針刺調控鐵死亡治療腦卒中的信號通路研究進展

秦文秀 許軍峰 高 瑩 王坪霏 楊 婷 杜健強

(1 天津中醫藥大學第一附屬醫院,天津,300381; 2 國家中醫針灸臨床醫學研究中心,天津,300381; 3 天津中醫藥大學,天津,301617; 4 甘肅中醫藥大學,甘肅,蘭州,730000)

腦卒中,中醫稱中風,因起病突然、病因復雜,病情演變迅速,與風邪善行數變的特性極為相似。中風首見于《金匱要略·中風歷節病脈證并治第五》:“夫風之為病,當半身不遂,或但臂不遂者,此為痹,脈微而數,中風使然?！盵1]臨床主要表現為突然昏仆、不省人事、半身不遂、口眼斜和言語不利等癥狀。中風的病因病機較復雜,《黃帝內經》中記載很多,但歸納起來不外乎火、風、痰、瘀、虛、氣等,以上病理因素在一定條件下相互作用而發病[2]。腦卒中是全球第2大導致人類死亡的疾病,指由供血血管突然閉塞或出血引起的一系列疾病,所以又將腦卒中分為缺血性卒中和出血性卒中[3],其中缺血性腦血管病占多數[4]?，F代醫學認為,腦卒中病理機制涉及腦血管破裂或腦血流中斷引發神經炎癥反應、氧化應激、細胞凋亡、自噬和細胞毒性等復雜過程,這些病理學改變導致神經元、膠質細胞和內皮細胞的顯著損傷,所有這些都是腦損傷的核心節點[5]。腦卒中一旦發生,腦組織得不到足夠的血液供應后,就會發生一系列的病理動態演變過程,最終會導致神經元的急性壞死和神經元的遲發性死亡,從而出現一系列臨床癥狀[6]。針刺治療腦卒中已有數千年歷史,針刺的雙向調節能激活興奮性、氧化應激、炎癥反應、神經元死亡和存活的多種分子和信號通路,通過抑制炎癥反應、腦水腫形成、細胞凋亡,減輕氧化應激損傷,促進神經與血管再生;改善腦部血液循環及血流流變學異常;提高腦損傷區域神經細胞的功能和機體免疫功能以及改善甲皺微循環等來緩解和治療腦卒中及其并發癥、后遺癥[7-8]。目前針刺治療腦卒中的作用機制研究主要集中在蛋白表達和單通道方面,然而有關蛋白表達的相互作用及多種信號轉導通路調控的證據并不多,所以需要對其信號通路進行全面分析。

近年來,鐵死亡成為醫學研究的高頻詞,有關鐵死亡誘導并伴隨多種疾病發生發展的研究層出不窮,而鐵死亡被證明是一種受調控的鐵依賴的非凋亡細胞死亡,參與了腦卒中后腦組織及神經元損傷,鐵死亡抑制劑也在一些缺血性或出血性的腦卒中實驗研究中得到證實[3]。這些發現揭示了神經保護的新機制,并強調了腦卒中過程中鐵死亡扮演的重要角色。正因如此,研究者對針刺與鐵死亡相關性進行了研究,以發現針刺治療腦卒中的作用機制?，F通過搜集整理相關文獻,總結探析針刺抑制鐵死亡治療腦卒中的信號通路,以完善針刺治療腦卒中的作用機制,進一步推廣其臨床應用。

1 鐵死亡

鐵死亡(Ferroptosis)與細胞凋亡、壞死和自噬不同,是一種由依賴鐵的脂質過氧化物過度積累引起的細胞調控死亡新形式[9]。在形態特征上,與其他細胞死亡不同,鐵死亡表現為細胞增大,線粒體體積減少,線粒體膜密度增加,線粒體嵴缺失或減少等[10]。在生物化學特征上,鐵死亡表現為細胞內Fe2+和活性氧(Reactive Oxygen Species,ROS)水平的升高發生芬頓反應,半胱氨酸攝入量的減少,谷胱甘肽的耗竭,羥基、羥基自由基和脂質氫過氧化物的水平升高,生物膜中多聚不飽和脂肪酸發生脂質過氧化反應等[11]。在機制及調節方式上,鐵死亡主要涉及鐵代謝、氨基酸代謝和脂質代謝3個方面[12]。鐵死亡不僅與阿爾茨海默病(Alzheimer′s Disease,AD)、帕金森病(Parkinson Disease,PD)和缺血性腦卒中等神經退行性疾病的發生發展有關,也與病理性細胞變性和死亡相關[9,11,13]。

2 鐵死亡與腦卒中

2.1 鐵死亡與腦卒中的關系 鐵死亡作為一種可調節的細胞死亡,已經被證實介導了腦卒中患者的神經元退變和損傷,且鐵抑素對改善損傷有明顯的效果[14]。腦卒中時鐵死亡的發生與增加細胞內Fe2+和脂質過氧化物的含量有關,抑制鐵死亡能減輕腦卒中損傷,提示鐵死亡介導了腦卒中的損傷,成為了干預腦卒中的潛在靶點[15]。首先,腦缺血后通過抑制tau蛋白的表達致鐵積累,tau蛋白與神經元結合從而促進鐵外流。然后,過量的鐵通過血腦屏障進入腦實質,通過芬頓反應促進ROS的生成,從而促進核酸、蛋白質和膜損傷,最終引發相關的神經細胞死亡[16]。MAGTANONG和DIXON在單側短暫性大腦中動脈阻塞(Middle Cerebral Artery Occlusion,MCAO)的背景下進行了鐵死亡和腦缺血的相關實驗研究,表明MCAO導致受損半球鐵含量升高,這種鐵過度積累可能誘發鐵死亡[17]。由于腦出血后細胞裂解,大量釋放血紅蛋白,損傷部位激活的小膠質細胞和浸潤的巨噬細胞吞噬并降解血紅蛋白,進一步釋放亞鐵,這種亞鐵在神經元中積累,并作為催化劑,通過芬頓反應形成羥基自由基,驅動ROS的產生。當谷胱甘肽過氧化酶4(Glutathione Peroxidase 4,GPX4)活性被抑制時,脂質過氧化和鐵死亡就會發生[18]。見圖1。更重要的是,腦卒中后受損組織中鐵含量明顯升高,而且用以前的方法(如阻斷興奮性毒性)并不能逆轉,可能是因為它們沒能阻斷鐵死亡,神經細胞進一步受損。鐵死亡抑制劑,如鐵死亡抑制劑Ferrostatin-1和Liproxstatin-1,在腦卒中后應用中顯示了很好的神經保護作用[19]。這些結果有力地證明,鐵死亡的確在腦卒中和腦卒中后神經元損傷中發揮了重要作用,有望成為逆轉腦卒中神經功能缺損和改善預后的新靶點。

2.2 中醫藥干預鐵死亡的研究 中醫藥以其多組分、多通路、多靶點的作用特點,可同時調節細胞死亡的多種形式以治療腦卒中。大量研究從分子機制角度論證了中藥單藥或復方活性成分及針刺、艾灸等中醫治療手段能通過調節鐵死亡而發揮神經保護作用。中藥單藥包括黃芩、山豆根、虎杖、鉤藤、地黃、丹參、三七、紅花、牡丹皮、姜黃、遠志、人參、白果、枇杷葉、余甘子、葛花、槐角、麻黃根、女貞子、沙棘、天麻等[20];中藥復方或中成藥包括醒腦靜注射液、大株紅景天注射液、腦泰方、安腦平沖方、補腎活血顆粒以及補陽還五湯等[21-22]。中藥在這方面的研究較多且主要著眼于GPX4、缺氧誘導因子-1(Hypoxia Inducible Factor-1,HIF-1)、鐵轉運蛋白1(Ferroportin 1,FPN1)和谷胱甘肽(Glutathione,GSH)等具有氧化防御作用的調節通路,作用于多個相關靶點,通過增強細胞抗氧化作用,調節鐵代謝,減少細胞鐵內流,弱化鐵的介導作用,從而干預鐵死亡[23]。但中藥藥物種類豐富,復方構成藥理復雜,調控鐵死亡的藥物研究仍處于起步階段,若想完全厘清何種藥物及提取物干預了鐵死亡對應具體靶點或通路,針對性用藥尚有很長一段路要走。非藥物療法通過鐵死亡途徑干預腦卒中的研究數量較少,目前主要集中在針刺方面。針刺通過調控鐵死亡相關信號通路,調節神經細胞鐵代謝蛋白的表達,減少腦組織鐵沉積,從而減輕腦卒中后鐵死亡引起的脂質過氧化損傷,抑制神經細胞鐵死亡,達到神經保護作用,改善運動功能障礙,并降低腦梗死程度[24-25]。電針已被證明可以通過上調FPN1、GSH、GPX4的表達和下調HAMP(鐵調素基因)的表達減輕腦卒中后的組織鐵負荷,減少鐵介導的氧化應激,同時促進線粒體修復,進而發揮抑制鐵死亡的作用,并在腦卒中后的急性期、亞急性期發揮神經保護作用[26]?？傊?雖然通過中醫藥干預鐵死亡治療腦卒中是一個新方向,有望為治療腦卒中提供新靶點,但是相關研究文獻相對較少,且大部分研究基于動物實驗,臨床試驗數據相對較少。

以下我們著重討論針刺調控鐵死亡治療腦卒中的信號通路。

3 針刺調控鐵死亡治療腦卒中的信號轉導通路

3.1 miR-23a-3p和NFE2L2信號通路 核轉錄因子紅系2樣2(Nuclear Factor,Erythroid 2 Like 2,NFE2L2)是一種主要的抗氧化調節因子,在鐵死亡通路中發揮著重要作用[27]。NFE2L2信號通路是一種抗氧化途徑,可以驅動和調節細胞內與ROS水平有關的酶來調節鐵死亡的發生,針刺可以明顯激活NFE2L2信號通路以抵抗腦卒中出現的腦損傷。值得注意的是,miR-23a-3p的結合位點存在于NFE2L2中。下調miR-23a-3p對腦出血后的退行性神經元數量、炎癥反應和鐵死亡均有抑制作用,并能夠激活NFE2L2信號通路。針刺可通過降低miR-23a-3p的表達,使NFE2L2易位增加、血紅素氧合酶-1和GPX4表達增加、鐵和ROS積累減少,從而緩解腦卒中導致的神經功能缺損[28]。

3.2 p62/Keap1/Nrf2信號通路 Sequestosome 1/p62是一種主要參與各種蛋白的運輸、降解和破壞的銜接蛋白。Keap1依賴的降解泛素化是一個控制Nrf2的過程。Nrf2是氧化應激的關鍵調節因子,并作為抗氧化劑保護細胞免受鐵死亡[29]。然而,在氧化應激過程中,p62與Keap1和Nrf2的結合位點結合,從而競爭性地阻止Keap1與Nrf2的結合,并產生Nrf2累積?？梢酝茰y,針刺干預可通過觸發抗氧化通路p62/Keap1/Nrf2,并導致FTH1和GPX4上調,這些因子參與減少鐵超載,減輕腦卒中后鐵死亡引起的脂質過氧化損傷,從而加快腦卒中后的恢復[30]。有證據表明,在腦卒中后針刺干預可通過促進p62/Keap1/Nrf2抗氧化信號通路來保護腦組織,而p62/Keap1/Nrf2抗氧化信號通路是通過Nrf2的轉錄刺激來調控鐵死亡的,這與ROS和鐵穩態有關[31]。腦卒中后針刺治療可使p62、Nrf2、GPX4和FTH1的表達增多,Keap1的表達減少,從而減少神經細胞體內線粒體收縮,增加線粒體外膜直徑,抑制神經元死亡,減少腦卒中后神經行為異常。

3.3 α7nAChR介導的JAK2/STAT3信號通路 針刺治療可通過α7亞基的煙堿型乙酰膽堿受體(α7 Nicotinic Acetylcholine Receptor,α7nAChR)介導的Janus激酶2(Janus Kinase,JAK2)/信號轉導及轉錄激活因子3(Signal Transducers and Activators of Transduction 3,STAT3)信號通路減輕慢性腦低灌注后的認知缺陷,提供強大的神經保護并抑制炎癥介質的釋放[32]。α7nAChR是一種表達于中樞和外周神經系統的配體門控離子通道,主要參與調節炎癥反應。α7nAChR激動劑能夠抑制炎癥介質的釋放,保護神經元免受多種腦損傷,特別是缺血損傷。針刺通過激活α7nAChR及其下游JAK2/STAT3通路促進大腦低灌注后認知功能恢復,并具有抗炎和神經保護作用。此外,α7nAChR通過激活細胞內JAK2的信號轉導和STAT3的信號表達來調節炎癥反應,這為針刺治療腦卒中提供了新的見解。CHEN等[33]經研究證實STAT3是鐵死亡的重要調節因子,調控STAT3表達能誘導或抑制鐵死亡。

3.4 cAMP/PKA/CREB信號通路 海馬在記憶的形成中起著重要的作用,海馬一旦病變,則會出現中度可靠的順行性記憶損害。環磷酸腺苷(Cyclic Adenosine Monophosphate,cAMP)/cAMP依賴性蛋白激酶A(cAMP-dependent Protein Kinase,PKA)/cAMP反應元件結合蛋白(cAMP Response Element-binding Protein,CREB)通路參與了針刺增強認知的作用,該通路的激活對實現針刺改善認知功能至關重要。針刺可通過上調cAMP/PKA/CREB信號通路改善海馬功能,逆轉腦卒中高頻刺激下突觸強度長時程增強(Long-term Potentiation,LTP)受損,這是針刺改善腦卒中認知功能的一種分子機制[34]。WANG等[35]提出CREB能刺激GPX4轉錄抑制鐵死亡,而腦卒中伴隨著鐵死亡,故cAMP/PKA/CREB信號通路可能是針刺調控鐵死亡治療腦卒中的通路之一。

3.5 PI3K/AKT信號通路 磷脂酰肌醇-3激酶(Phosphoinositol 3 Kinase,PI3K)/蛋白激酶B(Protein Kinase B,AKT)信號通路通過抑制B細胞淋巴瘤蛋白2(B Cell Lymphoma Protein-2,Bcl-2)/Bcl-2相關X蛋白(Bcl-2-associated X Protein,Bax)的比值發揮抗細胞死亡作用。針刺通過激活PI3K/AKT信號通路促進大鼠腦梗死(Cerebral Infarction,CI)后神經血管單元的修復,從而對神經血管單元起到保護作用[36]。針刺可激活PI3K/AKT通路,增加缺血腦組織中PI3K激活因子腦源性神經營養因子(Brain-derived Neurotrophic Factor,BDNF)和膠質細胞源性神經營養因子(Glial Cell Line-derived Neurotrophic Factor,GDNF)的血清分泌水平,上調抗凋亡Bcl-2/Bax比值,從而保護神經,抑制腦細胞死亡[37]。LIU等[38]發現激活PI3K/AKT通路可以減輕或抑制鐵死亡。因此,通過針刺激活PI3K/AKT信號通路抑制腦細胞死亡是一種很有前景的腦卒中治療策略。

3.6 p38 MAPK信號通路 p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 Mitogen-activated Protein Kinases,p38 MAPK)信號轉導通路與腦損傷及缺血耐受密切相關。在腦損傷等病理條件下,谷氨酸過度釋放到突觸間隙,激活含nr2b的抗N-甲基-D-天冬氨酸受體亞基2B(N-methyl-D-aspartate(NMDA)Receptor Subunit 2B,GluN2B),使細胞內鈣超載,超載的鈣會激活細胞質中的m-鈣蛋白酶,進而誘導STEP61的酶反應,抑制p38 MAPK的去磷酸化,最終通過信號轉導導致細胞死亡[39]。鐵死亡是一種氧化應激損傷,p38 MAPK信號通路的激活參與了氧化應激損傷和突觸可塑性損傷[40]。針刺表現出對p38 MAPK通路的雙重調節功能,減少β淀粉樣蛋白在大腦中的沉積,改善患者的學習和記憶能力,有助于多種神經系統疾病的臨床癥狀和功能的全面改善[41]。針刺能有效下調反應性星形細胞,為腦卒中提供神經保護,其機制可能是激活p38 MAPK/CREB信號通路,從而阻止缺血皮質半暗區第2個線粒體衍生的半胱氨酸蛋白酶激活劑(Second Mitochondria-derived Activator of Caspase/Direct Inhibitor of Apoptosis Protein(IAP)-binding Protein With Low PI,Smac/Diablo)易位,恢復X染色體連鎖凋亡抑制蛋白(X-linked Inhibtor of Apoptosis Protein,XIAP)介導的胱天蛋白酶(Caspase-3)抑制[42]。

3.7 BDNF介導的Nrf2信號通路 BDNF在星形膠質細胞中調節氧化還原敏感轉錄因子Nrf2以及星形膠質細胞與神經元之間的代謝中發揮關鍵作用。星形膠質細胞-神經元相互作用的失調和星形膠質細胞Nrf2激活不足可能導致神經元特別是多巴胺能神經元的鐵死亡。BDNF在星形膠質細胞與神經元的相互作用,星形膠質細胞Nrf2表達以及線粒體活性的調控中發揮關鍵作用[43]。針刺可以通過刺激ATP激活單核細胞,增加BDNF的表達,從而激活Nrf2抑制鐵死亡保護神經[44]。BDNF介導的Nrf2信號通路和神經營養蛋白家族在針刺誘導的神經保護中發揮著關鍵作用,這將為針刺治療腦卒中的本質提供重要的見解。

3.8 PGC-1α/TFAM信號通路 大腦是一個高能量消耗的器官,在很大程度上依賴三磷酸腺苷(Adenosine Triphosphate,ATP),ATP負責提供能量以維持大腦功能,一旦ATP耗盡,大腦中的細胞損傷可導致細胞死亡。過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔激活因子1α(Peroxisome Proliferator-activated Receptorγ Coactivator-1α,PGC-1α)/線粒體轉錄因子A(Mitochondrial Transcription Factor A,TFAM)通路是線粒體呼吸功能的重要分子機制。鐵死亡引起細胞死亡的中心是由TFAM下調介導的,TFAM可作為一種鐵死亡的拮抗劑[45]。針刺對MCAO大鼠缺血損傷有一定的保護作用,能增加腦卒中大鼠ATP釋放和保存,最終改善神經缺陷和運動功能障礙,這種作用可能受到PGC-1α/TFAM信號通路激活的正調控[46]。

3.9 Notch信號通路 Notch信號是一類高度保守的信號轉導通路,參與調節幾乎所有組織和器官中的細胞增殖、分化和凋亡[47]。研究已證實在腰椎間盤突出癥中,突出髓核的新生血管可能使組織暴露于高水平的血紅素中,從而激活Notch通路誘發細胞毒性和鐵死亡,加速突出髓核的進行性退變,可見Notch通路也參與了鐵死亡的發生[48]。中樞神經系統中存在Notch信號轉導通路中的相關基因和蛋白質表達[49]。TAN等[31]發現針刺可有效抑制大鼠基底節Notch1和Hes1蛋白的表達,這些抑制作用與Notch信號通路抑制劑DAPT的作用相同。針刺治療可激活Notch3信號通路,從而促進Notch3及下游Hes1基因表達,抑制海馬神經元凋亡,該結果為腦卒中的治療提供了新的分子靶點[50]。針刺通過抑制腦卒中后大鼠基底節Notch/Hes信號通路,增強神經細胞修復能力,從而維持神經干細胞的增殖,對腦卒中具有神經保護作用。

4 總結

綜上所述,針刺治療腦卒中的信號轉導通路涉及多個信號通路,包括miR-23a-3p和NFE2L2信號通路、p62/Keap1/Nrf2信號通路、α7nAChR介導的JAK2/STAT3信號通路、cAMP/PKA/CREB信號通路、PI3K/AKT信號通路、p38 MAPK信號通路、PGC-1α/TFAM信號通路、Notch信號通路和BDNF介導的Nrf2信號通路。其中miR-23a-3p和NFE2L2信號通路已有研究明確指出針刺調控鐵死亡治療腦卒中是通過該通路實現的。而p62/Keap1/Nrf2、α7nAChR介導的JAK2/STAT3、cAMP/PKA/CREB、PI3K/AKT、p38 MAPK、PGC-1α/TFAM、Notch和BDNF介導的Nrf2信號通路,這些通路雖然既參與了針刺治療腦卒中的過程,又可以調控鐵死亡,但目前并沒有研究明確指出這些通路是針刺調控鐵死亡治療腦卒中的信號通路,這有望成為研究針刺治療腦卒中機制的一個新方向。除此之外,針刺治療腦卒中及其并發癥還可以通過其他信號通路來實現,如GluN2B/m-鈣蛋白酶、皮質p-胞外信號調節激酶(Extracellular Signal-regulated Kinase,ERK)、視黃酸(Retinoic Acid,RA)、巨噬細胞誘導的C型凝集素(Macrophage-induced C-type Lectin,Mincle)/脾酪氨酸激酶(Spleen Tyrosine Kinase,Syk)、Toll樣受體4(Toll-like Receptor 4,TLR4)等信號通路[51-54],但這些通路是否通過參與調控鐵死亡來治療腦卒中,尚待進一步研究。總之,針刺調控鐵死亡治療腦卒中是一種新機制,鐵死亡這一概念在腦卒中疾病中的研究可能給腦卒中的發病機制和治療靶點的尋找提供新思路。

利益沖突聲明:無。