生物囊泡分離鑒定方法及其在獸醫學中的應用

賈萬欣，鄒 聰，段琦穎，屈春惠，肖楚寧，李 斌，王世民

（ 新疆農業大學動物醫學學院，新疆 烏魯木齊 830052 ）

生物囊泡（biological vesicles）是細胞在質膜出芽、起泡等過程分泌產生后被釋放的一種亞細胞組分，其實質是納米顆粒。近年來，外泌體、凋亡小體及微囊泡等微粒均在生物囊泡研究范疇[1-2]。生物囊泡內部含多種如核酸、蛋白、脂質等生物活性分子，在機體各種體液中廣泛存在，是公認的液體活檢類別中不斷發展的生物標志物。最初，生物囊泡被認為是細胞碎片和廢物顆粒，且不具有自我分裂與增殖能力。但隨著科學技術進步，研究指出生物囊泡通過運輸細胞間的信號分子而在細胞通信中發揮關鍵作用。越來越多研究表明，生物囊泡參與了機體各種生理及病理活動，在動物的疾病診斷及疫苗研制方面均有涉足。

截至目前，人們對生物囊泡的類型、分離及鑒定技術已有一定了解，國內外關于囊泡的報道也較多。多項研究表明，生物囊泡在細胞存活與凋亡、疾病診療及疫苗方面具有廣闊的應用與研究前景，在相關領域的研究中發揮了重要作用。生物囊泡基于動物應用的研究體現在存在哺乳動物乳汁中，主要是對不同動物乳汁中外泌體miRNA異同點的研究。被外泌體包裹的miRNA經過幼畜消化道乃至通過血液循環運至免疫器官調控機體免疫機制，為幼畜提供免疫保護，該過程中囊泡的數量與質量便關乎研究的成敗[3-4]。查閱文獻發現，在沒有外界因素誘導下，機體單位時間內產生的生物囊泡數量少且不純，導致生物囊泡的研究受到限制。于是在現有技術下對囊泡進行特殊處理令其大量增值，之后進行分離與純化成為解決該瓶頸的一種有效途徑。匯總相關文獻結果顯示，僅通過單一方法分離所得囊泡的純度和產量通常難以滿足試驗要求，大多數情況下會同時聯用至少兩種方法處理，蛋如何高效、快速地提取囊泡，且保持形態結構和功能的完整性從而使其得到更廣泛的應用仍有待探究。本文就生物囊泡的類型、分離純化方法、鑒定技術及其在獸醫學中的應用等方面進行綜述，以期為生物囊泡應用于獸醫臨床診療提供參考。

1 生物囊泡的概述

1.1 生物囊泡的發展

生物囊泡是指某些兩親性的小分子，在水中分散時形成的一類在結構上具有磷脂封閉雙層的有序簇體，一般也被稱作脂質體。研究者1946 年首次于血漿中發現囊泡的存在，起初它被定義為一種“因子”物質，具有加速血栓形成的作用[5]。之后Wolf[6]研究血小板在血漿中的作用時發現了一種能夠活化血小板的微粒，命名為“血小板塵埃”。1983年，Pan等[7]在研究中發現，綿羊紅細胞內的代謝物通過一些小囊泡被釋放至細胞外，隨即將其命名為外泌體。生物囊泡在機體體液中廣泛存在，其作為異質性較大的群體，來源眾多，命名也各有不同，且與多種生理病理反應密切相關，在生物應用中存在巨大潛力。

1.2 生物囊泡的分類

1.2.1 外泌體

外泌體是由細胞分泌且具有磷脂雙分子層的生物囊泡，通過出芽的方式與質膜融合從而釋放至細胞外，直徑約為30～100 nm，廣泛分布于血液、唾液、母乳和脂肪組織等在內的體液和組織中，內含DNA、mRNA、miRNA 和胞質蛋白等多種物質[8]。外泌體通常通過融合受體細胞膜或結合靶細胞膜表面受體的方式完成細胞間信號的傳導，從而調節機體生理及病理活動。此外，外泌體在腫瘤疾病研究及免疫反應中亦扮演重要角色。

1.2.2 微囊泡

微囊泡是由細胞膜出芽形成的膜性細胞器，尺寸大小不均一，直徑一般為100～1 000 nm，內部含有蛋白質、脂質及核酸等物質，其表面雖具有多種蛋白質的附著卻沒有特定的表面分子標記，且不同來源的微囊泡發揮的生物學功能也不盡相同[9]。已有文獻表明，微囊泡參與多種疾病的研究及診療，如治療骨質疏松、腫瘤細胞的相關研究及預后等方面均發揮良好作用，與其他類型的囊泡一樣可作為細胞間通訊的介質，成為新型天然藥物傳遞載體[10]。因微囊泡最終是由質膜脫落而成，故也稱為“脫落囊泡”。

1.2.3 凋亡小體

凋亡小體是從細胞質膜脫落或萌芽釋放形成的生物囊泡，其形成過程較簡易，整個細胞通過發芽、起泡在質膜出形成泡體，最終自發脫落形成大小不一的凋亡小體，其內部含有含胞質、細胞器和核碎片等物質，可通過運輸生物分子幫助完成細胞清除以及細胞間通信等工作[11-13]。有研究表明，凋亡小體中也含有DNA 且能夠水平傳遞DNA如致癌基因，發揮免疫抑制作用。與外泌體和微囊泡相比，凋亡小體是較大的囊泡，一般直徑為800～5 000 nm。凋亡小體不僅具有轉移致癌因子促進腫瘤形成的作用，還具有促進免疫系統的激活、垂死細胞的募集以及受損組織的再生等功能。

2 生物囊泡的分離純化技術

生物囊泡分離與純化技術不完善是制約相關研究和臨床診療發展的瓶頸問題之一。使用不同分離方法分離直接影響生物囊泡的純度和濃度，因此，多種方法間可互相結合，各取優勢，從而提高生物囊泡的產量與質量。目前，常見的生物囊泡分離技術主要有差速離心、親和層析、密度梯度、超濾和尺寸排阻色譜等，可根據研究目的的需要選擇最優的技術進行分離純化[14-15]。

2.1 差速離心

差速離心技術是最常見且使用最廣的生物囊泡分離純化方法，被視為生物囊泡提取的“金標準”，是基于生物囊泡大小、密度不同從而達到分離的目的。在前人不斷進行技術優化的過程中發現，差速離心技術的關鍵在于由低到高、循序漸進提高離心力，分步去除死細胞、細胞碎片等雜質，最終通過100 000×g的離心以實現生物囊泡與其他更小的顆粒及可溶性物質的分離[16-17]。研究發現，使用差速離心技術純化生物囊泡的過程中，離心機配置、向心力、離心時間、轉子類型及各種參數均對囊泡的產量和純度具有直接影響。迄今為止，差速離心技術較為成熟，不需要進行額外標記，能夠有效避免操作過程中交叉污染的發生。通過此法能夠有效去除大部分雜質，但分離過程較為耗時且操作煩瑣，分離到的生物囊泡常出現形態不完整、聚集成塊等不利于后續組分分析的現象。Kontopoulou等[18]和Campoy等[19]通過該技術分別在血漿和子宮內含物中成功分離出生物囊泡。

2.2 密度梯度離心

由于不同類型囊泡的粒徑大小和密度皆存在差異，密度梯度離心技術以此為依據對生物囊泡進行分離，一般情況下使用蔗糖或碘克沙醇作為介質進行處理。密度梯度離心技術通常與差速離心技術聯用從而提高生物囊泡的純度，先使用差速離心去除大顆粒物質，之后使用密度梯度離心去除蛋白質的污染，達到進一步純化生物囊泡的效果[20]。Iwai等[21]通過使用密度梯度離心技術從人唾液中分離得到形態完整的囊泡。與差速離心技術相比，密度梯度離心技術更具優勢，回收率約10%～50%，能夠有效減少蛋白質及其他顆粒的污染；但由于該方法使用的介質黏度較高，會降低生物囊泡的沉降速率，導致分離純化過程存在耗時長、操作復雜、不適用于臨床應用等缺點。研究人員可根據試驗所需，選擇一種或多種方法組合進行生物囊泡的分離純化[22-24]。

2.3 親和層析

生物囊泡的膜表面存在豐富的蛋白質，利用抗原和抗體之間的免疫親和作用以及受體和配體之間的特異性反應，為囊泡的分離提供了一種新的途徑[25]。親和層析是基于柱子（Beads）或芯片等單克隆抗體作為載體，從而捕獲表面具有特異性蛋白的囊泡。Beads 的質量、洗脫條件以及操作人員的熟練程度均與最終獲取囊泡的純度與產量密切相關。與前兩種分離方法相比，親和層析技術改進了耗費大量樣品卻分離效率低的缺陷，可精確地從更少的樣品中分離出囊泡，還可應用于后續囊泡的定性及定量分析[26]。研究表明，利用抗體包被的磁珠對特異性抗原進行囊泡分離，所獲取的囊泡純度較高且結構形態完整，但該技術不適用于大量囊泡分離，且由于磁珠、抗體價格較為昂貴，令不少研究人員望而止步[27-28]。

2.4 超濾

超濾是利用多孔膜分離溶液中大小不同的物質顆粒，研究人員可通過調節濾膜孔徑大小篩選出囊泡的不同子集[29]。使用該技術分離囊泡時，需另外施加外力或離心力，但施加外力易改變囊泡形態，使體積比濾孔膜徑大的囊泡透過濾膜，引起污染。其次，與囊泡大小相似的納米顆粒也可透過濾膜是超濾技術的一大缺陷，因此可結合超濾技術與其他分離技術以減少污染[30-31]。超濾技術在分離時間上具有優勢，并且處理樣本體積大，回收率可觀，適用于臨床上分離和濃縮囊泡。

2.5 尺寸排阻色譜

尺寸排阻色譜是基于分離物質的大小或分子量大小，使用特定柱料進行分離的色譜方法[32]。利用尺寸排阻色譜進行囊泡分離，其優勢在于可保護囊泡形態和生物學結構不受破壞，囊泡回收率較高，操作便捷且價格較為低廉；但由于柱料的選擇較少，仍會存在如蛋白質等大顆粒的污染，降低囊泡的純度。有研究表明，聯合使用多種分離技術較單一使用某種分離技術所獲取的囊泡更多，純度更高。Benedikter 等[33]研究發現，結合超濾與尺寸排阻色譜兩種方法可提高生物囊泡的產量及純度。

2.6 試劑盒法

試劑盒法即利用商用試劑盒按照操作流程完成囊泡分離的技術。目前市場上已有多種基于上述傳統分離技術的試劑盒，如exoEasy Max 試劑盒、MagCapture?試劑盒、Minute?、ExoQuick?試劑盒等，不同試劑盒依據不同的分離原理，所能達到的分離效率及質量也各有差異[34-35]。經綜合分析表明，使用商品化試劑盒進行囊泡提純具有操作簡便、省時、囊泡完整性高等優勢，但由于市面上已授權的商用試劑盒質量不均，導致生物囊泡提取的產量及純度參差不齊。迄今為止，尚無任何一款應用于囊泡分離純化的試劑盒兼顧多項優點，均存在價格昂貴、分離效率低下等不足。

3 生物囊泡的鑒定及分析技術

3.1 顯微成像技術

顯微成像技術被廣泛應用于生物囊泡的鑒定研究中，是鑒定生物囊泡形成的有力工具，不同的顯微成像系統由于分辨率的受限所獲得的成像效果參差不一。通過顯微成像可快速展示囊泡的形態、大小、粒子直徑和濃度等物理特性，然而該技術對樣品的制備要求嚴苛，樣品濃度高，并且存在視野范圍有限、檢測通量較低等不足，僅能夠滿足囊泡的初步表征需求[36]。

掃描電鏡、透射電鏡、冷凍電鏡及原子力電鏡是常用于囊泡顯微成像的設備。掃描電子顯微鏡作為最廣泛的細胞表面形貌成像工具，常用于囊泡的表面結構成像信息的采集，由于該設備采集時需保持嚴格的真空條件，囊泡樣品處于脫水的狀態，因此在掃描電鏡下呈蝶形或杯狀。與掃描電鏡相比，透射電鏡具有更高的分辨率，在獲取囊泡基本形貌特征的基礎上結合免疫膠體金技術可進一步分析囊泡表面的蛋白質[37]。冷凍電鏡是將樣品通過快速冷凍技術進行固定，在低溫條件下進行高分辨率的觀察。與前兩種技術相比，該技術無須對囊泡樣品進行前期染色、固定及干燥等可能會引起囊泡結構變化的操作，使囊泡維持原始結構[38]。原子力顯微鏡是一種通過探針與樣品接觸反饋信號成像的原子級成像分辨率的成像技術，不僅可展現囊泡的外觀形態，更能夠揭示囊泡的脂質、蛋白質等精細的結構[39]。

3.2 納米顆粒跟蹤分析

納米顆粒跟蹤分析（nanoparticle tracking analysis，NTA）是一種較為先進的、可用于測定樣本中顆粒的粒徑大小與濃度高低的技術，該技術可精準測定直徑低于30 nm 的小型囊泡并對其進行表征分析，操作過程簡便快速，樣品不需要固定、干燥等前期處理步驟，直接在液相中進行檢測，可在不破壞囊泡本身結構的前提下完成鑒定。目前，NTA 不僅可在散射模式下進行檢測，還能夠通過染料及熒光標記抗體的方法實現囊泡的表征分析[40]。但在使用NTA檢測分析過程中，儀器僅在二維平面對顆粒進行追蹤分析，但實際上顆粒的布朗運動是在三維空間發生，在二維的平面進行三維運動的分析會導致測量結果不準確。因此，通常使用NTA測得的囊泡粒徑大小相比電鏡測得的結果偏大[41]。

3.3 流式細胞術

生物囊泡的直徑較小且成分多樣，現有的鑒定技術難以實現單個囊泡的多種生物化學性狀的分析，有礙囊泡的研究和發展。流式細胞術是一種高通量、多參數，應用于懸液中微小顆粒快速定量分析的先進技術，可根據囊泡的大小或所攜帶的熒光信號對粒子進行分選[42-43]。流式細胞儀的靈敏度較低，粒徑小或熒光亮信號低的囊泡難以檢測且會引入背景干擾。因此，研究人員常使用脂膜染色或熒光標記的手段以區分背景信號。光散射是對無標記囊泡檢測最高效的手段，囊泡的粒徑大小及疏密程度主要通過其散射光進行分析，而單個囊泡的散射光強度極其微弱，常低于背景信號，不利于檢測。目前，找到一種通用的熒光染料對囊泡進行標記以削弱背景噪聲的干擾成為提高流式細胞術檢測限的重要突破點[44]。

3.4 蛋白質鑒定

生物囊泡內含有蛋白質、活性核酸和脂質等物質，而蛋白質作為生物學功能的執行者，對其進行研究及分析利于深入了解囊泡的分泌和分選機制。囊泡的蛋白質分為非特異性蛋白質和特異性蛋白質，這些蛋白質主要來自細胞膜、細胞質中的細胞器等[45]。囊泡的蛋白質組成與細胞和疾病的種類相關，不同的蛋白質組成使囊泡具有不同的生物學特性，鑒定囊泡蛋白的組成有助于研究相關蛋白質在疾病發展進程中的作用，并可將其作為疾病早期診斷和預后評估的生物標志物。蛋白免疫印跡法（western blot，WB）和酶聯免疫吸附測定法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）是囊泡蛋白質傳統的鑒定方法，均為生物科學中較為成熟的蛋白質分析技術。目前，絕大多數的文章中均采用WB 進行蛋白質的定量分析與鑒定，CD9、CD63、CD81、Alix等蛋白常作為囊泡標志性蛋白，該法操作復雜煩瑣，但可鑒定多種蛋白質[46-48]。ELISA是使用“雙抗體夾心”法進行囊泡蛋白質的鑒定，因該方法需要一對抗體進行檢測，很大程度上提高了檢測的特異性，但同時也增加了鑒定的成本。因此，該方法不作為囊泡蛋白質分析的最優選擇。

除上述傳統蛋白質鑒定技術外，越來越多基于新型生物傳感技術且具有高度特異性、敏感性的生物傳感器被用于囊泡的蛋白質分析與檢測工作，這些技術擁有檢測高通量、方便快速、靈敏性強等優點，因而比傳統的蛋白質檢測方法更具優勢，適用于臨床檢驗。近年來，基于微流控技術檢測囊泡蛋白質的方法不斷興起，因其操作簡便且可在微尺度對流體進行檢測，成為新型檢測技術的新起之秀。

3.5 核酸鑒定

在囊泡的組成中，核酸是除蛋白質外的另一種重要的組成物質，因此也成為目前學術界的研究熱點之一。囊泡中的核酸物質以RNA 為主，包括miRNA、tRNA、rRNA 等非編碼RNA，且大部分被包裹在囊泡內部。已有研究證明了囊泡中的核酸物質在機體生理病理活動中的作用，如囊泡中的miRNA 參與各類癌癥的形成與發展[49-50]。囊泡中核酸的含量較低，因此，開發高效的核酸提取方法可推進相關方面的研究進展。沉淀法和離心柱法作為囊泡核酸提取的方法，既有相似性又有相異性，均是基于苯酚/氯仿的方法通過萃取使水相和酚相分離。由于核酸物質易溶于水的特性而存在于水相中，沉淀法是在萃取基礎上通過乙醇沉淀回收核酸物質，離心柱則是通過固相萃取的方法完成核酸物質提取后的純化步驟[51]。

目前，隨著高通量檢測技術發展，測序成為囊泡核酸物質檢測常用的途徑，具有良好的檢測深度和覆蓋范圍，有助于囊泡新生物標志物的發現。長期的測序發展中，二代測序技術的出現對囊泡核酸物質的檢測起到了很強的推動性，在測序市場中占有主導地位[52]。

4 生物囊泡在獸醫領域中的應用

科學技術進步策動人類對生物囊泡的認識和研究不斷加深，不僅使其在醫學化工應用中嶄露頭角，也帶動了其在獸醫學領域的研究與應用[53-55]。研究發現，大多數動物乳液中存在囊泡，其內部含有具有免疫調節功能的miRNA。囊泡可隨著乳液進入幼畜的消化道被機體消化吸收，進而調節幼畜消化系統和免疫系統的發育。不僅如此，乳液中的囊泡可作為藥物載體，將親水、親脂性和化學類藥物包裹并遞送至特定部位發揮作用，這一發現大幅度提高了藥物的利用率[56]。此外，囊泡對細胞間信息傳遞也具有促進作用。Regev-Rudzki等[57]通過試驗表明，轉基因瘧原蟲紅細胞分泌的生物囊泡可以促進耐藥基因的傳遞。Hugel 等[58]發現，某些蟲源性細胞外囊泡能夠轉移毒力因子，可增強寄生蟲的寄生能力，最終導致機體致病。陳曉琳等[59]研究指出，灌喂10 μL牛乳外泌體（1 g/L）對DSS誘導結腸炎的小鼠影響有限，可能受到了灌喂劑量較低的影響。這些信息有望給抗寄生蟲藥物新靶標研究帶來新的啟示。當前，生物囊泡在獸醫學中的相關研究日益細節化，尤其是囊泡表面一些重要的膜蛋白對營養物質攝取具有促進作用，提示其若作為候選抗原可對疫苗研究發揮一定作用，對藥物靶標研制也具有新的啟發[60]。生物囊泡廣泛存在機體的各種體液中，因而有望成為標志物質，在動物疾病診斷預防及疫苗研發等方面發揮重要作用。

5 結論

本文就生物囊泡的類型、分離與純化技術、常用的鑒定技術及其在獸醫領域的應用等4個方面總結了近年來生物囊泡的相關內容，指出生物囊泡作為可傳遞生物分子信息、參與機體生理病理活動的小泡體，涉及細胞生物學、免疫學、臨床診斷等領域，在獸醫領域也有所應用與研究。綜上所述，生物囊泡的分離、純化與鑒定標準化還存在諸多挑戰，在獸醫學領域中亦需進一步探索，以促進囊泡在獸醫學及生物學領域應用的進一步發展。