基于MITF 與PI3K/AKT 信號通路探討多種單味中藥對黃褐斑的作用機制

倪晨寧 王小勇 石海蘭 沈肖奮

黃褐斑是一種高度流行的獲得性色素障礙性疾病，絕大多數患者為女性，臨床表現為額頭、臉頰、下巴等區域出現不對稱、不規則的棕褐色斑塊，中醫稱其為“肝斑”“黧黑斑”“面塵”等[1-2]。組織病理學顯示，黃褐斑病變皮膚具有較大樹突的活躍黑素細胞數量增加，黑色素生成增多并向角質層形成細胞轉移，日光性彈力組織變性，真皮乳頭層黑色素沉積，真皮血管、肥大細胞和白細胞數量增加[3]。小眼畸形相關轉錄因子（microphthalmia-associated transcription factor，MITF）能夠調控多種黑素形成相關酶的轉錄水平，在黑素細胞的發育、分化和生存中起著關鍵作用[4]。激活磷脂酰肌醇3 激酶/蛋白激酶B （phosphatidylinositol 3 kinase/protein kinase B，PI3K/AKT）信號通路可下調MITF 表達，減少黑色素合成[5]。中醫典籍對黃褐斑類似癥狀早有記載，積累了豐富的用藥經驗[6]。甘草、當歸、赤芍皆為消斑內服處方中常用藥材，多與其他藥物配伍，達到補虛、溫里、活血化瘀、利水滲濕的效果[7-8]。本研究基于MITF 與PI3K/AKT信號通路，通過體外細胞實驗與動物黃褐斑模型探討甘草、當歸、赤芍三味中藥對黃褐斑的影響與作用機制，現報道如下。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 30 只SPF 級5 周齡健康雌性棕色豚鼠，體質量（250±30）g，購自安徽醫科大學動物實驗中心，動物合格證號SCXK（皖）2022-004。于溫度（25±2）℃、濕度40%～70%的SPF 房內適應性飼養1周后進行實驗，飼養期間允許豚鼠自由攝食飲水。本次研究經浙江中醫藥大學附屬第二醫院實驗動物倫理委員會審核通過（倫理審批號20210406），實驗中的所有操作均在動物實驗倫理指導守則指導下進行。

1.2 試 劑 甘草（批號201112）、當歸（批號201009）、赤芍（批號210113）飲片購自山東百味堂中藥飲片有限公司；人表皮黑素細胞（貨號CP-H108）購自武漢益普生物科技有限公司；254 培養基（貨號M254500）、黑素細胞生長添加劑（貨號S0025）購自美國Thermo Fisher 公司；PI3K 抑制劑LY294002（貨號LKT-L960002）購自艾美捷科技有限公司；MTT 檢測試劑盒（貨號M1020）購自北京索萊寶科技有限公司；酪氨酸酶活性檢測試劑盒（貨號PH0597）購自北京普非生物科技有限公司；HE 染色試劑盒（貨號C0105S）、BCA 蛋白濃度測定試劑盒（貨號P0012）購自上海碧云天生物技術有限公司；Fontana-Masson染色試劑盒（貨號CLSG80154）購自北京達科為生物技術有限公司；兔MITF（貨號ab303530）、兔PI3K（貨號ab191606）、兔磷酸化PI3K（p-PI3K，貨號ab182651）、兔p-AKT（貨號ab81283）、兔糖原合成酶激酶-3β（glycogen synthase kinase-3β，GSK3β，貨號ab32391）、兔p-GSK3β（貨號ab75814）購自英國Abcam 公司；兔AKT（貨號9272）購自美國CST 公司。其他試劑均為市售分析純。

1.3 主要儀器 DNP-9272 電熱恒溫培養箱（上海甘易儀器設備有限公司），Leica DM4 M 光學顯微鏡（德國Leica 公司），FlexStation 3 多功能酶標儀工作站（美國分子儀器公司），M1324R 微量高速冷凍離心機（深圳瑞沃德生命科技有限公司），LF-Mini4 型小型垂直電泳槽（北京龍方科技有限公司），eBlotTML1快速濕轉儀（南京金斯瑞生物科技有限公司），TS-2000 型脫色搖床（江蘇海門其林貝爾儀器制造有限公司），接觸式無損定量成像儀（上海易孛特光電技術有限公司）。

2 實驗方法

2.1 單味中藥制備 甘草、當歸、赤芍飲片各取約18 g，加入600 mL 去離子水浸泡1 h，大火煎開后小火煎煮30 min，雙層紗布過濾后再次加水煎煮，合并2 次煎得的濾液并濃縮，高壓滅菌，最終甘草、當歸、赤芍藥液生藥量分別為0.56、0.47、0.39 g/mL。

2.2 細胞培養與分組 復蘇黑素細胞，使用含1%黑素細胞生長添加劑的254 培養基于37 ℃、5%CO2、飽和濕度的電熱恒溫培養箱中培養。將黑素細胞分為0、50、100、500、1000 μg/mL 和1000 μg/mL+LY294002 組，向培養基中加入相應濃度的中藥藥液與25 nmol LY294002，正常培養48 h 用于后續實驗。

2.3 MTT 法檢測不同劑量藥物細胞毒性 0、50、100、500、1000 μg/mL 組細胞以1500 個/孔的密度接種于96 孔板內，正常培養24 h 后進行MTT 檢測。每孔加入10 μL 濃度為5 mg/mL 的MTT 溶液，37 ℃下孵育4 h，加入100 μL 二甲基亞砜（DMSO），避光震蕩15 min，酶標儀570 nm 測定吸光度。

2.4 酪氨酸酶活性測定 胰酶消化收集0、50、100、500、1000 μg/mL 組細胞，4 ℃超聲破碎、16000 r/min離心30 min，BCA 定量后將細胞裂解產物調整至相同蛋白濃度，使用酪氨酸酶活性檢測試劑盒檢測各組細胞酪氨酸酶活性，嚴格按照其操作步驟進行實驗。

2.5 黑色素含量測定 胰酶消化收集0、50、100、500、1000 μg/mL 組細胞，加入含10%DMSO 的1 mol/L氫氧化鈉溶液1 mL，80 ℃水浴加熱1 h，取100 μL混合液于酶標儀405 nm 測定吸光度。

2.6 動物分組與造模 30 只豚鼠采用隨機單位組設計分組法分為對照組、模型組、甘草組、當歸組、赤芍組，每組6 只。所有豚鼠背部3 cm×3 cm 區域剃毛，模型組、甘草組、當歸組、赤芍組接受波長320 nm的中波紫外線（ultraviolet B，UVB）照射60 min，照射距離10 cm，每日1 次，對照組僅暴露于普通光源中，不接受照射。同時，甘草組、當歸組、赤芍組分別接受甘草、當歸、赤芍藥液灌胃，劑量均為0.3 mg/kg，對照組、模型組接受等體積生理鹽水灌胃，共持續4 周。

2.7 皮膚組織黑色素含量測定 3%異氟醚麻醉所有豚鼠，切取背部造模處皮膚。取部分皮膚組織制成勻漿，其余操作同2.5。

2.8 組織學評價 取部分皮膚組織，置入4%多聚甲醛固定后常規石蠟包埋制成厚度為3 μm 的切片，按照HE、Fontana-Masson 染色試劑盒說明書的操作步驟進行染色，每組隨機挑選5 個視野，于光鏡下觀察皮膚組織形態并拍照。

2.9 Western blot 檢測MITF、PI3K/AKT 信號通路相關分子水平 收集0、1000 μg/mL 和1000 μg/mL+LY294002 組細胞，加入適量預冷RIPA，充分混勻后冰上孵育30 min；取部分皮膚組織勻漿，加入適量預冷RIPA，充分混勻后冰上孵育1.5 h。4 ℃、10000 r/min離心10 min，取上清液，BCA 定量后制樣。凝膠電泳分離樣品蛋白，轉膜，截取目的條帶浸于5%脫脂奶粉制成的封閉液中，置于搖床上室溫封閉1 h。封閉液稀釋一抗制成孵育液，稀釋比例為1∶500，充分搖勻后置于4 ℃環境下過夜。洗膜，加入稀釋比例為1∶5000 的對應二抗孵育液，室溫孵育2 h，洗膜后加入ECL 化學發光液，避光反應5 min，用定量成像儀收集結果。

2.10 免疫組化檢測MITF、PI3K/AKT 信號通路相關分子表達 石蠟切片經脫蠟、水化、抗原修復、封閉后加入稀釋度為1∶100 的相應抗體，室溫孵育1 h。加入生物素標記的二抗，室溫孵育30 min，加入鏈霉親和素酶，室溫孵育30 min，二氨基聯苯胺顯色，蘇木精復染，常規脫水、透明后用中性樹膠封片，于光鏡下拍攝實驗結果，每張切片隨機選擇5 個不同視野，用Image J 軟件進行圖像分析，取平均值作為蛋白相對表達量。

2.11 統計學方法 應用SPSS 24.0 統計軟件對數據進行分析處理，計量資料經Kolmogorov-Smirov 檢驗服從正態分布，使用均數±標準差（±s） 表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用獨立樣本t 檢驗。P＜0.05 表示差異具有統計學意義。

3 結 果

3.1 不同中藥抑制黑素細胞活力比較 MTT 檢測結果顯示，與各單味中藥0 μg/mL 組比較，50、100 μg/mL組細胞活力差異無統計學意義（P＞0.05），500、1000μg/mL組細胞活力明顯受到抑制（P＜0.05）。見表1。

表1 不同中藥濃度對黑素細胞活力影響（%，±s）

表1 不同中藥濃度對黑素細胞活力影響（%，±s）

注：與0 μg/mL 比較，aP＜0.05

濃度0 μg/mL 50 μg/mL 100 μg/mL 500 μg/mL 1000 μg/mL孔數細胞活力33333甘草100.00 93.67±13.71 87.95±6.67 70.20±9.33a 66.82±9.65a當歸100.00 93.04±10.55 89.39±5.66 79.77±8.43a 56.62±15.99a赤芍100.00 91.64±12.67 91.46±19.62 81.41±17.84a 77.51±7.33a

3.2 不同中藥抑制黑素細胞酪氨酸酶活性比較 酪氨酸酶活性檢測結果顯示，與各單味中藥0 μg/mL組比較，甘草500、1000 μg/mL 組，當歸100、500、1000 μg/mL 組和赤芍1000 μg/mL 組酪氨酸酶活性明顯受到抑制（P＜0.05）。見表2。

表2 不同中藥濃度對黑素細胞酪氨酸酶活性影響（%±s）

表2 不同中藥濃度對黑素細胞酪氨酸酶活性影響（%±s）

注：與0 μg/mL 比較，aP＜0.05

濃度0 μg/mL 50 μg/mL 100 μg/mL 500 μg/mL 1000 μg/mL孔數酪氨酸酶活性33333甘草100.00 92.76±5.89 86.91±10.63 75.60±5.89a 65.07±5.13a當歸100.00 87.83±4.36 79.80±8.46a 65.82±14.20a 52.69±5.52a赤芍100.00 94.39±5.13 92.32±10.15 87.59±2.36 67.60±10.66a

3.3 不同中藥抑制黑素細胞黑色素合成比較 黑色素含量測定結果顯示，與各單味中藥0 μg/mL 組比較，甘草500、1000 μg/mL 組，當歸50、100、500、1000 μg/mL 組和赤芍100、500、1000 μg/mL 組黑色素含量明顯降低（P＜0.05）。見表3。

表3 不同中藥濃度對黑素細胞黑色素含量影響（%，±s）

表3 不同中藥濃度對黑素細胞黑色素含量影響（%，±s）

注：與0 μg/mL 比較，aP＜0.05

濃度0 μg/mL 50 μg/mL 100 μg/mL 500 μg/mL 1000 μg/mL孔數黑色素含量33333甘草100.00 93.89±2.55 90.85±1.33 70.67±6.79a 55.56±3.17a當歸100.00 79.58±20.30a 66.79±4.60a 56.53±4.06a 54.69±4.05a赤芍100.00 99.63±9.29 84.70±5.56a 70.90±13.72a 61.80±12.89a

3.4 不同中藥對黑素細胞MITF、PI3K/AKT 信號通路相關分子水平的影響 MTT 檢測結果顯示，各單味中藥含量為500、1000 μg/mL 時細胞活力明顯受到抑制，1000 μg/mL 組細胞活力較500 μg/mL 組受限更為明顯，因此Western blot 檢測中各組中藥劑量設定為1000 μg/mL。結果顯示，與各單味中藥0 μg/mL組比較，1000 μg/mL+LY294002 組PI3K、AKT、GSK3β、MITF、p-PI3K、p-AKT、p-GSK3β 表達水平，差異無統計學意義（P＞0.05）；1000 μg/mL 組PI3K、AKT、GSK3β 表達水平差異無統計學意義（P＞0.05），MITF表達水平降低（P＜0.05），p-PI3K、p-AKT、p-GSK3β表達水平升高（P＜0.05）。見圖1、表4～6。

圖1 不同中藥處理黑素細胞Western blot 檢測結果

表4 不同劑量甘草對黑素細胞MITF、PI3K/AKT 信號通路相關分子水平的影響（±s）

表4 不同劑量甘草對黑素細胞MITF、PI3K/AKT 信號通路相關分子水平的影響（±s）

注：MITF 為小眼畸形相關轉錄因子；PI3K 為磷脂酰肌醇3 激酶；p-PI3K 為磷酸化PI3K；AKT 為蛋白激酶B；p-AKT 為磷酸化AKT；GSK3β 為糖原合成酶激酶-3β；p-GSK3β 為磷酸化GSK3β；β-actin 為β-肌動蛋白；與0 μg/mL 組比較，aP＜0.05

組別甘草0 μg/mL 組甘草1000 μg/mL 組甘草1000 μg/mL+LY294002 組孔數333 MITF 0.99±0.08 0.28±0.04a 0.93±0.05 p-PI3K/PI3K 0.61±0.07 1.08±0.07a 0.54±0.06 p-AKT/AKT 0.33±0.08 0.79±0.07a 0.29±0.08 p-GSK3β/GSK3β 0.41±0.06 0.78±0.06a 0.38±0.06

表5 不同劑量當歸對黑素細胞MITF、PI3K/AKT 信號通路相關分子水平的影響（±s）

表5 不同劑量當歸對黑素細胞MITF、PI3K/AKT 信號通路相關分子水平的影響（±s）

注：MITF 為小眼畸形相關轉錄因子；PI3K 為磷脂酰肌醇3 激酶；p-PI3K 為磷酸化PI3K；AKT 為蛋白激酶B；p-AKT 為磷酸化AKT；GSK3β 為糖原合成酶激酶-3β；p-GSK3β 為磷酸化GSK3β；β-actin 為β-肌動蛋白；與0 μg/mL 組比較，aP＜0.05

組別當歸0 μg/mL 組當歸1000 μg/mL 組當歸1000 μg/mL+LY294002 組孔數333 MITF 1.14±0.08 0.28±0.04a 1.13±0.05 p-PI3K/PI3K 1.01±0.07 1.38±0.07a 0.94±0.06 p-AKT/AKT 0.83±0.08 1.27±0.05a 0.79±0.08 p-GSK3β/GSK3β 0.39±0.06 0.78±0.06a 0.35±0.05

表6 不同劑量赤芍對黑素細胞MITF、PI3K/AKT 信號通路相關分子水平的影響（±s）

表6 不同劑量赤芍對黑素細胞MITF、PI3K/AKT 信號通路相關分子水平的影響（±s）

注：MITF 為小眼畸形相關轉錄因子；PI3K 為磷脂酰肌醇3 激酶；p-PI3K 為磷酸化PI3K；AKT 為蛋白激酶B；p-AKT 為磷酸化AKT；GSK3β 為糖原合成酶激酶-3β；p-GSK3β 為磷酸化GSK3β；β-actin 為β-肌動蛋白；與0 μg/mL 組比較，aP＜0.05

組別赤芍0 μg/mL 組赤芍1000 μg/mL 組赤芍1000 μg/mL+LY294002 組孔數333 MITF 0.84±0.13 0.43±0.09a 0.80±0.12 p-PI3K/PI3K 0.41±0.07 0.83±0.12a 0.44±0.06 p-AKT/AKT 0.29±0.08 0.79±0.07a 0.33±0.08 p-GSK3β/GSK3β 0.31±0.06 0.82±0.04a 0.28±0.06

3.5 不同中藥對黃褐斑模型豚鼠皮膚外觀與黑色素含量的影響 直接觀察各組豚鼠皮膚外觀發現，與對照組比較，模型組背部皮膚色素沉著程度明顯增加，甘草組、當歸組、赤芍組背部皮膚色素沉著程度較模型組有不同程度減輕，且未觀察到明顯的刺激和副作用。黑色素含量測定結果顯示，與對照組比較，模型組、甘草組、當歸組、赤芍組背部皮膚黑色素含量升高（P＜0.05）；與模型組比較，甘草組、當歸組、赤芍組背部皮膚黑色素含量降低（P＜0.05）。見表7、圖2。

圖2 不同中藥對黃褐斑模型豚鼠皮膚外觀與黑色素含量的影響

表7 各組豚鼠皮膚黑色素含量測定結果（%，±s）

表7 各組豚鼠皮膚黑色素含量測定結果（%，±s）

注：對照組背部皮膚暴露在普通光源中照射60 min，灌胃等體積生理鹽水；模型組背部皮膚暴露在中波紫外線（UVB）中照射60 min，灌胃等體積生理鹽水；甘草組背部皮膚暴露在UVB 中照射60 min，灌胃0.3 mg/kg 甘草藥液；當歸組背部皮膚暴露在UVB 中照射60 min，灌胃0.3 mg/kg 當歸藥液；赤芍組背部皮膚暴露在UVB 中照射60 min，灌胃0.3mg/kg 赤芍藥液；與對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05

組別對照組模型組甘草組當歸組赤芍組鼠數66666黑色素含量100.00 3060.21±431.62a 1820.34±385.08ab 1181.43±347.24ab 2229.87±554.25ab

3.6 不同中藥對黃褐斑模型豚鼠皮膚組織學的影響

HE、Fontana-Masson 染色結果顯示，與對照組比較，模型組、甘草組、當歸組、赤芍組皮膚組織結構紊亂，黑色素沉積明顯增多；與模型組比較，甘草組、當歸組、赤芍組皮膚組織結構較為完整，黑色素沉積減少。見圖3。

圖3 不同中藥對黃褐斑模型豚鼠皮膚組織學的影響

3.7 不同中藥對黃褐斑模型豚鼠皮膚MITF、PI3K/AKT 信號通路相關分子水平的影響 Western blot檢測結果顯示，與對照組比較，模型組PI3K、AKT、GSK3β 表達水平差異無統計學意義（P＞0.05），MITF表達水平升高（P＜0.05），p-PI3K、p-AKT、p-GSK3β表達水平降低（P＜0.05）；與模型組比較，甘草組、當歸組、赤芍組MITF 表達水平降低（P＜0.05），p-PI3K、p-AKT、p-GSK3β 表達水平升高（P＜0.05）。免疫組化檢測結果顯示，與對照組比較，模型組MITF 表達水平升高（P＜0.05），p-PI3K、p-AKT、p-GSK3β 表達水平降低（P＜0.05）；與模型組比較，甘草組、當歸組、赤芍組MITF 表達水平降低（P＜0.05），p-PI3K、p-AKT、p-GSK3β 表達水平升高（P＜0.05）。見圖4～5 和表8～9。

圖4 各組豚鼠皮膚Western blot 檢測結果

圖5 各組豚鼠皮膚免疫組化檢測結果（×200，刻度尺：100 μm）

表8 各組豚鼠皮膚Western blot 檢測蛋白相對表達水平（±s）

表8 各組豚鼠皮膚Western blot 檢測蛋白相對表達水平（±s）

注：對照組背部皮膚暴露在普通光源中照射60 min，灌胃等體積生理鹽水；模型組背部皮膚暴露在中波紫外線（UVB）中照射60 min，灌胃等體積生理鹽水；甘草組背部皮膚暴露在UVB 中照射60 min，灌胃0.3 mg/kg 甘草藥液；當歸組背部皮膚暴露在UVB 中照射60 min，灌胃0.3 mg/kg當歸藥液；赤芍組背部皮膚暴露在UVB 中照射60 min，灌胃0.3 mg/kg 赤芍藥液；MITF 為小眼畸形相關轉錄因子；PI3K 為磷脂酰肌醇3 激酶；p-PI3K 為磷酸化PI3K；AKT 為蛋白激酶B；p-AKT 為磷酸化AKT；GSK3β 為糖原合成酶激酶-3β；p-GSK3β 為磷酸化GSK3β；β-actin 為β-肌動蛋白；與對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05

組別對照組模型組甘草組當歸組赤芍組鼠數66666 MITF 0.41±0.07 1.47±0.18a 0.85±0.07ab 0.67±0.05ab 0.92±0.06ab p-PI3K/PI3K 0.59±0.06 0.15±0.03a 1.18±0.06ab 1.30±0.09ab 1.13±0.08ab p-AKT/AKT 0.82±0.06 0.25±0.04a 1.12±0.06ab 1.15±0.04ab 1.08±0.06ab p-GSK3β/GSK3β 0.79±0.07 0.23±0.05a 1.04±0.12ab 1.09±0.12ab 1.00±0.11ab

表9 各組豚鼠皮膚免疫組化檢測蛋白相對表達水平（±s）

表9 各組豚鼠皮膚免疫組化檢測蛋白相對表達水平（±s）

注：對照組背部皮膚暴露在普通光源中照射60 min，灌胃等體積生理鹽水；模型組背部皮膚暴露在中波紫外線（UVB）中照射60 min，灌胃等體積生理鹽水；甘草組背部皮膚暴露在UVB 中照射60 min，灌胃0.3 mg/kg 甘草藥液；當歸組背部皮膚暴露在UVB 中照射60 min，灌胃0.3 mg/kg 當歸藥液；赤芍組背部皮膚暴露在UVB 中照射60 min，灌胃0.3 mg/kg 赤芍藥液；MITF 為小眼畸形相關轉錄因子；p-PI3K 為磷酸化磷脂酰肌醇3 激酶；p-AKT 為磷酸化蛋白激酶B；p-GSK3β 為磷酸化糖原合成酶激酶-3β；與對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05

組別對照組模型組甘草組當歸組赤芍組鼠數66666 MITF 1.00±0.05 2.71±0.17a 1.79±0.15ab 1.51±0.13ab 1.94±0.12ab p-PI3K 1.00±0.05 0.64±0.06a 1.57±0.12ab 1.70±0.12ab 1.50±0.08ab p-AKT 1.00±0.05 0.73±0.09a 1.68±0.14ab 1.79±0.10ab 1.49±0.12ab p-GSK3β 1.00±0.05 0.56±0.09a 1.81±0.14ab 1.96±0.09ab 1.67±0.15ab

4 討 論

雖然黑色素能夠保護皮膚免受紫外線誘導細胞DNA 損傷，但過度的黑色素沉積可能會發展為皮膚疾病，外貌變化可進一步對患者的情緒產生負面影響，進而加重病情[9-10]。在中醫理論中，肝、脾、腎臟功能失調、氣血瘀滯是黃褐斑的主要病機，因此黃褐斑的治療多從調肝、補腎、健脾著手，活血化瘀，通絡益氣，標本兼治[11]。單味中藥適應證較復方更為明確，藥力單一，療效確切，制成提取物可提高藥物生物利用率，貯藏、運輸、攜帶、服用也更為方便，臨床應用廣泛，分析單味中藥對疾病的作用機制可豐富中藥治療的基礎理論，指導臨床合理用藥[12]。甘草具有抗氧化、抗腫瘤、抗炎、免疫調節等生物活性，其根莖常用于治療感冒、咳嗽、哮喘、呼吸道感染，主要生物活性成分為黃酮類化合物和三萜皂苷，其中一種黃酮類化合物異甘草素具有多種藥理活性，可通過激活細胞外信號調節激酶信號通路降解MITF，從而抑制黑色素生成[13-14]。當歸最早記載于漢代《神農本草經》中，有活血、潤腸、調經、止痛之功效，含有多種揮發油、有機酸、多糖和黃酮類化合物，在治療黃褐斑外用或內服方劑中皆為高頻用藥[7，15-16]。赤芍屬清熱涼血類藥材，具有清熱涼血、祛瘀止痛的功效，主要成分包括萜類化合物、多酚類化合物和揮發油，其中芍藥苷具有抗酪氨酸酶和抗黑色素生成活性[17-18]。在本研究中，甘草、當歸、赤芍藥液均對黑素細胞活力、酪氨酸酶活性、黑色素合成水平具有不同程度的抑制效果，藥液濃度為1000 μg/mL 時均降低了MITF 的表達水平，并提高了PI3K/AKT 信號通路相關分子的磷酸化水平，而使用藥液處理的同時加入PI3K 抑制劑LY294002，黑素細胞活力、酪氨酸酶活性、黑色素合成水平及MITF 表達水平與對照組相近，推測甘草、當歸、赤芍可能通過激活PI3K/AKT 信號通路實現對MITF 水平、黑素細胞功能的抑制。

常見的色素沉著疾病多與MITF 的過度表達有關[19]。PI3K/AKT 信號通路是調節MITF 轉錄活性的重要信號級聯之一，研究表明，激活PI3K/AKT 信號通路能夠抑制黑色素在小鼠黑素細胞和人類黑色素瘤Melan-A 細胞中的積累[20]。GSK-3β 是調節糖原合成和神經元微管相關蛋白表達的激酶，在哺乳動物真核細胞中普遍表達且高度保守，可直接調節MITF的轉錄水平，進而影響MITF 介導的黑色素合成[21]，Pan 等[22]研究顯示，PI3K/AKT 信號通路的激活能夠提高GSK-3β 在Ser 9 位點的磷酸化，進而下調MITF 表達。在本次研究中，UVB 照射后模型組豚鼠背部皮膚色素沉淀明顯，MITF 表達水平升高，PI3K/AKT 信號通路PI3K、AKT、GSK3β 磷酸化水平下降，而甘草、當歸、赤芍組豚鼠背部皮膚色素含量降低，MITF 表達水平受到不同程度的抑制，PI3K、AKT、GSK3β 磷酸化水平均明顯提高，推測甘草、當歸、赤芍通過上調PI3K/AKT 信號通路相關分子磷酸化水平抑制MITF 表達，緩解黃褐斑癥狀。

綜上所述，甘草、當歸、赤芍可通過激活PI3K/AKT 信號通路，抑制MITF 表達，減少皮膚黑色素沉積，進而緩解黃褐斑癥狀。但單味中藥藥物成分仍較復雜，還可能通過其他信號通路調節黑色素合成，仍需更加深入的研究驗證。