血根堿基于PI3K/AKT 通路抑制結腸癌細胞增殖和遷移的機制研究

王 密 翁春燕

結腸癌是全球最普遍的消化道惡性腫瘤之一，發病率和死亡率逐年上升[1]。手術治療仍然是目前原發性結腸癌主要外科治療方法，易輔以放化療等，但其“發現晚、多耐藥、易復發”的典型特點易導致治療失敗，從而難以獲得較好的預后效果。盡管新型靶向藥物針對多種癌癥（包括結腸癌）的研究也獲得了進展，但其應用仍存在較大的局限性；而經典的化療手段由于其自身難以解決的耐藥性高及生物敏感性過低等問題，治療效果不甚理想。血根堿作為一種分布廣、易養殖的苯并菲啶類生物堿中藥提取物，其多種抗癌機制受到越來越多的重視[2]。因此，本研究選用人類結腸癌細胞（HCT-8 細胞和SW-620 細胞），重點研究血根堿對人體結腸癌的影響，并進一步探究其作用于體內外腫瘤的可能藥物作用機制。

1 實驗材料

1.1 細胞株 人正常結直腸黏膜細胞系FHC（批號CRL-1831）和結腸癌細胞系HCT-8（批號CCL-244）、SW-620（批號CCL-227）購自American Type Culture Collection（ATCC）。

1.2 動 物 4～5 周齡SPF 級別的BALB/c 裸鼠6只，購于上海BK 公司，雌性，體質量（16～20）g，飼養于浙江中醫藥大學動物實驗中心無特定病原屏障中心，飼養濕度為（50±5）%，溫度（25±2）℃，各12 h 的光、暗循環。所有動物實驗均在動物倫理委員會審核通過后進行（倫理審批號：IACUC-20221008-04）。動物生產許可證號：SCXK（滬）2022-0004；動物質量合格證號：SCXK（滬）2022-0004；動物使用許可證號：SCXK（浙）2021-0012。

1.3 試 劑 血根堿（貨號HY-N005） 購自MedChemExpress，使用DMSO 配制成2 mmol/L 的濃度進行保存；血根堿溶液采用DMSO 及生理鹽水溶解至100 mg/mL 待用；使用前，使用相應培養基配制成所需的工作濃度。胎牛血清（FBS，貨號16140-071）、1640 培養液（貨號72400047）、杜爾伯科改良伊格爾（DMEM，貨號C11995500BT）培養基均購自美國Gibco 公司；RIPA 裂解液（貨號PC101）、蛋白酶抑制劑混合液（貨號PC101）、磷酸酶抑制劑混合液（貨號FGR102）等細胞裂解液相關試劑均購自雅酶生物科技有限公司；磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K，貨號4255）、絲氨酸/蘇氨酸激酶（AKT，貨號4691）、磷酸化絲氨酸/蘇氨酸激酶（p-AKT，貨號4060）、雷帕霉素靶蛋白（mTOR，貨號2983）、E-鈣黏蛋白（E-cad，貨號14472）、N-鈣黏蛋白（N-cad，貨號13116）、β-肌動蛋白（β-Actin，貨號3700）等抗體均購自CST；細胞計數試劑盒（CCK-8，貨號GK10001） 購自GLPBIO；多聚甲醛購自默克（貨號30525-89-4）。

1.4 主要儀器 超凈工作臺（上海博迅實業有限公司醫療設備廠，型號：HF safe 1500LC）；蛋白質印跡法檢測系統（美國Bio-Rad 公司，型號：Universal Hood Ⅲ）；SDS-PAGE 電泳儀裝置（美國Bio-Rad 公司，型號：1658004）等。

2 實驗方法

2.1 形態學觀察 將人結腸癌HCT-8 細胞接種在6 孔板中，當細胞生長面積達一半以上時，棄上清液，加入2 mL 預定含量血根堿的培養基（0、2、4、8 μmol/L）處理24 h，顯微鏡下觀察細胞狀態。

2.2 CCK-8 實驗 將穩定生長的人結腸癌細胞（HCT-8 和SW-620）以5000 個細胞數量均勻混合并接種于96 孔板中培養至貼壁（6～8 h）。隨后換液，加入預定含量血根堿的培養基（0、3、6、9、18 μmol/L）干預培養24 h 換液，加入適量CCK-8 溶液，選取恰當的時間（1～4 h 內）置于酶標儀中檢測，確保對照組在450 mm 激發光的吸光數值在0.8～1.2。

2.3 細胞劃痕實驗 將穩定生長的人結腸癌細胞HCT-8 以50 萬個細胞接種于6 孔板中。當細胞匯合度達90%的時候，使用槍頭制造“細胞傷痕”。加入不同濃度血根堿的培養液（0、2、4、8 μmol/L）進行干預培養，倒置顯微鏡直視下觀察細胞的匯合程度，并進行拍照記錄（0、12、24、48 h）。

2.4 細胞克隆形成實驗 將穩定生長的人結腸癌細胞（HCT-8 和SW-620）混合均勻，以1000 個細胞數量接種至6 孔板中，加入不同濃度血根堿的培養液（0、2、4、8 μmol/L）培養干預，置于溫度37 ℃，含5%CO2的培養箱中培養10～14 d，期間定期3～4 d 換各自相應含量的血根堿培養液。當培養皿中出現肉眼可見的克隆形成時，先后加入多聚甲醛、結晶紫染色，洗凈晾干，觀察和記錄細胞的克隆個數。

2.5 蛋白質印跡法 將穩定生長的人結腸癌細胞HCT-8 接種于6 cm 皿中，待細胞貼壁后使用含不同濃度血根堿的培養液（0、2、4、8 μmol/L）進行培養。收集細胞加入裂解液充分溶解并置于4 ℃離心機中（轉速10000 r/min）離心15 min。隨后制備成含上樣緩沖液的蛋白樣品。采用SDS-PAGE 分離蛋白，電轉移至PVDF 膜上，予5%脫脂牛奶封閉1 h，置于一抗中并于4 ℃搖床上孵育過夜，予TBST 漂洗3 遍，每遍10 min，隨后加入二抗，室溫孵育1 h，再予TBST漂洗3 遍，每遍10 min，洗膜后經ECL 試劑顯色、曝光。結果采用Image J 軟件對目的條帶進行灰度值測定。

2.6 體內動物實驗 將處于對數生長期的HCT-8細胞以100 萬/200 μL 注射至小鼠左側腋下皮下；待腫瘤體積生長至100 mm3左右時，按照隨機數字表法將裸鼠分成對照組和血根堿組，每組3 只。血根堿組予10 mg/kg 血根堿溶液腹腔注射治療，每天1 次；對照組予等量生理鹽水腹腔注射安慰治療。每周測量1 次皮下腫瘤長徑、短徑及小鼠體質量。待治療28 d 后，安樂死小鼠并稱量小鼠腫瘤質量。小鼠腫瘤體積計算方法：長徑×短徑2×1/2。

2.7 統計學方法 應用GraphPad Prism 9 及SPSS 22.0 進行繪圖及統計學分析。符合正態分布的計量資料以均數±標準差（±s）表示，多組比較采用單因素方差分析，兩組比較采用獨立樣本t 檢驗。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

3 結 果

3.1 血根堿對結腸癌細胞形態的影響 為初步判定血根堿對結腸癌細胞是否存在毒性作用，予不同濃度的血根堿處理HCT-8 細胞24 h。如圖1 所示，對照組細胞狀態良好，細胞緊密貼壁，形態飽滿（HCT-8 細胞呈菱形），細胞膜光滑完整；而在不同濃度的血根堿處理組中，細胞貼壁能力下降，分泌物增多，形態皺縮至圓形，并出現不同程度的胞膜破裂。

圖1 不同濃度血根堿處理后人結腸癌細胞HCT-8 的細胞形態（×40）

3.2 血根堿對結腸癌細胞活性的影響 與對照組比較，血根堿以濃度依賴性（3、6、9、18 μmol/L）對結腸癌細胞HCT-8 和SW-620 具有較強的殺傷作用（P 均＜0.05）；并且血根堿對正常人結腸黏膜細胞FHC 的殺傷作用明顯弱于對結腸癌細胞的殺傷作用。進一步計算出血根堿對HCT-8、SW620 和FHC 的半數抑制濃度（median inhibition concentration，IC50） 分別為（3.40±0.03）、（5.32±0.12）和（14.98±1.34）μmol/L。見表1～2。

表1 血根堿對HCT-8、SW-620 和FHC 細胞活力的影響（%，±s）

表1 血根堿對HCT-8、SW-620 和FHC 細胞活力的影響（%，±s）

注：HCT-8 和SW-620 為人結腸癌細胞；FHC 為人正常腸上皮細胞；與同濃度血根堿處理下的FHC 組比較，aP＜0.05

細胞HCT-8 SW-620 FHC血根堿濃度孔數333 0 μmol/L 100.00±2.47 100.00±2.38 100.00±3.53 3 μmol/L 66.11±1.11a 76.88±3.27a 93.67±2.42 6 μmol/L 40.49±2.36a 54.90±2.24a 77.53±2.01 9 μmol/L 16.11±1.52a 30.83±1.70a 66.21±2.62 18 μmol/L 1.13±0.23a 3.11±0.18a 30.82±1.83

表2 血根堿對HCT-8、SW-620 和FHC 細胞的IC5（0μmol/L，±s）

表2 血根堿對HCT-8、SW-620 和FHC 細胞的IC5（0μmol/L，±s）

注：IC50 為半數抑制濃度；HCT-8 和SW-620 為人結腸癌細胞；FHC 為人正常腸上皮細胞；與FHC 比較，aP＜0.05

細胞HCT-8 SW-620 FHC孔數333血根堿的IC50 3.40±0.03a 5.32±0.12a 14.98±1.34

3.3 血根堿對結腸癌細胞增殖的影響 與對照組比較，血根堿以濃度依賴形式明顯抑制了HCT-8 和SW-620 細胞的克隆形成大小和個數（0、2、4、8 μmol/L血根堿處理下的SW-620 和HCT-8 的克隆數分別是81、40、22、11 個和63、26、22、7 個）。見圖2。

圖2 不同濃度血根堿對結腸癌細胞增殖的影響

3.4 血根堿對結腸癌細胞遷移的影響 使用不同濃度血根堿處理結腸癌HCT-8 細胞0、12、24、48、72 h，結果如圖3 和表3 所示，隨著血根堿濃度的提高，細胞劃痕的愈合能力逐漸下降（P<0.05）。

表3 血根堿對HCT-8 的遷移抑制率（%，±s）

表3 血根堿對HCT-8 的遷移抑制率（%，±s）

注：與對照組比較，aP＜0.05

血根堿濃度0 μmol/L 2 μmol/L 4 μmol/L 8 μmol/L實驗次數3333細胞遷移率59.43±5.05 24.55±5.45a 15.50±3.38a 3.36±2.37a

圖3 血根堿治療HCT-8 細胞劃痕實驗的代表性圖片（×16）

3.5 血根堿對結腸癌細胞中E-cad、N-cad、PI3K、AKT 蛋白水平的影響 如圖4 和表4 所示，血根堿以濃度依賴性提高了HCT-8 細胞E-cad 的表達，降低了N-cad 的表達（P<0.05）。此外，血根堿明顯下調PI3K、p-AKT、mTOR 的蛋白表達水平（P<0.05）。

表4 血根堿治療HCT-8 細胞后相關蛋白的相對表達水平（±s）

表4 血根堿治療HCT-8 細胞后相關蛋白的相對表達水平（±s）

注：PI3K 為磷脂酰肌醇3-激酶；AKT 為絲氨酸/蘇氨酸激酶；p-AKT 為磷酸化AKT；mTOR 為雷帕霉素靶蛋白；E-cad 為E-鈣黏蛋白；N-cad 為N-鈣黏蛋白；與0 μmol/L 血根堿組比較，aP＜0.05

血根堿濃度0 μmol/L 2 μmol/L 4 μmol/L 8 μmol/L實驗次數3333 E-cad 0.44±0.11 0.60±0.02a 0.86±0.07a 1.00±0.03a N-cad 1.00±0.08 0.80±0.12a 0.51±0.08a 0.29±0.03a PI3K 1.00±0.05 0.88±0.04a 0.81±0.03a 0.67±0.06a AKT 1.00±0.14 1.11±0.09 1.00±0.07 0.97±0.01 p-AKT 1.00±0.08 0.77±0.06a 0.70±0.03a 0.47±0.03a mTOR 1.00±0.09 0.79±0.13a 0.55±0.11a 0.34±0.03a

圖4 血根堿治療HCT-8 細胞后相關蛋白的代表性圖片

3.6 血根堿在體內對結腸癌的影響 為明確血根堿在體內對結腸癌的抑制作用，我們構建了HCT-8 皮下荷瘤小鼠模型。相較于對照組，血根堿治療組小鼠腫瘤體積（見圖5）及腫瘤質量（見表5）明顯下降（P<0.05）。此外，治療過程中兩組小鼠體質量未出現明顯差異，提示血根堿能夠在不對宿主造成藥物毒性的狀態下抑制結腸癌腫瘤生長。

表5 HCT-8 細胞荷瘤小鼠在血根堿治療期間皮下腫瘤體積大小及腫瘤質量（±s）

表5 HCT-8 細胞荷瘤小鼠在血根堿治療期間皮下腫瘤體積大小及腫瘤質量（±s）

注：與對照組同期比較，aP＜0.05

組別對照組血根堿組鼠數33第0 天105.78±6.63 108.14±4.88腫瘤體積（mm3） 腫瘤質量（g）1.01±0.21 0.63±0.11a第28 天862.28±133.90 367.48±30.17a

圖5 HCT-8 細胞荷瘤小鼠在血根堿治療后皮下腫瘤圖片

4 討 論

既往研究表明，血根堿可以在頭頸癌、肺癌、胃癌等多種癌癥中誘導凋亡從而抑制癌癥的發生發展[3]。PI3K/AKT 信號通路在許多腫瘤中出現異常活動，并參與調控細胞增殖、轉化、細胞外基質降解等功能，激活肝癌、口癌、消化道腫瘤的全程[4]。mTOR 拾取并整合由營養攝入、生長因子和其他細胞刺激引發的信號，以調節下游信號傳導和蛋白質合成。通過其下游效應器4EBP1 和P70S6 激酶（S6K），參與將mRNA核糖體翻譯成細胞生長、細胞周期進程和細胞代謝所必需的蛋白質[5]。此外，血根堿可通過PI3K/AKT 信號通路失活誘導人口腔鱗狀細胞癌KB 細胞凋亡[6]。因此，本研究旨在探索血根堿是否可以通過調控PI3K/AKT 通路抑制結腸癌細胞。

本研究檢測了不同濃度的血根堿對結腸癌細胞的增殖、遷移等的影響。結果表明，血根堿能夠呈濃度依賴性地抑制結腸癌HCT-8 和/或SW-620 細胞的增殖、遷移等能力；并在體內實驗發現，血根堿能夠有效抑制結腸癌腫瘤生長；隨著血根堿濃度的增高，PI3K、AKT、mTOR 的蛋白表達量受到明顯抑制，說明血根堿可抑制PI3K 磷酸化，減少AKT 活化抑制下游蛋白信號轉導，負向調節PI3K/AKT 信號通路抑制結腸癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力。

總之，本研究結果表明，血根堿對結腸癌細胞的生長表現出有效的抑制作用，可能通過下調PI3K/AKT/mTOR 通路影響結腸癌細胞的生物活性。