基于UPLC特征圖譜和多指標(biāo)含量測(cè)定南五味子質(zhì)量控制

魏家保 唐雙燕* 趙偉志 鄭曉英 張 輝 譚 沛

1.華潤(rùn)三九醫(yī)藥股份有限公司，廣東 深圳 518000；2.華潤(rùn)三九現(xiàn)代中藥制藥有限公司，廣東 惠州 516000

南五味子為木蘭科植物華中五味子S.sphenantheraRehd.et Wils.的干燥成熟果實(shí)。秋季果實(shí)成熟時(shí)采摘，曬干，除去果梗和雜質(zhì)[1]。目前，中國(guó)藥典及相關(guān)文獻(xiàn)[2-6]以五味子酯甲作為南五味子的質(zhì)量控制指標(biāo)，南五味子化學(xué)成分復(fù)雜，含有較多的木脂素類成分，因此用單一指標(biāo)成分的質(zhì)量控制容易以偏概全，無(wú)法全方位、多范圍地準(zhǔn)確控制飲片的質(zhì)量[7-10]。文獻(xiàn)[11-13]記載的華中五味子分布區(qū)有：江蘇、安徽、河南、山西、陜西、甘肅、湖北、四川、江西、湖南、貴州、云南和福建等省份，且市場(chǎng)商品南五味子主要來(lái)源于野生，野生南五味子資源分布較為廣泛[14-15]。不同產(chǎn)地的生態(tài)環(huán)境差異較大。因此本研究通過(guò)收集不同產(chǎn)地南五味子，建立南五味子特征圖譜方法，并同時(shí)對(duì)南五味子中五味子酯甲、安五脂素、五味子甲素的含量進(jìn)行多指標(biāo)測(cè)定，對(duì)不同產(chǎn)地的藥材質(zhì)量進(jìn)行綜合質(zhì)量評(píng)價(jià)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 高效液相色譜儀：Agilent 1290 Infinity II，包括G7104A型四元泵、132位自動(dòng)進(jìn)樣器、G7116B型柱溫箱、二極管陣列檢測(cè)器；METTLER TOLEDO ME36S百萬(wàn)分之一分析天平、METTLER TOLEDO XS204十萬(wàn)分之一分析天平；SK5200H型超聲波清洗器(上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司)。Milli-Q超純水系統(tǒng)(美國(guó)Millipore公司)。

1.2 試劑 試藥五味子酯甲(批號(hào)：111529-201706；純度：95.2%)；五味子甲素(批號(hào)：110764-201915；純度：99.5%)；5-羥甲基糠醛(批號(hào)：111626-202114；純度：98.7%)；原兒茶酸(批號(hào)：110809-201906；純度：97.7%)，均購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院。五味子酯乙(批號(hào)：DST201218-011；純度：98%)、五味子酯丙(批號(hào)：DST211112-066；純度：98%)，均購(gòu)于成都德思特生物技術(shù)有限公司。五味子酯丁(批號(hào)：21110102；純度：98%)購(gòu)于成都埃法生物科技有限公司；安五脂素(批號(hào)：STD7390120；純度：98%)購(gòu)于上海詩(shī)丹德標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)有限公司；乙腈為色譜純，水為超純水；磷酸、甲醇等其它試劑均為分析純。

1.3 樣品研究 用15批南五味子分別來(lái)源于陜西安康、四川綿陽(yáng)、陜西西安、河南南陽(yáng)以及山西運(yùn)城，收集的藥材經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學(xué)劉守金教授鑒定均為木蘭科華中五味子S.sphenantheraRehd.et Wils.的干燥成熟果實(shí)。詳細(xì)信息見表1。

表1 15批南五味子信息表

2 方法

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 色譜柱：ACQUITY BEH C18(150 mm×2.1 mm，1.7 μm)，以乙腈為流動(dòng)相A，以0.1%磷酸溶液為流動(dòng)相B，梯度洗脫(0～6 min，5%A；6～7 min，5%→45%A；7～25 min，45%→50%A；25～35 min，50%→70%A；35～40 min，70%→90%A)；檢測(cè)波長(zhǎng)：280 nm(12 min前)，220 nm(12 min后)；柱溫為35 ℃；流速為0.3 mL/min；進(jìn)樣量2 μL；理論板數(shù)按五味子酯甲峰計(jì)算應(yīng)不低于6000。

2.2 特征圖譜參照物溶液的制備 取南五味子對(duì)照藥材約2.0 g，置具塞錐形瓶中，加水50 mL，加熱回流30 min，濾過(guò)，取濾液蒸干，加入甲醇25 mL超聲處理(功率250 W，頻率40 kHz)30 min，放冷，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得對(duì)照飲片參照物溶液。取5-羥甲基糠醛、原兒茶酸對(duì)照品適量，加50%甲醇制成每1 mL各含50 μg的溶液，另取含量測(cè)定對(duì)照品溶液作為對(duì)照品參照物溶液。

2.3 含量測(cè)定對(duì)照品溶液的制備 取五味子酯甲、安五脂素、五味子甲素對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL各含0.10 mg的溶液，作為含量測(cè)定對(duì)照品溶液。

2.4 供試品溶液的制備 取本品粉末(過(guò)三號(hào)篩)2.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加甲醇25 mL，稱定重量，加熱回流30 min，取出，放冷，再稱定重量，加甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

3 結(jié)果

3.1 方法學(xué)驗(yàn)證

3.1.1 專屬性 按照供試品溶液制備方法制備供試品溶液，并考察空白溶劑是否會(huì)造成干擾。按上所述色譜條件進(jìn)行UPLC分析，記錄色譜圖，如圖1所示。結(jié)果表明，陰性無(wú)干擾，方法專屬性好。

A.專屬性;B.混合對(duì)照;C.南五味子藥材圖譜

3.1.2 精密度考察 取同一份南五味子供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄共有峰的保留時(shí)間和峰面積，結(jié)果表明了各共有峰與參照峰的相對(duì)保留時(shí)間、相對(duì)峰面積RSD值均小于2.0%；并計(jì)算含量結(jié)果RSD%，五味子酯甲、安五脂素、五味子甲素含量RSD%分別1.9%、0.8%、0.8%，結(jié)果表明儀器精密度良好。

3.1.3 重復(fù)性考察 取同一批南五味子6份，按供試品溶液的制備方法制備，記錄共有峰的保留時(shí)間和峰面積，結(jié)果表明了各共有峰與參照峰的相對(duì)保留時(shí)間、相對(duì)峰面積RSD值均小于2.0%，并計(jì)算含量結(jié)果RSD%，五味子酯甲、安五脂素、五味子甲素含量RSD%分別0.9%、0.5%、0.7%，本方法重復(fù)性良好。

3.1.4 溶液穩(wěn)定性考察 取南五味子供試品溶液，配制后在第0 h、4 h、8 h、12 h、16 h、24 h進(jìn)樣，記錄共有峰的保留時(shí)間和峰面積，結(jié)果表明了各共有峰與參照峰的相對(duì)保留時(shí)間、相對(duì)峰面積RSD值均小于2.0%，并計(jì)算含量結(jié)果RSD%，五味子酯甲、安五脂素、五味子甲素含量RSD%分別1.0%、1.1%、0.9%。結(jié)果表明供試品溶液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定，可以滿足測(cè)定的需要。

3.1.5 線性關(guān)系考察 精密吸取濃度儲(chǔ)備液依次配制濃度為0.42 mg/mL、0.21 mg/mL、0.08 mg/mL、0.13 mg/mL、0.004 mg/mL五味子酯甲溶液、濃度為0.99 mg/mL、0.55 mg/mL、0.22 mg/mL、0.05 mg/mL、012 mg/mL安五脂素溶液、濃度為0.98 mg/mL、0.58 mg/mL、0.21 mg/mL、0.05 mg/mL、0.01 mg/mL五味子甲素溶液。精密吸取2 μL，注入液相色譜儀，按上述色譜條件測(cè)定峰面積，以進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)，峰面積積分值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為，五味子酯甲：y=17079697.464x-143949.426，R2=0.999，安五脂素：y=9863991.036x-397671.591，R2=0.999，五味子甲素：y=12808394.387x+35291.424，R2= 1.000。五味子酯甲、安五脂素、五味子甲素的進(jìn)樣量分別在0.0085～1.5388 μg、0.0246～3.1944 μg、0.0216～2.7705 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

3.1.6 準(zhǔn)確度考察 精密稱取9份南五味子各約 1.0 g，分別精密加入五味子酯甲對(duì)照品溶液(甲醇溶解；0.0494 mg/mL、0.0988 mg/mL、0.1482 mg/mL)、安五脂素對(duì)照品溶液(甲醇溶解；0.1156 mg/mL、0.2312 mg/mL、0.3468 mg/mL)及五味子甲素對(duì)照品溶液(甲醇溶解；0.0734 mg/mL、0.1468 mg/mL、0.2202 mg/mL)25 mL，按供試品制備方法處理，進(jìn)行含量測(cè)定。結(jié)果五味子酯甲平均回收率為99.42%，RSD值為3.4%，安五脂素平均回收率為99.36%，RSD值為3.2%，五味子甲素平均回收率為98.37%，RSD值為1.7%，表明方法準(zhǔn)確性良好。

3.2 含量測(cè)定 取15批南五味子，按上述方法檢測(cè)，結(jié)果見表2。由結(jié)果可知，不同產(chǎn)區(qū)南五味子藥材有效成分五味子酯甲、安五脂素、五味子甲素含量存在一定差異，各產(chǎn)區(qū)藥材五味子酯甲和五味子甲素含量陜西周至縣與山西平陸縣較高，陜西省旬陽(yáng)縣、四川平武縣及河南西峽縣含量較低，安五脂素含量在陜西周至縣、山西平陸縣及河南西峽縣較低，陜西省旬陽(yáng)縣、四川平武縣含量較高，不同產(chǎn)地南五味子指標(biāo)成分含量分布情況如圖2所示。其中，相同產(chǎn)區(qū)不同批次間藥材含量也有所不同，同產(chǎn)區(qū)不同批次藥材含量也存在一定波動(dòng)，采用Graphpad Prism對(duì)不同產(chǎn)地之間的五味子酯甲含量、安五脂素、五味子甲素含量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果見表3，分析結(jié)果顯示五味子酯甲含量在陜西省西安市周至縣、山西省運(yùn)城市平陸縣產(chǎn)區(qū)含量較高，相較其他產(chǎn)區(qū)具有顯著差異；安五脂素含量在陜西省安康市旬陽(yáng)縣，四川省綿陽(yáng)市平武縣產(chǎn)區(qū)含量較高，相較陜西西安周至縣具備顯著差異；五味子甲素含量在不同產(chǎn)區(qū)、相同產(chǎn)地不同批次間存在一定波動(dòng)，各產(chǎn)區(qū)之間無(wú)顯著差異。

圖2 不同產(chǎn)地南五味子指標(biāo)成分含量分布圖

表2 不同批次南五味子含量測(cè)定結(jié)果表

表3 不同產(chǎn)地南五味子含量統(tǒng)計(jì)分析表

3.3 特征圖譜共有模式建立 取15批南五味子，按“2.4”項(xiàng)方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)行測(cè)定，將實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2012版)”，將各色譜峰匹配，建立特征圖譜呈現(xiàn)10個(gè)共有特征峰，如圖3所示，10個(gè)峰占比色譜峰總面積的95%以上，提示該方法可用于南五味子藥材質(zhì)量的整體評(píng)價(jià)，其中1號(hào)、2號(hào)、5號(hào)、8號(hào)、9號(hào)峰的保留時(shí)間應(yīng)分別與5-羥甲基糠醛、原兒茶酸、五味子酯甲、安五脂素、五味子甲素對(duì)照品參照物峰的保留時(shí)間相對(duì)應(yīng)，與五味子酯甲參照物相應(yīng)的峰為S峰，計(jì)算特征峰3、峰4、峰6、峰7、峰10與S峰的相對(duì)保留時(shí)間，分別為：0.85(峰3)、0.97(峰4)、1.02(峰6)、1.05(峰7)、1.52(峰10)。

(A)南五味子飲片對(duì)照?qǐng)D譜

3.4 聚類分析 以15批次樣品中五味子酯甲、安五脂素、五味子甲素的含量為變量，采用SPSS 20.0進(jìn)行聚類分析，采用組間連接法，以歐氏距離作為樣品的測(cè)度，如圖4所示，當(dāng)距離為7時(shí)，結(jié)果15批藥材樣品可聚為3大類，1～3聚為一類，產(chǎn)地為陜西安康，4～6，11、13聚為一類，分布在陜西、山西一帶，7～10，12、14、15聚為一類，分布在河南陜西一帶，聚集類別與產(chǎn)地存在一定關(guān)聯(lián)，結(jié)論與含量統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果基本一致。

圖4 聚類分析樹狀圖

結(jié)合所建立的特征圖譜共有模式，以15批次樣品中五味子酯甲參照物相應(yīng)的峰為S峰，計(jì)算各共有特征峰的相對(duì)峰面積，并以此為變量，采用SPSS 20.0進(jìn)行聚類分析，采用組間連接法，以歐氏距離作為樣品的測(cè)度，如圖5所示。當(dāng)距離為3時(shí)，結(jié)果15批藥材樣品可聚為3類，1～3聚為一類，產(chǎn)地為陜西安康；4～6，11～13聚為一類，分布在陜西、山西一帶；7、9、10、14、15聚為一類，分布在河南陜西一帶，特征聚類結(jié)果與含量聚類結(jié)果一致。

圖5 聚類分析樹狀圖

3.5 主成分分析 利用SPSS 20.0軟件，將15批南五味子特征圖譜中10個(gè)共有峰的相對(duì)峰面積進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，再通過(guò)主成分法進(jìn)行因子分析。總方差解釋結(jié)果顯示，共有2個(gè)主成分的特征值大于1，方差貢獻(xiàn)率分別為55.175%、18.974%，累計(jì)方差貢獻(xiàn)率為55.175%、74.149%，表明其可代表南五味子特征圖譜共有峰的大部分信息。結(jié)果見表4。

表4 南五味子前2個(gè)主成分的特征值和方差貢獻(xiàn)率表

利用SPSS 20.0軟件，同時(shí)繪制碎石圖，如圖6所示。由圖可知，前2個(gè)主成分之間的坡度較陡，其余主成分之間的坡度逐漸趨于平緩，表明這10個(gè)主成分中，前2個(gè)主成分具有主導(dǎo)作用。

圖6 南五味子特征圖譜中10個(gè)共有峰的主成分碎石圖

利用SPSS 20.0軟件，以共有峰的相對(duì)峰面積為變量，同時(shí)進(jìn)行成分矩陣分析，詳見表5。由表5可知，第1主成分主要反映峰3～4，6～7，9對(duì)應(yīng)成分的信息，其中峰4為五味子酯丙、峰6為五味子酯乙、峰7為五味子酯丁、峰9為五味子甲素，峰3未知；同時(shí)對(duì)第一主成分，和第二主成分為變量，投影得到二維投影圖，如圖7所示。通過(guò)投影圖對(duì)特征進(jìn)行描述，絕對(duì)值越大，說(shuō)明其對(duì)于主成分的影響越大，這種影響是可以通過(guò)所對(duì)應(yīng)的點(diǎn)到原點(diǎn)的距離進(jìn)行衡量的，由以上圖表可知通過(guò)因子分析降維處理后所提取的2個(gè)主成分能代表南五味子特征圖譜中10個(gè)共有峰的主要信息。

圖7 南五味子主成分二維投影圖

表5 南五味子主成分矩陣表

綜上，通過(guò)單一含量指標(biāo)結(jié)果分析：五味子酯甲和五味子甲素含量陜西周至縣與山西平陸縣較高，相較其他產(chǎn)區(qū)具有顯著差異(P<0.05)；安五脂素含量在陜西省安康市旬陽(yáng)縣，四川省綿陽(yáng)市平武縣產(chǎn)區(qū)含量較高，相較陜西西安周至縣具有顯著差異(P<0.05)；五味子甲素含量在不同產(chǎn)區(qū)、相同產(chǎn)地不同批次間存在一定波動(dòng)，各產(chǎn)區(qū)之間無(wú)顯著差異。但綜合3個(gè)成分及特征圖譜結(jié)果進(jìn)行聚類分析及主成分分析，結(jié)果顯示，不同產(chǎn)地及相同產(chǎn)地不同批次間含量及特征圖譜存在一定差異，樣品質(zhì)量與產(chǎn)地有一定關(guān)聯(lián)性。因此，所建立UPLC特征圖譜及多指標(biāo)含量測(cè)定方法簡(jiǎn)便、易行，結(jié)合聚類分析和主成分分析可用于南五味子的質(zhì)量控制。

4 討論

《中國(guó)藥典》中五味子酯甲為南五味子藥材的含量指標(biāo)成分，文獻(xiàn)中雖然對(duì)多種木質(zhì)素類成分進(jìn)行了(五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素等)定量分析。但結(jié)合南五味子特征圖譜研究發(fā)現(xiàn)，五味子酯甲和五味甲素在特征圖譜中呈現(xiàn)且有較高的響應(yīng)，安五脂素為南五味子與五味子區(qū)分成分，故參考藥典及相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道建立了UPLC特征圖譜方法同時(shí)測(cè)定五味子甲素、安五脂素和五味子酯甲3個(gè)指標(biāo)含量。

色譜條件考察時(shí)考慮南五味子中所含的有機(jī)酸類和木質(zhì)素類分別在280 nm和220 nm處有最大吸收，因此檢測(cè)波長(zhǎng)選擇了切換波長(zhǎng)的方式。同時(shí)對(duì)不同品牌的色譜柱進(jìn)行篩選，最終采用ACQUITY BEH C18色譜柱，通過(guò)對(duì)不同有機(jī)相體系(甲醇、乙腈)、不同緩沖鹽(0.1%磷酸、0.1%醋酸、0.1%甲酸)、不同柱溫(32 ℃、35 ℃、38 ℃)、不同流速(0.25 mL/min、0.30 mL/min、0.35 mL/min)、不同品牌儀器(waters H-class和Agilent 1290Ⅱ)的考察，確定以乙腈-0.1%磷酸溶液為流動(dòng)相；柱溫為35 ℃；流速為0.30 mL/min，實(shí)現(xiàn)了對(duì)有機(jī)酸成分與木脂素成分的合并洗脫。此外，還考察了不同提取溶劑(水、30%甲醇、50%甲醇、70%甲醇、甲醇、乙醇提取效果，結(jié)果甲醇提取效果最好)，不同提取方式(超聲和回流，結(jié)果回流提取效果較好)，所建立UPLC特征圖譜10個(gè)共有峰主要定量峰達(dá)到基線分離，兼具定性和定量作用，為南五味子藥材的質(zhì)量控制及評(píng)價(jià)提供參考。