西紅花顆粒制備工藝及質(zhì)量控制研究

李 潔 姚 沖 朱方劍 孫振華 向 文

西紅花是一種鳶尾科番紅花屬的多年生花卉，又名番紅花、藏紅花，原產(chǎn)于歐洲及中亞地區(qū)，在我國西藏、上海、浙江等地均有栽培，中醫(yī)認(rèn)為其具有活血化瘀、涼血解毒、解郁安神等功效[1]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，西紅花的藥理活性主要表現(xiàn)為抗氧化、抗抑郁、抗腫瘤，在神經(jīng)保護(hù)、心血管疾病、肝臟保護(hù)、降低血糖等方面運(yùn)用廣泛[2-5]。2019 年11 月25 日，國家衛(wèi)健委和市場監(jiān)管總局食品安全標(biāo)準(zhǔn)與監(jiān)測評估司將西紅花納入按照傳統(tǒng)既是食品又是中藥材的物質(zhì)目錄管理，同時(shí)作為新的“浙八味”之一，其在醫(yī)藥、食品、保健品等領(lǐng)域的應(yīng)用越來越廣。鮮品西紅花柱頭不易保存，通過干燥雖然可較長時(shí)間保存，但是西紅花遇光有效成分易分解[6]。在長期貯存過程中，西紅花中有效成分含量受貯存條件、時(shí)間影響顯著。故將西紅花制成顆粒制劑，分裝于避光錫紙中，一方面便于攜帶、存放與服用，另一方面能保證有效成分含量和臨床療效。本文擬對西紅花顆粒的成型工藝及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行研究，為西紅花相關(guān)產(chǎn)品的后續(xù)開發(fā)與臨床應(yīng)用提供思路。

1 儀器與試劑

高效液相色譜儀（e2695，美國Waters 公司）；十萬分之一分析天平[XS205DU，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]；超聲波清洗器（KQ3200E 型，昆山市超聲儀器有限公司）；電熱鼓風(fēng)恒溫干燥箱（101-2AB 型，天津市泰斯特儀器有限公司）；超純水系統(tǒng)（Milli-QA10 型，美國默克密理博公司）。

西紅花藥材，購買于浙江省建德市三都鎮(zhèn)，經(jīng)錢曉東主任藥師鑒定為番紅花的干燥柱頭；西紅花苷-Ⅰ對照品（批號(hào)111588-201704，含量88.4%，中國食品藥品檢定研究院）、西紅花苷-Ⅱ?qū)φ掌罚ㄅ?hào)111589-201705，含量92.2%，中國食品藥品檢定研究院）、苦番紅花素對照品（批號(hào)112056-202001，含量97.6%，中國食品藥品檢定研究院）；乙醇（分析純，南京化學(xué)試劑股份有限公司）、乙腈（色譜純，德國Merck 公司）、甲醇（分析純，南京化學(xué)試劑股份有限公司）、乙酸乙酯（分析純，南京化學(xué)試劑股份有限公司）；麥芽糊精、糊精、羥丙甲纖維素、預(yù)膠化淀粉等輔料（分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 西紅花提取物細(xì)粉制備 取西紅花藥材適量并粉碎，以50%乙醇為溶劑，在冰浴中超聲提取30 min，濾過，濾液濃縮冷凍真空干燥24 h，過100 目篩即得。

2.2 輔料種類選擇 西紅花提取物細(xì)粉顯深紅色且具有易吸濕的特性，為了降低干燥產(chǎn)物的吸濕性，展現(xiàn)主要產(chǎn)物的色澤，同時(shí)為了增強(qiáng)有效成分的穩(wěn)定性，因此考慮向其中加入適當(dāng)?shù)妮o料制成顆粒劑，以滿足生產(chǎn)的需求，便于服用。目前常用的稀釋劑有預(yù)膠化淀粉、麥芽糊精和糊精，常用的黏合劑有水、乙醇和羥丙甲纖維素。參照藥典西紅花每日給藥量及本次提取率，本實(shí)驗(yàn)初步確定向1.5 g 西紅花提取物細(xì)粉中加入適量的填充劑和粘合劑制成顆粒，并考察粘合劑的種類，填充劑的種類和用量，選擇最佳的制備工藝。

2.2.1 填充劑種類選擇 精密稱取西紅花提取物細(xì)粉，分別加入預(yù)膠化淀粉、麥芽糊精、糊精混勻，慢慢加水揉搓制得軟材，擠出制粒，由結(jié)果可知，選用糊精作為填充劑，制得軟材黏性、顏色適中，制粒過程較松散且較軟，適合擠壓制粒且粒徑合適，所以選糊精作為填充劑。結(jié)果見表1。

表1 稀釋劑選擇結(jié)果

2.2.2 黏合劑種類選擇 精密稱取西紅花提取物細(xì)粉1.5 g 和糊精48.5 g，分別加入水、0.5%羥丙甲纖維素、2%羥丙甲纖維素、3%羥丙甲纖維素制得軟材，過18 目篩制粒，于70 ℃鼓風(fēng)烘箱干燥20 min，用1 號(hào)篩和5 號(hào)篩測粒度分布。根據(jù)5 次試驗(yàn)對比，使用0.5%羥丙甲纖維素作黏合劑，軟材黏性適中，適合制粒，且成型率最高，同時(shí)休止角、含水量適中，因此選擇0.5%羥丙甲纖維素作黏合劑，結(jié)果見表2。

表2 黏合劑選擇結(jié)果

2.3 輔料配比考察 前面的試驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，單用糊精做填充劑制粒雖然適合制軟材，但最后制得的顆粒硬度過低，細(xì)粉多，因此考慮麥芽糊精和糊精混合使用作填充劑。精密稱取西紅花提取物細(xì)粉1.5 g，選擇以下5 個(gè)比例（質(zhì)量比）對輔料進(jìn)行考察并過16目篩，記錄各比例條件下的結(jié)果。根據(jù)軟材及制粒情況和顆粒溶化性分析，麥芽糊精與糊精比例為1∶15時(shí)，顆粒軟，成型好。結(jié)果見表3。

表3 輔料用量配比選擇結(jié)果

2.4 吸濕性考察 將盛有氯化鈉飽和溶液的玻璃干燥器置于25 ℃恒溫干燥箱內(nèi)恒溫96 h，此時(shí)干燥箱內(nèi)相對濕度為80%。分別精密稱取3 份顆粒放于已經(jīng)恒重的稱量瓶中，輕輕搖晃使顆粒均勻分布，精密稱定，置于盛有氯化鈉飽和溶液的干燥器內(nèi)，于溫度為25 ℃，相對濕度為75%的恒溫箱內(nèi)保存，定時(shí)稱量，計(jì)算增重比例。結(jié)果如表4 所示，3 批顆粒24 h吸濕增重比例小于5%，96 h 吸濕增重比例在5%左右，說明該工藝下制得的顆粒有引濕性，但是比較穩(wěn)定。

表4 吸濕性考察結(jié)果

2.5 制粒工藝條件驗(yàn)證 精密稱取西紅花提取物細(xì)粉1.5 g，麥芽糊精3 g，糊精45 g，優(yōu)化的制備工藝，制備3 批顆粒，以軟材及制粒情況、流動(dòng)性、成型率、溶化性、吸濕性為指標(biāo)進(jìn)行質(zhì)量檢查，考察工藝的穩(wěn)定性。結(jié)果如表5 所示，3 份處方所制得的顆粒，從顆粒成型性、成型率、流動(dòng)性、溶化性等指標(biāo)來看，該工藝較為穩(wěn)定。

表5 制粒工藝條件驗(yàn)證

2.6 薄層色譜鑒定 取本品顆粒20 mg，加入甲醇1 mL，超聲處理10 min，放置使澄清，取上清液作為供試品溶液。另取西紅花對照藥材20 mg，同法制成對照藥材溶液。參照薄層色譜法（通則0502）試驗(yàn)，吸取供試品溶液、對照藥材溶液、對照品溶液適量，分別點(diǎn)于同一硅膠G 薄層板上，以乙酸乙酯-甲醇-水（100∶16.5∶13.5）為展開劑，展開，取出，晾干，分別置日光和紫外光燈（365 nm）下檢視。薄層色譜鑒別結(jié)果顯示，供試品色譜中，在與對照藥材色譜和對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)（避光操作），具有良好的專屬性，結(jié)果見圖1。

圖1 西紅花顆粒薄層色譜圖（A 紫外，B 可見光）

2.7 含量測定

2.7.1 色譜柱條件 色譜柱：Ultimate Plus C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；以乙腈為流動(dòng)相A，以水為流動(dòng)相B，梯度洗脫：0～2 min，13%A；20～23 min，13%→23%A；23～45 min，23%→25%；45～50 min，25%→50%A；50～55 min，50%→13%A；55～60 min，13%A；柱溫：30 ℃；流速：1.0 mL/min；檢測波長254 nm，440 nm；進(jìn)樣量：10 μL，高效液相色譜圖見圖2。

圖2 西紅花高效液相色譜圖

2.7.2 供試品溶液制備 取西紅花顆粒50 mg，精密稱定，置50 mL 棕色量瓶中，加稀乙醇40 mL，超聲處理（功率300 W，頻率50 kHz）30 min，放至室溫，加稀乙醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.7.3 對照品溶液制備 取西紅花苷-Ⅰ對照品22.69 mg、西紅花苷-Ⅱ?qū)φ掌?0.88 mg、苦番紅花素對照品20.79 mg 分別置于50 mL 棕色容量瓶中，加稀乙醇使溶解，并稀釋至刻度，搖勻；精密量取上述西紅花苷-Ⅰ對照品溶液1 mL、西紅花苷-Ⅱ?qū)φ掌啡芤? mL、苦番紅花素對照品溶液1 mL 置同一20 mL 棕色容量瓶中，加稀乙醇稀釋至刻度，搖勻，即得每1 mL 含西紅花苷-Ⅰ20.06 μg、西紅花苷-Ⅱ19.25 μg 和苦番紅花素20.29 μg 的混合溶液。

2.7.4 線性關(guān)系考察 取上述混合對照品備用液，分別吸取2、5、8、10、15、20 μL 注入高效液相色譜儀，按上述色譜條件測定。以對照品溶液的濃度（X）為橫坐標(biāo)，以峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程，見表6。

表6 線性關(guān)系試驗(yàn)結(jié)果

2.7.5 精密度考察 精密吸取上述混合對照品溶液，同時(shí)按照上述色譜條件連續(xù)測定6 次，記錄色譜峰面積，測定西紅花苷-Ⅰ、西紅花苷-Ⅱ和苦番紅花素峰面積的RSD 分別為0.70%、0.93%、0.51%；表明儀器精密度良好。

2.7.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批西紅花顆粒樣品，按上述方法制備5 份供試品溶液，同時(shí)按照上述色譜條件測定西紅花顆粒各指標(biāo)性成分的含量，計(jì)算其RSD，結(jié)果顯示，西紅花苷-Ⅰ、西紅花苷-Ⅱ和苦番紅花素含量RSD 分別為0.82%、0.95%、0.62%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.7.7 樣品穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密稱取西紅花顆粒50mg，按供試品溶液的制備方法制備供試液。分別于配置后0、2、4、8、12、20、24 h 進(jìn)樣測定峰面積，西紅花苷-Ⅰ峰面積RSD=1.25%，西紅花苷-Ⅱ峰面積RSD=1.33%，苦番紅花素峰面積RSD=1.06%，表明樣品在24 h 內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.7.8 加樣回收試驗(yàn) 取已知含量的西紅花顆粒樣品（西紅花苷-Ⅰ31.02μg/mg、西紅花苷-Ⅱ6.76μg/mg、苦番紅花素20.52 μg/mg），稱定6 份樣品25 mg，精密稱定，每份分別精密加入西紅花苷-Ⅰ802.32 μg（401.16 μg/mL，2 mL）、西紅花苷-Ⅱ 192.51 μg（385.03 μg/mL，0.5 mL）、苦 番 紅 花 素405.82 μg（405.82 μg/mL，1 mL），采用“2.7.2”項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，按“2.7.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣分析計(jì)算，西紅花苷-Ⅰ的平均回收率為99.23%，RSD 為0.89%；西紅花苷-Ⅱ的平均回收率為93.42%，RSD為1.07%；苦番紅花素的平均回收率為95.57%，RSD為0.86%，表明該方法回收率良好。

2.7.9 含量測定 取不同批號(hào)的3 份顆粒，按照“2.7.2”項(xiàng)下制備供試品溶液，進(jìn)行測定，西紅花苷-Ⅰ、西紅花苷-Ⅱ和苦番紅花素含量，結(jié)果見表7。按照2020 版《中國藥典》規(guī)定，西紅花苷-Ⅰ和西紅花苷-Ⅱ總量不得少于10%（100 μg/mg），苦番紅花素不得少于5%（50 μg/mg），由處方計(jì)算，樣品含西紅花生藥0.2 g/g，故成品西紅花苷-Ⅰ和西紅花苷-Ⅱ總量理論最低含量為20 mg/g，苦番紅花素理論最低含量10 mg/g。制成制劑后，藥材轉(zhuǎn)移率在49.01%～51.23%制劑工藝較為穩(wěn)定[7]。故成品西紅花苷-Ⅰ和西紅花苷-Ⅱ總量含量最低范圍為9.80～10.25 mg/g，苦番紅花素含量最低范圍為4.90～5.12 mg/g。從制作的3 批顆粒樣品結(jié)合生產(chǎn)實(shí)際考慮，故本標(biāo)準(zhǔn)西紅花苷-Ⅰ和西紅花苷-Ⅱ總量最低限量暫定10.00 mg/g，苦番紅花素含量最低限量5.00 mg/g。

表7 含量測定結(jié)果（μg/mg）

3 討 論

3.1 提取方法 西紅花柱頭含有多種西紅花苷和苦番紅花素，其中苷類主要以西紅花苷-Ⅰ和西紅花苷-Ⅱ?yàn)橹鳎伎偽骷t花苷90%以上。兩類成分極性大，易溶于水、乙醇等有機(jī)溶劑。周桂芬等[8]研究結(jié)果表明，相比水作為溶劑，西紅花苷在稀乙醇中的溶解性更好，同時(shí)也表明使用超聲法提取對西紅花苷的提取效率更高，因此本試驗(yàn)中主要成分含量測定參照中國藥典，選取50%乙醇作為提取溶劑，提高了測定結(jié)果與中國藥典法的相關(guān)性。也有文獻(xiàn)指出，西紅花苷-Ⅰ和西紅花苷-Ⅱ在40 ℃時(shí)提取率最高[9]，這與本試驗(yàn)提取溫度和藥典規(guī)定不同，仍需進(jìn)一步研究。

3.2 劑型選擇 基于干燥西紅花藥材儲(chǔ)存過程中易吸濕且光線條件對其有效成分影響較大，本研究將西紅花柱頭通過提取并加入麥芽糊精、糊精、0.5%羥丙甲纖維素等輔料制成顆粒。通過現(xiàn)代制劑工藝手段，在保證藥品色澤、質(zhì)量的同時(shí)，通過密封包裝降低了藥物的吸濕性，減少光照影響，方便保存、攜帶和服用。西紅花顆粒劑型有助于后續(xù)配方顆粒和藥食同源產(chǎn)品的開發(fā)。

3.3 制備工藝輔料選擇 本研究最終確定處方為提取物1.5 g，麥芽糊精3 g，糊精45 g。試驗(yàn)結(jié)果表明，通過提取物細(xì)粉加輔料制粒的方法工藝較為穩(wěn)定，具有可行性。質(zhì)量評價(jià)方法重復(fù)性好、專屬性強(qiáng)。相比其他顆粒，為保持西紅花獨(dú)特的味道、顏色和香味，因此制劑工藝中未考慮甜味劑、著色劑等輔料的添加。

3.4 質(zhì)量評價(jià) 本試驗(yàn)通過薄層色譜和高效液相色譜建立了西紅花顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，評價(jià)的方法專屬性強(qiáng)、重復(fù)性好，可以保證用藥的安全與有效。后續(xù)研究中將嘗試?yán)媒t外等光譜技術(shù)在西紅花顆粒制備工藝過程中和成品后的質(zhì)量控制，為后續(xù)進(jìn)一步開發(fā)西紅花配方顆粒及其其他產(chǎn)品奠定了基礎(chǔ)。

4 總 結(jié)

本試驗(yàn)通過醇提，冷凍真空干燥，加入輔料制得的西紅花顆粒具有較好的色、香、味，優(yōu)選的工藝穩(wěn)定可行。但本試驗(yàn)中僅對西紅花中代表“色—味物質(zhì)基礎(chǔ)”的西紅花苷和番紅花苦素做了含量測定，后續(xù)研究中可以再增加“香物質(zhì)基礎(chǔ)”藏紅花醛的含量測定，全面提升西紅花顆粒的評價(jià)指標(biāo)。此外，西紅花中“色—香—味”三類組分的紫外吸收波長相差大，在質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提升方面可通過DAD 檢測器波長切換技術(shù)，建立西紅花“色—香—味”多組分指紋圖譜。