稻田適養品種呆鯉的遺傳多樣性分析

鄒 利,王金龍,2,李傳武,王冬武,曾春芳,劉明求,劉 麗,謝 敏,曾 鳴

( 1.湖南省水產科學研究所,湖南 長沙,410153; 2.湖南文理學院,環洞庭湖水產健康養殖及加工湖南省重點實驗室,動物學湖南省高校重點實驗室,常德市農業生物大分子研究中心,湖南 常德 415000 )

由于地理環境的差異和人工選育的方向不同,各地鯉(Cyprinuscarpio)在遺傳和形態上皆發生了分化,形成了地方特有鯉品系如黑龍江鯉(C.carpiohaermatopterus)、黃河鯉(C.carpiohaermatopterus)、湘江野鯉(C.carpio)、荷包紅鯉(C.carpiovar.wuyuanensis)、興國紅鯉(C.carpiovar.singguoensis)等,人工選育品種如豐鯉(C.carpiovar.singguoensis♀×C.carpiovar.mirrorsplittered♂)、建鯉(C.carpiovar.jian)、福瑞鯉(FFRCC.carpio)、芙蓉鯉(C.carpiovar.furong)等。我國傳統的稻田養魚,主要是將鯉放養于稻田環境之中,具有悠久的歷史文化傳承[1-2]。據《湘西土家族苗族自治州志》記載,湘西土家族苗族自治州自唐代就開始摸索在稻田中放魚的生產方式,稻田養魚已有1200多年的歷史[3]。在湖南湘西,稻田養殖的鯉被稱為呆鯉或埋頭鯉,其遇汛期水漲,頭埋泥中,故而得名。呆鯉肉味鮮美,是加工酸菜魚的首選魚料;其性情溫順,喜逆水上游,即使是放干稻田里的水也不輕易隨水逃跑,是開展稻田綜合種養的適養品種。呆鯉稻田養殖群體的形成,可能與上千年的稻田養殖環境有關,也可能是因為湘西山區與外界環境交流較少,相對隔離的環境使得呆鯉與其他水域和品種的鯉基因交流甚少,久而久之,便形成了這一獨特的稻田養殖群體。

養殖場在未對親魚遺傳背景進行了解的情況下,盲目地擴大繁殖,將導致群體遺傳多樣性下降、近交系數高、經濟性狀丟失、種質退化等問題[4-6]。近年來,湖南稻田綜合種養發展迅速,呆鯉苗種需求量大,對呆鯉的遺傳背景進行研究,對其苗種生產具有指導意義。微衛星作為一種發展迅速的分子標記,目前已廣泛應用于鯉群體遺傳多樣性和遺傳結構分析[7]、種質資源鑒定[8-9]、遺傳連鎖圖和數量性狀位點定位[10-11]等研究。

筆者以湘江野鯉野生群體和興國紅鯉池塘養殖群體作為對照,采用14個微衛星標記對3個湘黔山區的稻田養殖呆鯉群體的遺傳特征與遺傳結構進行研究,旨在對呆鯉的遺傳信息背景進行初步探索,為呆鯉優質遺傳資源的充分發掘與保護提供參考信息。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗用永順呆鯉群體采自湘西土家族苗族自治州永順縣,藕團呆鯉群體采自懷化市靖州自治縣藕團鄉,錦屏呆鯉群體采自黔東南苗族侗族自治州錦屏縣,湘江野鯉群體采自岳陽市湘江江段,興國紅鯉群體為湖南省水產科學研究所院養殖群體(表1)。剪取試驗魚的尾鰭,置于95%乙醇中,保存于4 ℃冰箱備用。

表1 5個鯉群體樣本采集信息

1.2 方法

1.2.1 DNA提取

參照《分子克隆實驗指南》[12],應用常規的酚-氯仿法自鰭條中提取基因組DNA。用質量分數為1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測樣本DNA質量,各組質量良好,可以進行后續的試驗。

1.2.2 引物定制

試驗采用14對在以往研究中擴增性較好的多態性微衛星引物,其中有8對引物由Crooijmans等[13]設計,另外6對引物參考文獻[14-15],引物序列見表2。試驗用特異性熒光引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。微衛星標記的正向引物5′端用fam、hex、tamrad、rox 4種熒光標記中的1種進行標記。

表2 14對鯉微衛星引物特征

1.2.3 PCR擴增

PCR反應總體系20 μL:10×PCR Buffer 2 μL,dNTP (2.5 mmol/L)1.6 μL,MgCl2(2.5 mmol/L)1.6 μL,上、下游引物(10 mmol/L)各0.6 μL,TaqDNA聚合酶0.5 μL,DNA模板(100 ng/μL)0.5 μL,雙蒸水12.6 μL。PCR擴增程序:94 ℃預變性5 min;94 ℃變性30 s,50～60 ℃退火45 s,72 ℃延伸60 s,30個循環;72 ℃延伸10 min。取 3 μL PCR擴增產物,用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測是否為有效擴增。

1.2.4 毛細管電泳樣本制備和檢測

熒光PCR產物送往生工生物工程(上海)股份有限公司進行毛細管電泳,利用GeneScan和GeneMapper 4.0等軟件進行圖像收集和數據分析,統計片段堿基數。

1.2.5 數據分析

將每個基因座的不同堿基數的DNA片段作為該座位的等位基因來處理,每個座位擴增的等位基因按其堿基數,從大到小依次定義為:1、2、3、…k,統計各群體樣本基因型。多態信息含量(PIC)根據Botstein等[16]的公式計算:

式中,Pi、Pj分別為第i和第j個(j=i+1)等位基因在群體中的頻率,n為某一基因座位上的等位基因數。

用GenAlEx軟件計算各微衛星位點在5個鯉群體中的等位基因數、有效等位基因數、雜合度、遺傳分化系數和基因流等指標,并進行各群體間的分子方差分析。

用Structure軟件分析群體遺傳結構特征,設定群體數K的估算數值為2～5,根據群體的區分程度確定最優群體數K的值。用MEGA 4.0軟件構建各群體之間的系統樹。

2 結 果

2.1 微衛星位點的電泳檢測結果

本試驗采用的14對微衛星引物在5個鯉群體中均能穩定擴增出PCR產物,產物片段長度結果見表2。

2.2 群體遺傳多樣性分析

14對微衛星引物在5個鯉群體中的擴增結果見表3。平均等位基因數為16.571～19.214,平均有效等位基因數為9.420～11.143,平均觀測雜合度為0.705～0.778,平均期望雜合度為0.884～0.893,平均多態信息含量為0.883～0.891。

表3 14對微衛星標記在5個鯉群體的遺傳多樣性參數

5個鯉群體的遺傳多樣性見表3。湘江野鯉平均等位基因數最多(19.214),錦屏呆鯉最少(16.571);藕團呆鯉的平均有效等位基因數最多(11.143),錦屏呆鯉最少(9.420);藕團呆鯉的香農-維納多樣性指數最高(2.551),錦屏呆鯉的最低(2.428);湘江野鯉的觀測雜合度最高(0.778),錦屏呆鯉的最低(0.705)。總體上,本試驗的5個鯉群體均具有較高的遺傳多樣性,3個呆鯉群體和湘江野鯉群體的多樣性水平無明顯差異。

采用哈迪-溫伯格平衡的卡方檢驗對5個群體的14個位點進行檢測發現,在5個鯉群體中均發生偏離極顯著的位點有5個,錦屏呆鯉、藕團呆鯉、永順呆鯉、湘江野鯉及興國紅鯉群體分別有12、10、7、9、8個位點表現出極顯著的遺傳不平衡狀態,表明各群體均在一定程度上偏離了哈迪-溫伯格平衡。

2.3 群體間的遺傳分化分析

GenAlEx軟件計算結果表明,5個鯉群體在14個位點上群體內的近交系數均為正值,平均值為0.166,群體存在不同程度的近交現象(表4)。本試驗的14個位點中,僅HLJ1274 位點上的遺傳分化系數大于0.05,其余位點的遺傳分化系數均小于0.05,各位點群體間的遺傳分化系數平均值為0.017(小于0.05),說明5個鯉群體間的遺傳分化較弱。基因流與遺傳分化系數為負相關的關系,基因流為3.088～27.730,各個位點基因流均大于1,其平均值為19.325,說明種群間存在一定的基因流動,遺傳變異主要來自于群體內。分子方差分析結果表明,有5%的遺傳方差來自于群體間,而95%的遺傳方差來源于群體內個體間和個體內,個體間的遺傳變異遠大于群體間的遺傳變異(表5)。用Structure軟件對5個鯉群體遺傳結構進行分析:當K=2時,興國紅鯉從5個群體中分離出來,永順呆鯉、藕團呆鯉、錦屏呆鯉與湘江野鯉主要遺傳組分相同;當K=3時,永順呆鯉與藕團呆鯉相互分離開,并且各自形成各自的遺傳組分,錦屏呆鯉介于其他2個呆鯉養殖群體之間,永順呆鯉與湘江野鯉遺傳結構更相似(圖1)。

圖1 5個鯉群體的遺傳結構Fig.1 Genetic structure bar plot of 5 populations of common carp C. carpio

表4 14個微衛星位點在5個鯉群體中的F值和基因流

表5 5個鯉群體的分子方差分析

采用MEGA 4.0軟件構建的5個鯉群體間遺傳距離系統樹見圖2,分析結果顯示,3個呆鯉群體遺傳距離較近,而湘江野鯉與興國紅鯉聚為一支。

圖2 5個鯉群體遺傳距離系統樹Fig.2 Genetic distance phylogenetic tree of 5 populations of common carp C. carpio

2.4 特有等位基因

在5個群體200尾個體的14個座位上,共有389個位點(表6)。錦屏呆鯉、藕團呆鯉、永順呆鯉、湘江野鯉、興國紅鯉分別擁有11、16、14、19、20個特有等位基因。特有等位基因的頻率普遍較低(0.013～0.056),還不能將這些基因作為區分5個群體的特異性分子標記。

表6 5個鯉群體在14 個微衛星基因座位的特有等位基因及頻率

3 討 論

3.1 5個鯉群體的遺傳多樣性分析

微衛星標記遵循孟德爾遺傳規律,具備共顯性遺傳、多態性高及易于操作等優點,在魚類種質資源評估、遺傳育種等研究中已得到廣泛應用[17-21]。本試驗采用的14個微衛星位點,在5個鯉群體中的平均有效等位基因數為9.42～11.143,多態信息含量為0.883～0.891,觀測雜合度為0.705～0.778。根據Botstein等[16]提出的衡量基因變異程度的指標,本試驗中的5個鯉群體的多態信息含量均大于0.5,均為高度多態性位點。有效等位基因數、多態信息含量、雜合度的大小近似反映出群體遺傳結構變異程度的高低[22-23]。湘江野鯉和3個呆鯉群體的觀測雜合度為0.705～0.778,表明5個鯉群體遺傳多樣性均較高,具備選育潛力。本試驗的5個鯉魚群體,有效等位基因數和群體多樣性高于其他學者關于鯉多樣性的報道。如劉臻等[24]對湘江野鯉養殖群體和自然群體的遺傳多樣性進行分析指出,平均等位基因數為6.92,平均多態信息含量為0.5860、0.5347。曾繁振等[25]利用微衛星分子標記,檢測荷包紅鯉、興國紅鯉和長江野鯉的平均等位基因數為5.4～8.2,平均多態信息含量為0.6253～0.7775。馬秀英等[26]在2個黃河鯉群體遺傳多樣性的研究中指出,人工養殖和野生鯉群體平均有效等位基因數分別為2.350、2.085,多態信息含量的平均值分別為0.474、0.428。除了引物和樣本的差異外,最主要的原因是本試驗采用的測序儀基因分型技術分辨率較高,而此前研究通常采用的聚丙烯酰胺凝膠電泳的分辨率相對較低。運用微衛星標記對種質資源進行評估時,可將引物、片段擴增技術、基因分型技術等建立統一的標準,避免因為技術造成的誤差。

從實際生產來看,由于遺傳漂變以及人工繁殖過程中一些人為的因素,如親本數量過少、近親交配、定向選擇及缺乏科學管理手段等,而造成養殖群體等位基因丟失、遺傳多樣性水平降低等現象[27-28]。遺傳多樣性的降低往往導致種群的適應能力降低、經濟性狀衰退、抗病能力差等,最終導致種群退化,調查研究野生群體和養殖群體的遺傳多樣性對魚類種質資源的保護和人工育種具有重要意義,在以往的研究中,養殖群體的遺傳多樣性水平往往有所降低,純合速度加快[27-29]。然而本試驗中,3個呆鯉養殖群體的遺傳多樣性均處于較高水平,且遺傳純度不高,形成此現象的原因可能與湘西山區稻田養魚歷史悠久、養殖面積廣、親本群體保有量大、魚苗繁殖量高等有關。據湘西州地方志記載,該地區在唐、宋時期就“有良田數萬頃”,稻田養魚已有發展,自新中國成立以來,稻田養殖面積基本維持在13 333～33 333 hm2;目前,湘西山區稻田鯉產量約2.0×104t,后備親本上萬尾[3]。且由于呆鯉繁殖能力強,繁殖技術容易掌握,民間一直盛行傳統的“稻魚連作”、“挑擔賣魚花”,很多農戶家都有繁苗發花的小土池和溝凼。研究結果表明,目前呆鯉稻田養殖群體遺傳多樣性處于較高水平,具備良好選育潛力。在呆鯉育種過程中,適當增加有效親本數量,可避免連續繁育造成的遺傳多樣性下降現象。

3.2 群體間遺傳分化

遺傳分化系數是體現群體間遺傳分化程度的重要參數,由所有微衛星位點上的所有等位基因來衡量[29-30]。本試驗的5個鯉群體,14個位點僅5%的變異由群體間分化導致,而總變異的95%發生于群體內。本試驗中,群體間遺傳分化系數<0.05,揭示整體水平的遺傳分化程度較低,對5個群體等位基因頻率的分析結果也驗證了這一點,即群體間共有的等位基因為較高頻率基因,而5個群體各自特有的大多數等位基因均屬低頻等位基因。雖然群體間分化程度低,但分子方差分析結果表明群體間遺傳差異顯著。Structure軟件不受群體個體數目的限制,可基于個體的遺傳組成進行群體模擬分析,是用于群體遺傳結構分析的理想工具[31-32]。對5個鯉群體進行Structure亞種群數檢驗,通過遺傳組分的分析,從呆鯉稻田養殖群體中篩選出遺傳差異相對較大的群體,可為稻田適養品種的進一步選育提供科學有效的指導。Structure亞種群數檢驗結果顯示:當K=2時,3個呆鯉養殖群體與湘江野鯉遺傳組分接近,與興國紅鯉養殖群體分離開,呆鯉群體的親本可能是源自湖南天然流域的自然群體;當K=3時,湘西永順和懷化藕團的呆鯉養殖群體相互分離開,并且各自形成獨具特色的遺傳組分,其中湘西永順的呆鯉養殖群體與湘江野鯉遺傳結構更相似,而黔東南錦屏縣的呆鯉養殖群體介于其他2個呆鯉養殖群體之間。推測發生這種現象的結果可能是,湘江永順呆鯉群體其親本是收集自天然水域的自然群體,而且該群體親本數量足夠多,而懷化藕團的呆鯉已經與湘江野鯉產生了一定的遺傳分化。

筆者對呆鯉的遺傳學信息背景進行了初探,并為稻田呆鯉品種選育與遺傳改良提供理論基礎。5個鯉群體的遺傳多樣性和遺傳結構研究表明,5個群體均具有較高的遺傳多樣性,湘西呆鯉之所以不隨水逃跑,可能與千年的稻田養殖模式有關,而群體間遺傳分化水平和遺傳結構表明,呆鯉養殖群體與湘江野鯉并未產生明顯分化。湘西永順呆鯉群體的遺傳信息表明,其具有良好的育種潛力,而懷化藕團呆鯉群體與湘江野鯉群體在遺傳結構上已經產生差異,具有選育潛力,這2個呆鯉養殖群體均可以自身群體為基礎,為稻田鯉品種遺傳育種和改良提供優良的種質資源。

4 結 論

本試驗結果表明,湘西永順、懷化藕團和黔東南錦屏3個呆鯉養殖群體的遺傳多樣性均處于較高的水平,具備良好選育潛力,但遺傳純度不高,需要進一步提純復壯。湘西永順和懷化藕團的呆鯉養殖群體相互分離開,并且各自形成獨具特色的遺傳組分,其中湘西永順的呆鯉養殖群體與湘江野鯉遺傳結構更相似,而黔東南錦屏縣的呆鯉養殖群體介于其他2個呆鯉養殖群體之間,懷化藕團的呆鯉已經與湘江野鯉產生了一定的遺傳分化。

致 謝

本論文數據處理過程中,得到上海交通大學海洋學院曾聰博士的指導,特此感謝!