珍珠龍膽石斑魚氣調保活工藝的研究

黃湘湄,黃 和,周倩帆,陸澤峰

( 廣東海洋大學 食品科技學院,廣東省水產品加工與安全重點實驗室,廣東普通高等學校水產品深加工重點實驗室,廣東 湛江 524088 )

魚肉是人體所需優質蛋白質的主要來源,高需求量直接促使水產養殖業的迅速發展,預計至少到2025年仍會持續增長[1]。中國漁業統計年鑒2015年至2020年數據顯示,石斑魚(Epinephelus)養殖量年增長速率在10種養殖海水魚中位列第一,由2014年的8.8×104t增至2019年的1.83×105t[2]。珍珠龍膽石斑魚(E.fuscoguttatusi♀×E.lanceolatus♂)俗稱龍虎斑或珍珠斑,是以棕點石斑魚(E.lanceolatus,俗稱老虎斑)為母本,鞍帶石斑魚(E.fuscoguttatus,俗稱龍膽斑)為父本的雜交新品種[3],是一種生長速度快、抗病力強且養殖產量高的暖水性海水經濟魚類養殖品種,具有膠原蛋白含量高、肉質纖維細膩等優點[4],深受消費者青睞。目前國內外水產品保活運輸方式主要包括有水保活運輸和無水保活運輸。珍珠龍膽石斑魚以有水鮮活流通為主,銷售市場有限。傳統鮮活運輸過程中常因水質惡化、應激、缺氧、振動等不利因素使其產生應激反應,劇烈掙扎,極易相互扎傷造成死亡[3,5-6]。且存在運輸密度低、存活率低、運輸后品質劣變及食用安全等問題。無麻醉劑添加的低溫無水保活運輸是一種低成本、高存活率、品質變化小的綠色、安全的新型活體流通模式,具有廣闊的應用前景[7]。

氣調包裝是將一種或多種氣體充入包裝袋中,減緩食品劣變速率以維持新鮮度與品質,進而延長食品貨架期的技術[8]。目前在水產品行業主要應用于保鮮,具有抑制細菌腐敗、抗氧化、保持水產品品質、延長貨架期等優點[9-10]。在黑鯛(Acanthopagrusschlegelii)[11]、泥蚶(Tegillarculagranosa)[12]、鯽(Carassiusauratus)[13]、海灣扇貝(Argopectenirradias)[14]、黃顙魚(Pseudobagrusfulvidraco)[15]、大菱鲆(Psettamaxima)[16]、凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)[17]、花鱸(Lateolabraxmaculatus)[18]、菲律賓蛤仔(Ruditapesphilippinarum)[19]等水產品保活中已有初步研究,但氣體比例研究范圍過于寬泛,主要聚焦于純氧,保活效果不佳,相關報道研究缺乏針對性,不利于實際應用中精確控制,且造成資源浪費。筆者首次以珍珠龍膽石斑魚為試驗對象,通過單因素試驗和正交試驗篩選優化氣調保活工藝,并對氣調保活過程中肌肉成分、血清生化指標進行分析,旨在開發珍珠龍膽石斑魚的無水氣調保活工藝,為其實際應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

珍珠龍膽石斑魚1齡,平均體質量(536.0±25.5) g,平均體長(32.25±1.42) cm,購自廣東湛江市東風水產品批發市場,規格一致,體表無損傷,健康無病害,加水充氧運輸至實驗室。于119 cm×89 cm×32 cm暫養池中暫養24 h用于試驗。暫養池條件:采用新鮮過濾海水,鹽度20～24,水溫21～23 ℃,溶解氧質量濃度6.5～8.5 mg/L,pH 7.2±0.5,試驗魚密度85 g/L。

1.2 儀器與設備

CK-901冷卻機組(深圳祎祎科技有限公司);GXZ-280D智能型光照培養箱(105 cm×54 cm×54 cm,控溫0～50 ℃,寧波市科技園區新江南儀器有限公司);MA 100水分分析儀(德國賽多利斯集團);3-550PD馬福爐(美國Neytech公司);SZF-06A粗脂肪測定儀(上海洪紀儀器設備有限公司);VAP 450全自動凱氏定氮儀(德國Gerhardt公司);Cary 紫外可見分光光度計(美國安捷倫科技有限公司);Varioskan Flash全自動酶標儀(賽默飛世爾科技中國有限公司);3660系列模擬量流量計(日本KOFLOC公司)。

血糖、尿素氮、甘油三酯、谷草轉氨酶、谷丙轉氨酶、酸性磷酸酶、堿性磷酸酶試劑盒(南京建成生物工程研究所);皮質醇[江蘇魚皮質醇酶聯免疫分析試劑盒]。O2、CO2、N2純度均為99.9%(南風牌,湛江世紀雙龍工業氣體有限公司)。試驗海綿(森森集團股份有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 低溫保活臨界溫度的測定

珍珠龍膽石斑魚經停食暫養24 h后,采用梯度降溫模式[5]將水溫由23 ℃降至10 ℃ (23～15 ℃,2 ℃/h ;15～10 ℃,1 ℃/h),觀察并記錄珍珠龍膽石斑魚在不同溫度下的行為特征和呼吸頻率。以魚體側翻,對外界刺激無反應,鰓蓋張合頻率穩定狀態下的溫度作為本試驗的低溫保活臨界溫度。

1.3.2 單因素試驗設計

參照文獻中的氣體比例[11,13,15,18]、保濕材料[15,20-22]、保活溫度[23]進行試驗設計。珍珠龍膽石斑魚經停食暫養24 h后,按上述梯度降溫方式降溫至魚體進入休眠狀態,選取不同保濕材料(紗布、海綿、絲瓜筋、水苔、木屑)包裹魚身保持魚體表面濕潤,迅速放入雙層自封袋中,充入不同配比(體積比)[V(O2)∶V(CO2)∶V(N2)=65∶5∶30、65∶10∶25、75∶0∶25、75∶5∶20、75∶10∶15、85∶0∶15、85∶5∶10、85∶10∶5、95∶0∶5、95∶5∶0,純氧]的氣體后迅速封口,置于不同溫度(7、9、11、13、15、17、19、21、23 ℃)的培養箱中靜態模擬運輸,每組6尾魚,分別考察保濕材料、氣體配比、保活溫度對珍珠龍膽石斑魚保活時長的影響。

1.3.3 正交試驗優化

根據單因素試驗結果,采用正交試驗進一步對珍珠龍膽石斑魚無水保活工藝條件進行優化,L9(34)正交試驗因素水平編碼見表1。

表1 正交試驗因素與水平

1.3.4 肌肉成分的測定

參照文獻[24]的試驗方法,珍珠龍膽石斑魚經停食暫養24 h后,挑選66尾規格一致、行為活動正常、無機械性損傷的珍珠龍膽石斑魚于最佳氣調保活條件下靜態模擬無水保活運輸,將其隨機分為11組,每組6尾。于暫養24 h后直接取樣,記為正常對照組(NC組);暫養后以上述方式進行休眠取樣,記為休眠組(DC組);休眠后進行無水保活2、4、6、8、10、12、13 h以及13 h后于室溫海水復蘇6、12 h后取樣,記為無水保活組(WD組),分別記為WD 2 h、WD 4 h、WD 6 h、WD 8 h、WD 10 h、WD 12 h、WD 13 h、R 6 h、R 12 h組。取背部肌肉,用預冷至4 ℃的無菌生理鹽水洗凈表面血跡并用濾紙吸干表面水分,絞碎液氮速凍后于-80 ℃下凍存待測。暫養24 h后、各保活階段結束后對珍珠龍膽石斑魚分別進行稱量質量并記錄,計算累積體質量損失率。水分測定參考國家標準GB 5009.3—2010(105 ℃常壓干燥法);粗蛋白測定參考國家標準GB 5009.6—2016(凱氏定氮法);粗脂肪測定參考國家標準GB 5009.5—2016(索氏抽提法);灰分測定參考國家標準GB 5009.4—2016。

1.3.5 血清生化指標的測定

參照文獻[25]的試驗方法,用200 mg/L 間氨基苯甲酸乙酯甲磺酸鹽快速麻醉魚體,10 mL注射器插入尾靜脈取血,全血不加抗凝劑,4 ℃靜置2 h,待血液明顯分層后以3000 r/min 4 ℃(離心半徑10 cm)離心20 min取血清,-80 ℃凍存待測。其中皮質醇含量采用酶聯免疫法測定;指標血糖、尿素氮、甘油三酯、谷草轉氨酶、谷丙轉氨酶、酸性磷酸酶、堿性磷酸酶均采用試劑盒進行測定。

1.3.6 數據處理

采用SPSS 25.0軟件對試驗數據進行統計分析,結果以平均值±標準差表示,在單因素方差分析的基礎上,結合Tukey檢驗進行鄧肯多重比較,P<0.05表示具有顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 低溫保活臨界溫度的確定

珍珠龍膽石斑魚的呼吸頻率隨著水溫的降低逐漸降低(圖1)。當溫度降至15 ℃時,魚體游動減慢,呼吸頻率(20±1) 次/min;降溫至13 ℃時,魚體較鎮定貼于缸底,魚體不游動,反應能力降低,呼吸頻率(14±1) 次/min;降溫至12 ℃時,魚體基本失去平衡,身體側翻,對外界刺激無明顯反應,鰓蓋張合頻率穩定,呼吸頻率(12.61±0.58) 次/min;降溫至11 ℃時,呼吸頻率無顯著變化,但魚體會出現激烈的應激反應,出現撞擊缸壁、四處亂竄、魚頭搖擺不定、反復浮頭、彎曲成弓形、肚皮朝上等應激行為;水溫降至10 ℃時,呼吸頻率7～9 次/min,魚體呼吸不規律,出現咧鰓張嘴、尾部充血等現象,因此本試驗將12 ℃作為珍珠龍膽石斑魚的低溫保活臨界溫度。與范秀萍等[26]的研究結果有所偏差。

圖1 不同溫度下珍珠龍膽石斑魚的呼吸頻率Fig.1 Respiratory rate of hybrid grouper E. fuscoguttatus ♀× E. lanceolatus♂ at different temperatures

2.2 珍珠龍膽石斑魚氣調保活工藝優化試驗結果

2.2.1 單因素試驗結果

保活時長決定了珍珠龍膽石斑魚保活運輸中的實際應用與經濟效益。氣體配比V(O2)∶V(CO2)∶V(N2)為85∶0∶15時保活效果最佳,珍珠龍膽石斑魚無水保活時長為(13.12±0.15) h(圖2a);氣體配比分別為75∶0∶25、65∶5∶30時,存活時長為(11.57±0.34)、(11.26±0.15) h。高體積分數的CO2抑制了魚體的呼吸作用,不利于其存活,且伴隨著一定的應激反應。隨著氧氣體積分數的升高,無水保活時間延長,氧氣體積分數為85%時,保活效果最佳,氧氣體積分數繼續升高,保活時長呈下降趨勢。其原因可能是低體積分數氧氣易造成珍珠龍膽石斑魚缺氧窒息而死亡,而高體積分數氧氣增加了氧自由基的含量,造成魚體細胞的損傷。張玉晗等[18]研究包裝氧氣濃度對無水活運花鱸組織結構及相關酶活性的影響得出了類似結果,發現花鱸體表黏液溶菌酶活性在包裝充氧80%仍能維持在高水平,且鰓絲最接近正常形態。在7～11 ℃,進行無水保活珍珠龍膽石斑魚的保活時長均低于7 h,保活效果較差(圖2b);溫度為15 ℃時,無水保活效果顯著優于其余組(P<0.05),為(12.90±0.13) h;溫度高于15 ℃時,保活時長隨保活溫度的升高而逐漸降低,與Fan等[23]的研究結果基本一致。溫度過高或過低魚體均會產生脅迫或應激,不利于無水保活。海綿和紗布作為保濕材料更有利于珍珠龍膽石斑魚的保活(P<0.05),保活時長分別為(13.16±0.16)、(12.89±0.07) h(圖2c),這可能與其保水性好、包裹性強有關;水苔的保活效果一般,保活時長為(11.65±0.09) h;絲瓜筋和木屑具有較差的鎖水性,其保活時長最短。

圖2 不同因素對珍珠龍膽石斑魚保活時長的影響Fig.2 Effects of different factors on survival time of hubrid grouper E. fuscoguttatus ♀× E. lanceolatus♂

2.2.2 正交試驗結果

影響珍珠龍膽石斑魚保活時長的各因素為保活溫度(B)>氣體配比(A)>保濕材料(C)(表2)。珍珠龍膽石斑魚無水氣調保活最佳工藝條件為A3B1C3,即氣體配比為V(O2)∶V(CO2)∶V(N2)=85∶0∶15,保活溫度為15 ℃,保濕材料為海綿。

表2 正交試驗數據分析結果

2.2.3 最佳條件驗證結果

珍珠龍膽石斑魚在最佳氣調保活條件下平均保活時長為(13.88±1.00) h,無水保活12.0～12.5 h珍珠龍膽石斑魚的存活率為100%,保活13 h時存活率仍達90%,證實了該條件的穩定可靠性(表3)。

表3 驗證試驗結果

2.3 氣調保活對珍珠龍膽石斑魚的累積體質量損失率的影響

魚體質量與魚體肌肉中蛋白質、脂肪等成分含量息息相關,是決定其最終售價的關鍵因素,更是衡量氣調無水保活運輸條件優劣的重要指標。珍珠龍膽石斑魚的體質量損失率隨保活時間的延長而逐漸升高,復水12 h后累積體質量損失率達(6.49±0.15)%,可能是保活階段均未投食,為維持正常的生命活動,魚體消耗自身的能量物質導致體質量逐漸降低(圖3)。魚體在適應無水環境過程中消耗了較多能量,無水保活2 h時體質量損失率顯著高于休眠組(P<0.05);重新回歸水體環境,游動消耗大量能量導致體質量急速下降。

圖3 不同保活階段珍珠龍膽石斑魚的累積體質量損失率Fig.3 Cumulative weight loss rate of hybrid grouper E. fuscoguttatus ♀× E. lanceolatys ♂ at different keep-alive stages

2.4 不同保活階段珍珠龍膽石斑魚肌肉成分含量的變化

不同保活階段的珍珠龍膽石斑魚背肌的水分含量、灰分含量、粗脂肪含量、粗蛋白含量見圖4。珍珠龍膽石斑魚氣調保活至復水階段,背肌中的水分含量無顯著性變化(P>0.05);灰分含量隨著保活時間的延長略微升高;粗蛋白、粗脂肪兩者含量均逐漸降低,蛋白質減少了4.21 g/100 g,脂肪減少了2.66 g/100 g。

圖4 不同保活階段珍珠龍膽石斑魚背肌的營養成分含量的變化Fig.4 Changes in nutritional components content in dorsal muscle of hybrid grouper E. fuscoguttatus ♀×E. lanceolatus♂ at different keep-alive stages

2.5 不同保活階段珍珠龍膽石斑魚血清生化指標的變化

最佳氣調保活條件下珍珠龍膽石斑魚不同保活階段血清生化指標的變化見表4。血糖含量、皮質醇含量隨保活時間的延長呈曲線變化,尿素氮含量、谷草轉氨酶、谷丙轉氨酶、酸性磷酸酶活性明顯升高,甘油三酯含量、堿性磷酸酶活性有所下降;氣調保活中珍珠龍膽石斑魚腎臟、肝臟、免疫系統均受到一定程度的損傷但復蘇之后均有所恢復趨于正常水平。

表4 不同保活階段珍珠龍膽石斑魚血清生化指標的變化

3 討 論

3.1 珍珠龍膽石斑魚氣調保活工藝研究

鮮活水產品能最大限度保留肉質原有風味與營養價值,其安全性高,市場需求量大,經濟效益高[27]。無水保活運輸方法是一種高存活率、高質量、高安全性、長時間的綠色環保運輸方法,具有運輸量大、物理損傷小等優點[28]。目前珍珠龍膽石斑魚保活運輸的研究主要聚焦于暫養方式與人工誘導休眠方式。朱乾峰[7]研究結果顯示,停食暫養24～48 h可有效緩解珍珠龍膽石斑魚捕撈、運輸所引起的應激反應,對肌肉營養成分含量無顯著影響,可有效延長保活時長。Fan等[23]采用梯度降溫方式對珍珠龍膽石斑魚進行低溫休眠處理,15～20 ℃其無水保活的存活時間為9～10 h。筆者經正交試驗得到珍珠龍膽石斑魚無水氣調保活最佳工藝條件為氣體配比為V(O2)∶V(CO2)∶V(N2)=85∶0∶15,保活溫度為15 ℃,保濕材料為海綿;平均保活時長為(13.88±1.00) h,高效延長了珍珠龍膽石斑魚無水保活時長。

3.2 不同保活階段珍珠龍膽石斑魚肌肉成分的變化

珍珠龍膽石斑魚肌肉營養成分的含量與王際英等[29]的研究結果基本一致。無水氣調保活運輸對珍珠龍膽石斑魚的肌肉水分含量影響極小,進一步證實了海綿具有優良的保濕性。灰分是經灼燒后所殘留的無機物質,珍珠龍膽石斑魚背肌中的灰分含量隨保活時間的延長略微升高,這可能是因為有機能量物質被消耗而轉化為無機物。粗蛋白、粗脂肪為功能性物質。初期低溫脅迫魚體耗費了較多能量,休眠狀態下呼吸頻率降低、新陳代謝減慢,但保活階段均未投食,體內能量物質粗蛋白、粗脂肪為維持正常生命活動被逐漸消耗,以滿足魚體自身的能量需求。隨著無水保活環境劣化,魚體應激,新陳代謝加快,對供能物質消耗增多,復水后珍珠龍膽石斑魚正常游動消耗導致兩者含量均有所降低。整個過程中脂肪含量降低的幅度遠大于蛋白質,表明氣調保活期間珍珠龍膽石斑魚體內的主要供能物質是脂肪而非蛋白質[26,30]。

3.3 不同保活階段珍珠龍膽石斑魚血清生化指標的變化

魚體發生應激反應時生命活動劇烈、新陳代謝旺盛,導致血糖水平的變化,因此血糖通常被作為可靠的生理應激指標之一[31]。本試驗結果表明,氣調保活過程中珍珠龍膽石斑魚血糖含量逐步上升,無水保活 8 h時顯著高于正常對照組(P<0.05),可能是饑餓協同環境脅迫導致魚體代謝活動增強,所需能量增多,肝糖原分解加速使血糖含量增加。適應生存環境后應激減緩,生存消耗造成無水保活10 h時血糖含量顯著下降,隨著包裝袋中氧氣的消耗以及二氧化碳的累積,生活環境惡化引起魚體發生應激反應,加速糖原分解導致血糖含量急劇升高,復蘇階段魚體饑餓不斷消耗能量,魚體內的血糖不斷被分解以能量供給機體,慢慢趨于較低水平。

皮質醇是評價魚類應激反應的指示性指標,當魚體發生應激反應時會引起各項激素水平的變化,皮質醇作為反應鏈分泌的最后一種激素,其含量隨著應激強度的增大而升高[6]。氣調保活過程中,珍珠龍膽石斑魚皮質醇含量呈直線上升,無水保活6 h時顯著上升(P<0.05),為(147.68±9.49) ng/mL。逐漸適應無水環境后趨于平緩,隨保活時間的延長,包裝袋中氧氣被消耗至魚類生命極限,皮質醇含量穩步上升。移至復蘇池珍珠龍膽石斑魚皮質醇含量仍處于較高水平,復水12 h后皮質醇含量與正常對照組一致,此時珍珠龍膽石斑魚正常平緩游動。

血中尿素氮來源于肝臟,通過腎臟隨尿液排出體外。腎臟損傷引起功能衰竭、腎炎時血液尿素氮的含量會增加,因此尿素氮可作為腎臟功能的評價指標[5]。試驗結果表明,尿素氮含量隨保活時間的延長而顯著升高(P<0.05),腎臟受到一定程度的損傷;無水保活13 h魚體應激強烈,皮質醇增大刺激血清尿素氮的釋放,腎臟受損保活時間無法延長。

甘油三酯是動物細胞儲脂的主要形式[26]。本試驗中,甘油三酯含量明顯下降,一是未投食導致魚體能量物質的消耗,二是肝臟損傷阻礙了腸肝循環的正常運行。相較于無水保活13 h,復蘇階段甘油三酯含量顯著上升(P<0.05),可能是水體環境使魚體恢復活力狀態,甘油三酯通過腸肝循環被肝臟重吸收。

谷草轉氨酶、谷丙轉氨酶是魚類重要的轉氨酶,主要存在于肝臟和心肌細胞中,血清中含量極低。當肝細胞受損時,谷草轉氨酶和谷丙轉氨酶會被釋放到血液中,因此血清中谷草轉氨酶和谷丙轉氨酶活性的增加被認為是肝功能損傷最具特異性和廣泛使用的指標[32]。本試驗結果顯示,氣調保活對魚體造成損傷,兩者活性均呈現持續升高趨勢。無水保活13 h時谷草轉氨酶、谷丙轉氨酶活性顯著高于正常對照組(P<0.05),可能是長時間低溫無水環境致使魚體抗氧化系統出現紊亂,珍珠龍膽石斑魚肝臟出現不可修復的損傷。復水12 h后血清中谷草轉氨酶和谷丙轉氨酶活性顯著高于正常對照組(P<0.05),氣調保活引起的珍珠龍膽石斑魚應激反應經12 h緩解后有所恢復但仍不能完全解除。

溶酶體可通過水解細菌細胞壁組分來清除細菌,因此常用作水生生物功能防御和健康狀況的標志物,酶體膜通透性降低會釋放堿性磷酸酶、酸性磷酸酶等酶類[33],兩者可直接參與魚體中磷酸基團的轉移及鈣磷代謝,還能夠改變病原體的表面結構以增強機體對病原體的識別和吞噬能力,因而在魚體內的免疫應答和物質代謝中起到重要作用[34-35]。本試驗結果表明,珍珠龍膽石斑魚血液中堿性磷酸酶活性明顯下降,低溫無水環境導致魚體機體免疫能力降低或代謝活動下降,復水12 h后堿性磷酸酶活性回復到正常對照組水平,表明魚體恢復了正常的代謝和免疫能力,與劉驍等[25,36]的研究結果高度一致。酸性磷酸酶活性隨著保活時間的延長逐漸升高,無水環境刺激石斑魚的免疫應答引起其活性的增強,進而增強機體免疫防御能力,復水12 h后回歸正常水平,與王維政等[37]研究結果一致。

4 結 論

以存活時長為指標優化確定了珍珠龍膽石斑魚的氣調保活工藝,氣體配比為V(O2)∶V(CO2)∶V(N2)=85∶0∶15,保活溫度為15 ℃,保濕材料為海綿時,無水保活12.5 h存活率為100%。背肌水分含量無明顯變化,灰分含量略微升高,粗蛋白、粗脂肪含量逐漸降低。血糖含量、皮質醇含量隨保活時間的延長呈曲線變化,尿素氮含量,谷草轉氨酶、谷丙轉氨酶、酸性磷酸酶活性明顯升高,甘油三酯含量、堿性磷酸酶活性有所下降;氣調保活中珍珠龍膽石斑魚腎臟、肝臟、免疫系統均受到一定程度的損傷但復水之后均有所恢復趨于正常水平,且保活時長高于目前常用的純氧環境。可見氣調保活具有極高的經濟潛力,在較大程度上克服了活運時間短的問題,對促進珍珠龍膽石斑魚保活運輸、市場銷售具有較好的指導作用。