NLRP3炎性小體與糖尿病心肌病的研究進展

張翠 劉振 劉婧揚 石新燁 劉志強 孫經(jīng)武

濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院心內(nèi)科，濱州 256603

糖尿病患病率呈逐年上升趨勢，其相關(guān)并發(fā)癥可累及全身多處器官，嚴重危害著人類的生命健康，加劇全球疾病負擔。糖尿病是心血管疾病的獨立危險因素，并發(fā)癥主要以大血管（如心血管疾病）和微血管病變（如影響腎臟、視網(wǎng)膜和神經(jīng)系統(tǒng)的并發(fā)癥）為主［1］。1972年，Rubler等［2］對4例死于心力衰竭（heart failure，HF）的糖尿病患者的心臟進行解剖時，發(fā)現(xiàn)了一種以心臟結(jié)構(gòu)和功能異常為特征的心肌病，首次提出了糖尿病心肌病（diabetic cardiomyopathy，DCM）的概念。此后，將DCM定義為由糖尿病導(dǎo)致的一種特異性心肌病，與高血壓或冠狀動脈疾病（CAD）等其他心血管疾病無關(guān)。DCM是糖尿病的嚴重并發(fā)癥，也是糖尿病患者死亡的主要原因，以結(jié)構(gòu)和功能障礙為特征，包括心肌細胞死亡、心肌成纖維細胞激活、左心室功能障礙和代謝紊亂等，胰島素抵抗、高脂血癥和高血糖是DCM發(fā)展的3個重要獨立危險因素［3］。

由于DCM的復(fù)雜性，其發(fā)病機制在過去的研究中尚未完全闡明，但近幾年發(fā)現(xiàn)多種因素與DCM的發(fā)病相關(guān)，包括線粒體功能障礙、內(nèi)皮功能障礙、代謝紊亂、心肌炎癥、鈣調(diào)比例失衡、RASS系統(tǒng)激活和細胞外基質(zhì)（ECM）重構(gòu)等［4］。這些病理生理變化導(dǎo)致氧化應(yīng)激、心肌纖維化、心室肥大、左心室舒張功能障礙，最終導(dǎo)致HF［5］。其中，炎癥在DCM的病理生理發(fā)展過程中起到了重要作用。作為NLRs家族最具特征性的炎癥小體，核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3（nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3，NLRP3）與多種疾病的發(fā)生和進展相關(guān)，主要包括代謝障礙、癌癥、缺血性心肌病、炎癥性腸病、糖尿病與肥胖，以及自身免疫性和代謝性疾病等［6］。而在心肌細胞中大量表達的NLRP3炎性小體，可能會成為治療DCM的新靶點。本文就NLRP3炎性小體在DCM中的作用機制及其相關(guān)治療作出系統(tǒng)的綜述。

NLRP3炎性小體

炎性小體是一種大型多分子復(fù)合物，由胞漿模式識別受體（PRRs）參與組裝形成，能夠協(xié)調(diào)宿主對抗感染因子并啟動防御機制，是天然免疫系統(tǒng)的重要組成部分［7］。炎癥小體以其控制蛋白水解酶caspase-1活化的能力而聞名，通過ASC募集caspase-1，活化的caspase-1反過來調(diào)節(jié)白細胞介素（IL）-1β和IL-18的蛋白水解成熟，產(chǎn)生相應(yīng)的成熟炎癥因子，誘導(dǎo)細胞焦亡［8］。其中，NLRP3是近幾年研究較多、最具特征性的炎性小體。

1.NLRP3的結(jié)構(gòu)

NLRP3屬于NLRs蛋白家族，是一種介導(dǎo)有效炎性介質(zhì)激活的胞漿信號復(fù)合體，廣泛存在于炎癥細胞和免疫細胞中，其多蛋白復(fù)合物是由傳感器分子NLRP3［核苷酸結(jié)合域富亮氨酸重復(fù)序列（NLR）和含有受體3的pyrin結(jié)構(gòu)域］、銜接蛋白ASC（含有半胱天冬酶募集結(jié)構(gòu)域的凋亡相關(guān)斑點樣蛋白）和效應(yīng)蛋白procaspase-1組成［9］。NLRP3包含3個結(jié)構(gòu)域：吡喃結(jié)構(gòu)域（PYD）、核苷酸結(jié)合和寡聚結(jié)構(gòu)域（NACHT）以及富亮氨酸重復(fù)序列結(jié)構(gòu)域（LRRs）。ASC由C端caspase募集結(jié)構(gòu)域（CARD）和N端PYD組成。Pro-caspase-1由一個CARD、一個p20和一個p10域組成［10］。NLRP3中央的NACHT結(jié)構(gòu)域具有ATP酶活性，能夠促進自身寡聚，需要與ATP結(jié)合才能激活NLRP3［11］。C端的LRR結(jié)構(gòu)域可以調(diào)節(jié)NLRP3活性并感知內(nèi)源性警報蛋白和微生物配體，N端的PYD結(jié)構(gòu)域主要介導(dǎo)下游蛋白間的相互作用［9，12］。正常生理條件下，NLRP3的NACHT結(jié)構(gòu)域與LRRs結(jié)合，使其處于自我抑制狀態(tài)［11］，當出現(xiàn)病原相關(guān)分子模式（PAMLs）或損傷相關(guān)分子模式（DAMPs）時，NLRP3解除抑制狀態(tài)并發(fā)生寡聚，其PYD結(jié)構(gòu)域招募含有PYD的ASC銜接蛋白產(chǎn)生相互作用，而ASC的CARD結(jié)構(gòu)域則連接下游的procaspase-1，將IL-1β前體和IL-18前體轉(zhuǎn)化為具有活性的IL-1和IL-18，從而引起細胞程序性死亡-細胞焦亡［12］。因此，NLRP3炎性小體的組成成分能夠使其激活后發(fā)揮作用。

2.NLRP3的激活

近幾年，對炎性小體的研究越來越深入，但對于炎性小體激活的確切機制尚未有明確定論。有研究發(fā)現(xiàn)，在大多數(shù)細胞中，NLRP3炎性小體的激活需要兩個步驟：啟動和激活。啟動步驟：靜息狀態(tài)下，細胞中NLRP3的基礎(chǔ)水平較低，不足以組裝和激活NLRP3炎性小體［9］。因此，啟動步驟需要Toll樣受體（TLRs）或細胞因子受體誘導(dǎo)［如腫瘤壞死因子（TNF）或IL-1β］，它們識別PAMPs或DAMPs，進而上調(diào)NLRP3和IL-1β的miRNA轉(zhuǎn)錄水平［13］，并通過翻譯后修飾降低NLRP3的激活閾值，從而導(dǎo)致caspase-1介導(dǎo)的炎癥因子成熟與釋放，以及細胞焦亡。這些翻譯后修飾主要包括：BRCC3介導(dǎo)的NLRP3去泛素化、LUBAC介導(dǎo)的ASC泛素化、依賴SYK和JNK的ASC磷酸化［14］。激活步驟：接受啟動信號后，NLRP3炎性小體會被PAMPs或DAMPs等多種因素激活。大多數(shù)的PRR具有特異性，僅能識別一種或幾種PAMPs或DAMPs，然而，NLPR3能被廣泛的細菌、病毒和真菌的PAMPs和內(nèi)源性DAMPs激活，如：成孔毒素、晶體、聚集體（β-淀粉樣蛋白）、細胞外ATP、顆粒刺激物和透明質(zhì)酸［11］。NLRP3通過N端PYD招募ASC形成ASC朊蛋白樣寡聚物，組裝后的NLRP3炎性小體觸發(fā)pro-caspase-1自動切割，介導(dǎo)pro-IL-1β、pro-IL-18、和gasdermin D（GSDMD）的蛋白水解過程，導(dǎo)致細胞膜孔隙形成，并誘導(dǎo)細胞焦亡和IL-1β/IL-18的釋放［15］。

NLRP3炎性小體與CAD

炎性反應(yīng)是DCM發(fā)生、發(fā)展過程中的關(guān)鍵因素，越來越多的證據(jù)表明，NLRP3對控制炎性反應(yīng)和協(xié)調(diào)抗微生物宿主防御至關(guān)重要。研究發(fā)現(xiàn)，在2型糖尿病大鼠模型中，NLRP3炎性小體、IL-1β、IL-18及TNF-α等炎癥因子的水平明顯增加，導(dǎo)致糖尿病大鼠心臟功能障礙，而NLRP3基因沉默后能有效減輕DCM的炎性反應(yīng)，從而改善DCM的細胞凋亡、心室功能障礙及心肌纖維化［16］。

1.NLRP3炎性小體參與DCM細胞焦亡過程

焦亡是由caspase-1/4/5/11引發(fā)的一種程序性細胞死亡的炎癥形式，通常在細胞內(nèi)病原體感染時發(fā)生，主要導(dǎo)致細胞腫脹、質(zhì)膜裂解及促炎因子的釋放，從而激活強烈的炎癥和免疫反應(yīng)。研究表明，高糖誘導(dǎo)的活性氧（ROS）過度生成是慢性炎癥的主要原因，因此，ROS誘導(dǎo)的NLRP3依賴性凋亡和促炎因子的成熟可能有助于自身免疫性或代謝性疾病的發(fā)展，如DCM［17］。

Qiu等［18］研究發(fā)現(xiàn)，在高糖和缺氧/復(fù)氧（hypoxia/reoxygenation，H/R）條件下使用高濃度的脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）刺激H9C2心肌細胞，H9C2細胞的存活率降低，ROS產(chǎn)生和細胞焦亡增加，并伴隨NLRP3、ASC、caspase-1、IL-1β和IL-18等炎癥因子的表達增加，加重H9C2中HG和H/R誘導(dǎo)的心肌損傷。此外，當加入炎性小體抑制劑BAY11-7082時，LPS通過下調(diào)NLRP3炎性小體減輕了HG+H/R誘導(dǎo)的心肌損傷。Elmadbouh等［19］發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，鏈霉素誘導(dǎo)的DCM組心肌細胞中焦亡蛋白caspase-1、TLR4以及NLRP3表達水平顯著增加，骨成型蛋白-7治療組可顯著降低炎癥誘導(dǎo)的細胞焦亡，改善DCM心臟重塑。

以上研究發(fā)現(xiàn)也在Xie等［20］的實驗中被證實：DCM模型大鼠Chemerin、CMKLR1、NLRP3、caspase-1和炎癥因子表達增加，鏡下切片大鼠心肌纖維化、肥大、超微結(jié)構(gòu)紊亂、功能受損，然而沉默CMKLR1和NLRP3則能降低炎癥因子水平和細胞焦亡，而在CMKLR1-siRNA治療組，焦亡和炎癥的關(guān)鍵因子顯著降低，DCM大鼠的心肌炎癥、纖維化、肥厚等情況明顯減輕。以上實驗數(shù)據(jù)表明，NLRP3炎癥小體參與DCM的細胞焦亡過程。

2.NLRP3炎性小體參與DCM心肌纖維化過程

心肌纖維化（myocardial fibrosis，MF）是心肌重構(gòu)的主要表現(xiàn)，是多種心臟疾病發(fā)展過程的共同病理結(jié)果。MF是一個復(fù)雜的病理過程，主要是由于心肌成纖維細胞（CFs）的異常增多，心肌組織中膠原纖維過度沉積（主要是Ⅰ型和Ⅲ型膠原纖維），或膠原成分發(fā)生改變，從而導(dǎo)致心肌瘢痕組織形成、左室舒張功能障礙，最終導(dǎo)致HF的一種病理改變。

CFs是MF的關(guān)鍵細胞，參與MF的發(fā)展。有研究發(fā)現(xiàn)，向小鼠原代CFs中加用轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）刺激后，CFs中NLRP3炎癥小體的表達明顯增加，CFs顯著分化，將NLRP3-/-小鼠的原代CFs分離并添加TGF-β后，CFs的分化減弱，而肉桂醛和別嘌呤醇能夠抑制TGF-β/Smads通路，降低NLRP3炎癥小體的表達，從而減弱MF［21-22］。這表明，NLRP3在CFs的分化過程中起到了重要作用。葡萄糖則通過誘導(dǎo)ROS產(chǎn)生NLRP3炎性小體，導(dǎo)致MF。在一項動物和H9C2細胞模型中，Kang等［21］證實果糖誘導(dǎo)能夠增加心臟氧化應(yīng)激和ROS，上調(diào)CD36，繼而以TLR4/6-IRAK4/1依賴的方式刺激NLRP3炎性小體，促進糖尿病大鼠心臟炎癥和纖維化。這一結(jié)論也在Zhang等［23］的實驗中得到證實，在高糖環(huán)境下，ROS和三磷酸腺苷嘌呤受體（P2X7R）可以介導(dǎo)NLRP3炎性小體激活，促進大鼠心臟成纖維細胞膠原合成，相反，H3松弛素則明顯減弱P2X7受體介導(dǎo)的NLRP3炎性小體的激活，從而抑制心肌炎性反應(yīng)及心肌纖維化。在DCM大鼠模型中，NLRP3、膠原蛋白（collagen）-1、collagen-3、caspase-3和bax顯著上調(diào)，bcl2顯著下調(diào)，糖尿病大鼠的心肌纖維化、NLRP3炎性小體激活和凋亡明顯加重［23］，而NLRP3基因沉默后，2型糖尿病大鼠的左心室纖維化減輕［16］。以上研究證實，NLRP3炎性小體具有促進心肌纖維化的作用。

以NLRP3為靶點治療DCM的藥物

目前，關(guān)于DCM的治療方法多以控制血糖、血壓、血脂與改善HF等對癥治療為主。針對DCM發(fā)病機制的治療藥物尚處于動物實驗階段，但值得注意的是，近年來已經(jīng)確定了一些DCM治療的潛在靶點，包括激活Nrf2通路、抑制丙酮酸脫氫酶激酶、抗氧化、SERCA過表達、減少TXNIP的表達、調(diào)控micRNA等［24］。NLRP3炎性小體是近幾年DCM治療的一個潛在新方向，針對NLRP3炎性小體在DCM中的治療藥物可分為化學(xué)藥物和天然藥物兩類。

1.化學(xué)藥物

二甲雙胍作為一線降糖藥物，能夠激活A(yù)MPK和自噬，通過mTOR通路抑制NLRP3炎性小體的產(chǎn)生，發(fā)揮心臟保護及抗炎作用，改善糖尿病大鼠的左心室功能、心肌纖維化和細胞焦亡［25］。同為降糖藥物的SGLT2抑制劑（如達格列凈、恩格列凈）亦有此相同作用，但兩種藥物作用的通路不同，達格列凈通過抑制NLRP3/ACS炎性小體的激活延緩DCM的發(fā)展進程［26］，而恩格列凈則通過抑制sGC-cGMP-PKG通路發(fā)揮作用［27］。褪黑素是人松果體產(chǎn)生的一種胺類激素，能夠抑制LncRNA MALAT1/miR-141介導(dǎo)的NLRP3炎性小體的激活和TGF-β1/Smads通路，顯著改善心功能并減少膠原纖維的生成，產(chǎn)生抗纖維化作用，可能是治療DCM的潛在藥物［28］。瑞舒伐他汀是一種選擇性3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A（HMG-CoA）還原酶抑制劑，可以阻斷硫氧還蛋白相互作用蛋白（TXNIP）的過度表達，降低NLRP3、caspase-1和IL-1β的水平，長期治療能夠抑制MAPKs的過度磷酸化，改善糖尿病大鼠的心功能［29］。以往的抗炎藥物治療可能會導(dǎo)致宿主防御受損或繼發(fā)炎癥，靶向NLRP3炎性小體的炎癥通路可能提供了一種更精確的方法來減少有害炎癥，同時，改善糖尿病大鼠的心肌炎癥、纖維化、細胞凋亡及心室重構(gòu)，延緩DCM的發(fā)展。

2.天然藥物

皂苷是絞股藍的主要成分，具有抗炎、心臟保護和神經(jīng)保護的作用。在H9C2細胞和DCM小鼠模型中，皂苷能夠降低線粒體ROS水平，抑制NLRP3炎性小體的激活，改善HG誘導(dǎo)的心肌損傷［30］。復(fù)方貞術(shù)調(diào)脂方是一種治療糖脂代謝障礙的中藥方劑，能夠抑制心肌細胞內(nèi)脂質(zhì)積累、氧化應(yīng)激和NLRP3炎性小體誘導(dǎo)的炎性反應(yīng)，改善血脂和促炎因子的水平，減輕心肌肥厚，改善糖尿病小鼠的心臟功能［31］。槲皮素是一種天然黃酮類化合物，具有抗炎、免疫調(diào)節(jié)、清除自由基、降血脂等作用，糖尿病大鼠模型經(jīng)槲皮素治療后，Ⅰ型膠原、NLRP3、caspase-1、IL-1β和IL-18等蛋白表達水平降低，大鼠心臟射血分數(shù)增加，這表明槲皮素可能通過減輕DCM的炎癥作用來改善心功能障礙和心肌纖維化［32］。樺木醇是從樺樹皮中提取的一種三萜類化合物，具有調(diào)脂、抗炎、抗腫瘤等作用，有研究發(fā)現(xiàn)，在db/db小鼠心肌組織中，Sirt1明顯降低，NLRP3、ASC、caspase-1、IL-1β、NK-κB水平明顯升高，經(jīng)樺樹醇治療能顯著逆轉(zhuǎn)這些變化，樺樹醇還可有效改善db/db小鼠和H9C2細胞的胰島素抵抗、高血糖和心臟炎癥，其可能是通過調(diào)控Sirt1/NLRP3/NK-κB信號通路發(fā)揮作用［33］。

總結(jié)與展望

DCM作為糖尿病的并發(fā)癥，其發(fā)病率高，危害性大。因此，研究其發(fā)病機制并研發(fā)靶向治療藥物對DCM的預(yù)防及治療具有重要意義。NLRP3炎性小體可以作為一種有前景的分子標志物，可用于未來開發(fā)有效和靶向治療DCM和其他心血管疾病的低毒性療法。因此，了解其激活的分子機制，并開發(fā)靶向藥物，對DCM和其他心血管疾病具有重要價值。盡管對于NLRP3與DCM之間的研究取得了一定成果，仍有許多問題亟待解決，NLRP3炎性小體與信號通路的研究在DCM中仍具有局限性，未來仍需要深入探索。

作者貢獻聲明張翠：查閱文獻，收集整理數(shù)據(jù)，起草文章；劉振：查閱文獻，收集整理數(shù)據(jù)，對文章的知識性內(nèi)容作批評性審閱；劉婧揚、石新燁、劉志強：收集整理數(shù)據(jù)；孫經(jīng)武：對文章的知識性內(nèi)容作批評性審閱，獲取研究經(jīng)費，指導(dǎo)