域斜插1 片滅菌的蓋玻片，培養3 d 后取下蓋玻片制作臨時裝片，在顯微鏡下觀察生防菌對茄鐮刀菌的重寄生（hyperparasitism）情況。

1.3 生防菌株的鑒定

1.3.1 生防菌形態學鑒定 將生防菌接種于PDA平板上，25 ℃、自然光照下培養，待菌落表面產孢后，以乳酸酚棉蘭染液為載浮劑制作臨時裝片，用奧林巴斯（Olympus）BX53 顯微成像系統拍攝生防菌形態特征并測量大小。

1.3.2 生防菌分子鑒定 用無菌刀片刮取培養3 d 的生防菌菌絲，用改良的CTAB 法提取DNA（張穎慧 等，2008）。擴增的目的序列為內部轉錄間隔區（ITS），使用ITS 通用引物ITS4（TCCTCCGCTTATTGATATGC）和ITS5（GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG）（Nishikawa &Nakashima，2020）對待測生防菌ITS 序列進行PCR 擴增，擴增條件為94 ℃預變性3 min，94 ℃變性30 s，50 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，循環35 次后于72 ℃延伸7 min（Woudenberg et al.，2013）。擴增產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，由北京擎科生物科技有限公司進行純化和雙向測序。將所得序列在GenBank 數據庫中進行對比，使用軟件MEGA 11.0 采用NJ 法構建系統發育樹，確定生防菌的分類地位。

1.4 生防菌發酵代謝產物對病原菌的抑制效果檢測

在250 mL 的三角瓶里加入100 mL PD 液體培養基（去皮馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，水1 000 mL，自然pH），接入3 塊直徑為4 mm 的生防菌菌塊，于25 ℃、160 r · min-1下震蕩培養7 d 獲得生防菌發酵液；將發酵液于10 000 r · min-1下離心10 min 后吸取上清液，再用0.22 μm 無菌微孔濾膜過濾2 次，得到無菌的發酵代謝產物粗溶液。待融化的PDA 培養基冷卻至60 ℃后依次在其中分別加入體積分數為5%、10%、15%、20%的生防菌無菌代謝產物溶液，充分搖勻后倒成直徑9 cm 平板，以不加代謝產物的PDA 平板作為對照。在上述平板正中央接種1 塊4 mm 的茄鐮刀菌小菌塊，于25℃、自然光照下培養，待對照中茄鐮刀菌長滿平板時用十字交叉法測量各處理的菌落生長直徑，計算代謝產物對茄鐮刀菌菌絲生長的抑制率（張曉勇等，2021），3 次重復。

抑制率 = （對照菌落直徑-處理菌落直徑）/對照菌落直徑× 100%

1.5 生防菌對辣椒根腐病的防治效果測定

在100 mL 的PD 液體培養基內分別接種3 塊直徑為4 mm 的茄鐮刀菌和生防菌菌塊，于25 ℃、160 r · min-1下震蕩培養3 d 獲得病原菌茄鐮刀菌和生防菌液體菌種；將茄鐮刀菌和生防菌液體菌種用無菌水分別稀釋10 倍后獲得茄鐮刀菌菌液和生防菌菌液。

盆栽試驗于2022 年3—8 月在六盤水市農業科學研究院科研溫室開展。選取健康、飽滿的澳冠8899 線椒種子，用1%次氯酸鈉浸泡1 min，無菌水清洗5 次后播種至經高溫滅菌的草炭土中，放置在25 ℃、光照時間10 h · d-1的光照室內進行隔離培養。待辣椒幼苗株高長至15 cm 時移栽至盛有滅菌草炭土的16 cm × 18 cm 育苗缽內，每缽6 株。待幼苗緩苗后根部接種生防菌（表1），測定生防菌對辣椒根腐病的防治效果和安全性。

表1 生防菌株對辣椒根腐病防治效果測定處理設置

每個處理設置5 次重復，接種后置于25 ℃、自然光照條件下進行培養。15 d 后統計辣椒植株根腐病病株數，計算病株率（%）；并采用0～9 級標準統計辣椒植株根腐病發病級別，計算病情指數（曲春鶴 等，2012）。

辣椒根腐病發病級別：0 級，根系正常生長；1 級，部分須根壞死變褐色；3 級，須根和主根部分壞死變褐色；5 級，壞死根系占30%～50%，植株葉片輕度萎蔫，傍晚可恢復；7 級，壞死的根系占50%～80%，植株地上部分萎蔫且不可恢復；9級，根系全部壞死并擴展至近地面莖部，地上部分全株枯萎。

病情指數 = ∑（各級病株數×病害級值）/（各處理總株數× 9）

相對防效 = （對照病情指數-處理病情指數）/對照病情指數× 100%

1.6 生防菌培養特性測定

1.6.1 pH 對生防菌菌絲生長量的影響 用1.0 mol ·L-1的HCl 或NaOH 將PD 液體培養基pH 值調節為3、4、5、6、7、8、9、10、11，然后分裝入250 mL 三角瓶中，每瓶100 mL；在每瓶培養基中接種3 塊直徑4 mm 的生防菌菌塊，于25 ℃、160 r ·min-1中震蕩培養4 d。將紗布裁剪成10 cm × 10 cm小塊，放入烘箱中烘至恒重后稱量紗布質量（g）；將培養后的生防菌菌液倒在3 層紗布上進行過濾，菌絲和紗布一起放于60 ℃下烘干至恒重并稱量總質量（g），總質量減去紗布質量即為菌絲生長量（g）。

1.6.2 溫度對生防菌菌絲生長的影響 在100 mL的pH 值為7.0 的PD 液體培養基中接種3 塊直徑4 mm 的生防菌菌塊，并置于10、15、20、25、30、35 ℃和40 ℃的搖床中，160 r · min-1震蕩培養4 d，菌絲生長量測定方法同1.6.1。

1.6.3 不同碳源對生防菌菌株生長的影響 以察氏液體培養基（硝酸鈉3.0 g，磷酸氫二鉀1.0 g，硫酸鎂0.5 g，氯化鉀0.5 g，硫酸亞鐵0.01 g，蔗糖30.0 g，蒸餾水1 000 mL）（龍巧芳 等，2022）為基礎液體培養基，將其中的蔗糖分別同質量替換為淀粉、葡萄糖、果糖、麥芽糖、乳糖、甘油，并將pH 值調節至7，在100 mL 的不同碳源液體培養基中分別接種4 塊直徑4 mm 的生防菌菌塊，于160 r ·min-1、25 ℃中震蕩培養4 d。菌絲生長量測定方法同1.6.1。

1.6.4 不同氮源對生防菌菌株生長的影響 以察氏液體培養基為基礎液體培養基，將其中的硝酸鈉分別同質量替換為尿素、蛋白胨、硝酸銨、酵母粉、牛肉膏和氯化銨，pH 值調節至7，在分別為100 mL 的不同氮源液體培養基中接種4 塊直徑4 mm的生防菌菌塊，于160 r · min-1、25 ℃中震蕩培養4 d。菌絲生長量測定方法同1.6.1。

1.7 數據處理與分析

使用DPS v7.05 軟件進行方差分析，采用Microsoft Excel 2016 軟件進行統計圖繪制。

2 結果與分析

2.1 生防菌株的分離和篩選

從辣椒根際土壤和有機質土壤中分離出17 個真菌菌株，與茄鐮刀菌（F.solani）進行三點平板對峙培養，篩選出2 株對茄鐮刀菌生防效果達70%以上的菌株，其中編號為M20210527-2 的菌株抑制率高達79.29%，并能快速占據平板的大部分空間，對茄鐮刀菌菌絲生長形成高效的抑制（圖1-A、1-B）。通過插片培養，并于40×10 顯微鏡下進行觀察，M20210527-2 菌株的菌絲能夠纏繞重寄生于茄鐮刀菌菌絲上，抑制茄鐮刀菌菌絲生長（圖1-C）。

圖1 生防菌株M20210527-2 對茄鐮刀菌的抑制效果及生防特征

2.2 生防菌株的鑒定

2.2.1 形態學鑒定 生防菌株M20210527-2 在PDA 培養基上生長快速，生長速率為30 mm · d-1，前期菌落白色，蓬松，有明顯的放射狀紋，中央略隆起，老化產孢后表面呈青綠色（圖2-A）。分生孢子梗直接在頂端形成瓶梗或二次分枝（圖2-B）；瓶梗輪狀排列，安瓿瓶狀，直或略彎曲，基部膨大，頂端尖細，長6.6～18.0 μm，寬2.0～4.7 μm；分生孢子單生，球形或卵圓形，在瓶梗頂端聚合成分生孢子頭，大小（2.5～3.5）μm ×（2.2～3.4）μm，平均（3.0 ± 0.2）μm × （2.6 ± 0.2）μm（n= 40）（圖2-C、2-D）。初步將菌株M20210527-2 鑒定為哈茨木霉（Trichodermaharzianum）。

圖2 M20210527-2 的菌株形態結構特征

2.2.2 分子系統學鑒定 將菌株M20210527-2的ITS 序列輸入GenBank 的BLATS 中進行同源性對比，下載17 個模式菌株或公認菌株的ITS序列，構建NJ 系統發育樹，如圖3 所示，菌株M20210527-2 與哈茨木霉TrichodermaharzianumCRC32、CRC7 和AR75 以100% 的支持率聚為一支，且無支長差異。結合形態學特征和分子生物學分析，將菌株M20210527-2 鑒定為哈茨木霉（Trichodermaharzianum）。

圖3 基于ITS 序列構建的NJ 系統發育樹

2.3 生防菌發酵代謝產物對病原菌的抑制效果

菌株M20210527-2 發酵代謝產物顯著抑制茄鐮刀菌菌絲生長，菌落直徑隨代謝產物添加濃度的增大而顯著減小（圖4、表2），體積分數為15%和20%時，對茄鐮刀菌抑制率達到55.97%和75.51%（表2）。說明菌株M20210527-2 代謝產物對茄鐮刀菌具有顯著的抑制作用。

圖4 菌株M20210527-2 發酵產物對茄鐮刀菌菌絲生長的影響

表2 菌株M20210527-2 發酵產物對茄鐮刀菌菌絲的抑制效果

2.4 生防菌對辣椒根腐病防治效果

盆栽試驗結果表明（表3），先接種生防菌株M20210527-2，7 d 后接種辣椒根腐病病原菌（處理2）病株率和病情指數均顯著低于先接種辣椒根腐病病原菌，7 d 后接種生防菌株M20210527-2（處理1），相對防效高達94.25%，說明生防菌株M20210527-2 對辣椒根腐病預防效果最佳，發病前使用可顯著降低辣椒根腐病病株率和發病程度。病原菌侵染后再接種生防菌M20210527-2 雖可顯著降低辣椒根腐病發病程度，但仍有56.67%的植株發病，說明其防治根腐病效果一般。單獨接種生防菌株M202100527-2（處理3）的辣椒植株未發病，說明該菌株對辣椒根部無致病性，安全性好。

表3 生防菌株M20210527-2 對辣椒根腐病的防治效果

2.5 不同pH 和溫度對生防菌菌絲生長的影響

不同pH 和溫度對生防菌株M20210527-2菌絲生長量的影響達到顯著水平（圖5），菌株M20210527-2 在pH 值6～7（圖5-A）、溫度為25℃時（圖5-B）菌絲生長量顯著高于其他處理；在以蔗糖、淀粉和葡萄糖為碳源時菌絲生長量顯著高于其他碳源處理，果糖和麥芽糖次之，甘油最差（圖5-C）；在以蛋白胨、酵母粉和牛肉膏為氮源時菌絲生長量最大，硝酸鈉、硝酸銨、氯化銨次之，尿素最差（圖5-D）。說明菌株M20210527-2 最佳培養pH 值為6～7，最佳培養溫度為25 ℃，最適生長碳源為蔗糖、淀粉和葡萄糖，最適氮源為蛋白胨、酵母粉和牛肉膏。

圖5 不同pH（A）、溫度（B）、碳源（C）和氮源（D）對生防菌M20210527-2 菌絲生長的影響

3 討論與結論

木霉屬（Trichoderma）真菌廣泛分布于植物根際土壤、體表和組織內部，其中很多類群對鐮孢菌屬真菌具有抑制、重寄生、空間和營養競爭作用等（Mendoza et al.，2015；王丹 等，2021）。梁曉潔等（2020）研究表明木霉菌在植物根際土壤中的豐度與植物抗土傳病害能力呈現正相關關系。哈茨木霉（T.harzianum）是木霉屬中拮抗能力最突出、抗菌譜最廣的真菌之一，對鐮刀菌屬（Fusarium）（Srivastava et al.，2010）、疫霉屬（Phytophthora）（Fatima et al.，2015）、輪枝菌屬（Verticillium）和絲核菌屬（Rhizoctonia）（Santamarina & Rosello，2006）等的病原真菌具有較強的拮抗能力。本試驗中，哈茨木霉M20210527-2 菌絲能夠纏繞重寄生于茄鐮刀菌菌絲上吸取茄鐮刀菌菌絲的營養，并能快速爭奪病原菌的生長空間而起到顯著的抑菌效果。

本試驗中，哈茨木霉M20210527-2 的發酵產物還能顯著抑制茄鐮刀菌的生長，說明哈茨木霉還能向外分泌高活性抑菌物質。哈茨木霉分泌的低分子量次級代謝產物如丁烯酸內酯類、2，5-二叔丁基酚、鄰苯二甲酸二叔丁酯、鄰苯二甲酸二異丁酯、十八碳酸甲酯等對很多真菌生長具有強烈抑制作用（Reino et al.，2008；沙莎 等，2013；楊立賓 等，2013）。

本試驗結果表明，哈茨木霉M20210527-2對辣椒根腐病病原菌茄鐮刀菌的抑制率達到了79.29%，對辣椒根腐病的相對防效也高達94.25%，具有良好的應用前景。哈茨木霉除了其突出的病原菌拮抗、抑菌和重寄生性能，還能改善土壤微生物菌群結構，降低病原菌豐度和提高農作物抗病性，可有效緩解土壤連作障礙，降低土傳病害的發生程度（董瑞利 等，2013；Bader et al.，2020）；哈茨木霉還對高鹽、干旱、低溫和低營養等極端環境具有較強的耐受性，擴大了其田間病害防治的應用范圍（唐永慶 等，2008；朱萍萍 等，2015）。

綜上所述，哈茨木霉M20210527-2 通過快速競爭性抑制、重寄生和分泌抑菌活性成分等多種途徑，可以強烈抑制辣椒根腐病病原菌茄鐮刀菌生長。盆栽試驗表明該生防菌可顯著降低辣椒根腐病發病率和病情指數，防治效果理想，在辣椒根腐病綠色、高效防治中具有廣闊的應用前景。