CD40通路對內皮祖細胞NO生物活性及功能的調控作用

潘加歡 潘艷云 祁晨陽 朱敏 毛威

內皮祖細胞（EPC）是一種具有分化及增殖能力的成熟血管內皮細胞（EC）的前體細胞［1］。其可以在體內分化為成熟ECs，通過遷移、黏附、增殖，相互連接之后組成血管腔樣的結構，直接形成新血管；也可以結合入血管內膜，釋放保護性旁分泌因子參與內皮細胞損傷后的修復過程，加速血管內皮再生、改善血管內皮功能［1-2］。因此EPCs 成為防治多種血管疾病的重要靶細胞。然而，內源性EPCs 在高血壓、糖尿病、高血脂等疾病環境中數量減少且功能減退，不能很好在病變組織中執行修復任務［2-6］。GIANNOTTI 等［6］研究進一步表明EPCs 數量和功能受損是導致血管內皮功能障礙重要原因之一。EPCs 移植已被應用在多種血管損傷動物疾病模型中包括肺動脈高壓（PAH）、動脈粥樣硬化（AS）等，其被證實可作為一種全新的內皮損傷的治療方式；國內外學者也已完成多項通過輸注自體EPCs 治療心血管病患者的臨床研究并獲得較好的療效［7-10］。但目前研究證明即使移植的EPC 功能在炎癥環境中也會受損［8-10］，因此，研究EPCs 損傷的機制將是未來EPC 治療的關鍵方向。

慢性炎癥浸潤是大多數心血管疾病的典型病理改變［9，11］。促炎介質可溶性CD40 配體（sCD40L）血漿濃度升高是包括PAH、AS 等炎癥相關血管疾病的特征改變之一［11］。CD40L及其受體CD40 屬于腫瘤壞死因子超家族［12］。除了跨膜形式，CD40L 也有較短的可溶性形式sCD40L，并具有更強的生物學活性。CD40/CD40L 軸在參與調節多種細胞的免疫、炎癥反應中具有多種作用，包括單核細胞、樹突狀細胞、成纖維細胞、平滑肌細胞（SMCs）、巨噬細胞、ECs 和EPCs 等［11-13］。已有大量證據證明CD40 通路的激活可以減少EPCs 數量并損害EPCs 活性［13-14］，但其潛在機制仍不明確。

一氧化氮（NO）作為重要體液因子，不僅能夠維持血管正常舒張功能，還能抑制血小板聚集并修復血管損傷，調節體內糖、脂代謝平衡；同時也調控多種管壁細胞包括ECs、SMCs 的生長周期和增殖等，是防治心血管疾病重要的分子物質。存在于人體內NO 的含量不多，主要由ECs 生成合成，其一氧化氮合酶（NOS）可分為nNOS、iNOS 積eNOS 三種亞型，三者在維持心血管內平衡起重要調節作用。血管NO 合成很大程度上與eNOS 有關，且eNOS 活性或蛋白水平將決定NO 合成水平的高低，多種心血管疾病發病機制中包含eNOS/NO 失調的因素。NO 生物利用度的降低可能是CD40 通路激活后介導EPCs 數量減少和能力損傷的關鍵因素；而NO 生物利用度的升高可能部分逆轉炎癥條件下EPCs 的功能障礙。

1 CD40通路的激活損害EPC的功能

ECs 損傷被認為是血管損傷發生發展過程中的前哨事件，并隨后誘導血管重構［1，4］。EPCs 向ECs 的分化已被認為是其治療益處的主要機制。EPCs 的正常黏附、增殖、分化和并入血管結構是內皮修復的關鍵。EPCs 的這些功能在患者中受損［5-6］。離體實驗也證實：sCD40L 預處理后，體外培養的正常EPCs 的黏附、遷移、增殖功能受損，旁分泌的炎性因子增多，且該效應呈劑量相關［13］。研究報道sCD40L 處理后，EPCs 在VLA-5 配體纖維連接蛋白、Mac-1 配體纖維蛋白原、Mac-1 與淋巴細胞功能相關抗原-1 聯合配體細胞間黏附分子-1、VLA-4 配體VCAM-1 上的增殖和黏附減少，細胞活力也明顯呈劑量依賴性下降。管壁局部EPCs 的數量依賴于細胞本身的增殖和與血管中表達的黏附分子，這對于內皮修復至關重要［15］。此外，細胞動員前的骨髓局部EPCs 的增殖能力及數量也被認為在后期的遷移歸巢運動中起關鍵作用［16］。EPCs 功能障礙與新生內膜重塑增加和再內皮化減弱相關。在體動物研究發現：與經sCD40L 預處理的EPCs 相比，通過輸注對照EPCs 可改善內膜層的完整性、連續性，減少炎癥浸潤及血管重構，同時經EPCs 免疫熒光定位證實，經sCD40L預處理的EPCs 移植后在血管內膜層的定位減少，而CD40 基因敲除的EPCs 更好定植在內膜層，且增殖數量明顯多于對照組，這不僅和EPCs 的趨化相關，更與其細胞本身良好的增殖、黏附、分泌等功能有密切關聯。以上充分表明CD40 通路的激活能改變本體甚至移植EPCs 的功能［13］。

2 CD40通路的激活損害EPC的運動

動員、趨化、歸巢、遷移是EPCs 的主要運動形式。大部分EPCs 存在于造血干細胞和骨髓基質細胞提供的造血微環境中并保持靜止狀態。作為對損傷和細胞因子等外周刺激的反應，EPCs 動員釋放到外周血中，隨后進入新血管或受損組織的所在地，稱為歸巢［17-18］。歸巢是EPCs 黏附并分化并入內膜層的先決條件。EPCs 數量越大，血管健康狀況和修復潛力越好［1-4］。除了增殖能力外，EPCs 對外周刺激的敏感性對EPCs 數量至關重要。然而，血管疾病患者的循環EPCs 數量和正常活動減少［5-6］。EPCs 從骨髓中釋放出后能否有效遷移、歸巢至受損部位，是血管再生和損傷修復的關鍵。EPCs 的歸巢機制尚不十分清楚，目前多數觀點認為歸巢的啟動源于缺血損傷微環境中各種信號的釋放。主要包括基質細胞衍生因子（SDF-1），血管內皮生長因子（VEGF）、血小板衍生生長因子（PDGF）以及黏附因子（VCAM-1）等。在這些信號因子作用下，激活EPCs 上的相應受體通路SDF-1α/CXCR4，ICAM-1/CD18（integrinβ2）和 VCAM-1/integrinα4 等，介導EPCs 向血管損傷部位集中，并修復血管。SDF-1α/CXCR4 信號軸又被認為是EPCs 歸巢的關鍵環節之一。CD40 通路的激活被證明會減弱EPCs 的運動能力［13-14，17］。sCD40L 預處理后，SDF-1 和VEGF 誘導的EPCs 遷移呈劑量依賴性減弱［14］。晚期抗原-4（VLA-4）和VCAM 也在EPCs 的歸巢中發揮重要作用，經sCD40L 預處理后，其與EPCs 的相互作用也減弱［15］。相反，動物模型移植EPCs 的實驗中，用帶慢病毒熒光載體標記移植細胞，免疫共聚焦定位后發現，野生型EPCs在炎癥環境下可進入組織間隙及管壁各層，而CD40 基因沉默的EPCs 并不會減弱歸巢能力，反而能更好定植在血管內膜層而不是外膜或中膜層［13］。

3 CD40通路對EPC的作用機制

局部eNOS/NO 的生物活性是維持EPCs 正常歸巢和修復能力的核心條件［19-20］。然而，大多數血管疾病通常以NO 生物活性降低為特征。血管損傷動物模型移植EPCs 治療后血清eNOS 上升，而 PI3K/Akt/eNOS 途徑也是EPCs 介導血管內膜修復的關鍵途徑［19］。NO 生物活性受損會減弱骨髓對外周刺激的反應，導致循環EPCs 水平下降。在骨髓中，破壞細胞與基質微環境之間的黏附相互作用是EPCs 動員的關鍵［17-18，21］。趨化因子如VEGF、SDF-1、白細胞介素（IL）-8、粒細胞集落刺激因子和Grob 誘導的EPC 動員主要依賴于基質金屬蛋白酶（MMP）-9 的局部分泌［22-24］。NO 在調節MMP-9 的基礎表達和活性中起關鍵作用。降低NO 水平不能有效刺激MMP9表達，導致EPCs 進入循環受阻［22-24］。研究證實野生型EPCs在應用于循環時有效，但不能從eNOS 缺乏小鼠的骨髓中釋放（NOS3-/-）；此外，靜脈輸注或骨髓移植NOS3-/-細胞也不能挽救野生型動物受損的新生血管［22］。糖尿病周圍血管病患者EPCs 中eNOS、NO 的表達明顯減少，EPC 的遷移、黏附、增殖功能下降。高水平的NO 合成酶抑制劑可導致EPCs的分化、增殖、黏附和并入血管結構的能力呈濃度依賴性降低［23］。相反，提高NO 生物活性的物質，如生長激素和胰島素生長因子（IGF），對循環EPC 水平有刺激作用。促紅細胞生長素可通過動員EPC，促進損傷內膜再內皮化過程，抑制新生內膜的過度增殖［24］。同樣，他汀類藥物可以通過PI3K/Akt 通路激活eNOS，增加EPCs 的數量并促進其分化［20］。

研究發現sCD40L 與NO 的生物活性密切相關。一方面，sCD40L 可以直接降低eNOS mRNA 和蛋白質水平、eNOS mRNA 穩定性和/或eNOS 轉錄活性、eNOS 酶活性，最終降低細胞NO 水平，這些下調作用可被抗CD40L 或抗CD40 抗體有效阻斷［12，25］。因此，激活CD40 通路誘導的eNOS 和NO降低可能導致EPCs 功能障礙。另一方面，氧化應激是炎癥反應的特征也是CD40 軸調控NO 的機制［26］。氧化應激損害EPCs 的黏附、遷移和再內皮化能力，同時促進EPCs 的凋亡和衰老［27］。除了直接損害細胞內的細胞器和分子外，更重要的是，高濃度的活性氧降低了對氧化應激高度敏感的NO 可用性，并拮抗內皮細胞NO 生成的保護作用［27］。O2-可以消耗NO 形成過氧亞硝酸鹽（ONOO-），并觸發p38、ERK1/2 和NF-κb 的激活，從而降低eNOS 水平和NO 的生物活性［25，27］。sCD40L 降低線粒體膜電位、過氧化氫酶、ATP 水平和SOD 活性，同時激活NAD（P）H 氧化酶，從而刺激細胞內活性氧（ROS），從而改變NO 的生物活性［25-26］。然而，經過NAD（P）H 氧化酶抑制和超氧化物歧化酶（SOD）處理后，NO 的生物活性得以恢復，再內皮化反應也得以恢復［27］。

4 小結

EPC 移植作為一種新興的治療方法，離廣泛的臨床應用還有較長的路。尋找合理的優化方法是EPC 治療的未來研究方向。血管內膜損傷常伴有慢性炎癥浸潤。但直接抗炎治療在AS/PAH 等血管疾病的臨床應用中尚存爭議，因此進一步深入了解其潛在病理發生機制有助于確立新的研究靶點及臨床治療方案。本文對經典促炎信號通路CD40 通路進行深入分析，并提出NO 生物活性可能是CD40 通路介導EPC 功能改變的關鍵因素。可以考慮在EPC 輸注時采用NO 相關基因修飾的EPC 治療或臨時靶向信號通路輔助治療。