代謝工程改造微生物合成生物基單體的進展與挑戰

高聰，陳城虎，陳修來，劉立明

（江南大學食品科學與技術國家重點實驗室，江蘇 無錫 214122）

目前的塑料制品主要是通過化石燃料合成或半合成的。在塑料生產、應用、回收和焚燒的每個階段，都涉及了溫室氣體的排放與嚴重的環境污染[1]。為減少環境污染，消除對化石燃料的依賴，生物塑料作為化石塑料的替代品越來越受到人們的關注。生物塑料是由可再生資源（如纖維素、淀粉、木質素等）制成的生物基聚合物。與化石塑料相比，生物塑料可實現資源回收，具有更低的碳足跡，并表現出良好的材料性能，在創建低碳循環經濟中發揮著關鍵作用[2]。

根據2021 年歐洲生物塑料協會的報告，目前市場上代表性的生物塑料主要包括聚己二酸對苯二甲酸丁二醇酯（PBAT）、聚乳酸（PLA）、聚丁二酸丁二醇酯（PBS）、聚酰胺（PA）、聚對苯二甲酸丙二醇酯（PTT）和聚對苯二甲酸乙二醇酯（PET）等，上述生物塑料約占總生物塑料市場份額的65%。而構成這些生物塑料的單體主要包括1,4-丁二醇（1,4-BDO）、1,3-丙二醇（1,3-PDO）、己二酸、丁二酸、戊二胺、戊二酸、乳酸、對苯二甲酸等。

利用微生物生產塑料單體具有條件溫和、環境友好、操作簡便等優點。預計到2025 年，生物塑料的年市場份額將增加到總塑料市場份額的18%[3]。隨著合成生物學技術的進步，已經開發了各種微生物細胞工廠用于高值化合物生產（圖1）。其中一些產品，如丁二酸，已經進入了商業化生產。然而，由于部分單體的經濟可行性較低，實現工業規模的微生物生產仍然具有挑戰性[4]。這些挑戰包括：①原材料利用效率低，在單體生產過程中，提高可再生原料的利用效率對于避免使用糧食作物或降低生產成本至關重要；②單體合成效率差，微生物代謝網絡非常復雜，導致單體合成途徑效率較低；③環境耐受程度較弱，發酵過程中的各種因素，如pH、滲透壓和高濃度代謝物均會對微生物單體生產的過程造成不利影響。

圖1 微生物合成塑料單體的代謝途徑

本文從底物利用能力、單體合成性能、脅迫環境耐受三個方面綜述了提高微生物塑料單體生產效率的方法和策略。同時，對微生物細胞塑料單體存在的挑戰和未來發展方向進行了展望。

1 廉價底物的高效利用

自然界中有豐富的可再生資源，如CO2、木質纖維素、葡萄糖等，但對這些底物的高效利用仍具有挑戰性。為了解決這一問題，提高工程菌株塑料單體合成效率，目前主要有：設計底物利用途徑、提高底物利用能力、優化底物轉化過程等三種方法。

1.1 設計底物利用途徑

設計底物利用途徑可以改善廉價底物向高附加值生物基單體的轉化過程。設計底物利用途徑根據途徑的來源可分為挖掘內源性底物利用途徑、構建人工底物利用途徑、整合內源和人工底物利用途徑和偶聯多菌底物利用途徑等四種類型。

（1）挖掘內源性底物利用途徑。模式異養微生物，如大腸桿菌和酵母，經改造后可生產多種生物基單體。但這些微生物難以利用CO2和甲烷等C1底物。通過招募具有天然C1底物利用能力的微生物，可以產生強大的代謝驅動力，驅動碳流合成目標單體。例如，對光自養微生物細長聚球藻進行啟動子挖掘和基因組水平代謝途徑改造，使其合成賴氨酸。在此基礎上，引入尸胺和戊二酸異源合成途徑，實現從CO2直接光合生產生物基單體[5]。類似的，通過在甲烷氧化菌OB3b 中引入賴氨酸脫羧酶、天冬氨酸激酶和內消旋-二氨基庚二酸脫羧酶，最終工程菌株可直接利用甲烷為底物，產生283.63mg/L尸胺[6]。

（2）構建人工底物利用途徑。對于一些特殊的底物，如化學或餐飲廢棄物，微生物可能沒有天然的底物利用途徑。為此，可以設計人工途徑使工程菌株利用這些非代謝底物，以獲得所需的化學物質。例如，通過酶挖掘和多酶級聯反應設計，在臺灣假單胞菌VLB120中構建了利用環己烷合成己二酸的代謝途徑。經途徑酶表達優化和生物反應器優化，工程菌株以環己烷為底物可生產10.2g/L 己二酸[7]。類似的，本文作者團隊通過模塊優化β-氧化途徑和ω-氧化途徑，在大腸桿菌構建了以廢棄食用油為底物生產中鏈α,ω-二羧酸的代謝途徑。經實驗室適應進化，該菌株以廢棄食用油為唯一碳源，可生產15.26g/L中鏈α,ω-二羧酸[8]。

（3）整合內源和人工底物利用途徑。雖然微生物可以通過天然途徑利用大多數底物，但其效率普遍較低，通過結合人工途徑可以提高底物利用效率。例如，大腸桿菌本源羧化酶固碳效率較低，為解決這一問題，本文作者團隊開發了自組裝硫化鎘納米顆粒來改善CO2固定過程，并設計了CO2減排開關來弱化CO2釋放過程。通過整合CO2固定和釋放模塊，工程大腸桿菌可以協同利用葡萄糖和CO2生產1.48mol/mol葡萄糖的蘋果酸[9]。

（4）偶聯多菌底物利用途徑。在菌株中引入多酶參與的異源底物代謝途徑會引起細胞負荷，影響細胞生長性能和單體合成效率[10]。為解決這一問題，可以設計共培養策略：一種細胞用于降解復雜底物，而另一種細胞用于單體合成。例如，通過共培養可分解纖維素的里氏木霉和可生產乳酸的戴爾根霉，該混菌培養策略以微晶纖維素為底物，合成了乳酸[11]。與純菌株相比，混菌體系可以結合不同菌株的功能來實現對一些特殊底物（如CO2）的直接利用。最近，通過共同培養工程細長聚球藻和惡臭假單胞菌設計了一個混菌體系[圖2(a)]，在該體系中，細長聚球藻可以固定CO2產生蔗糖，而所產生的蔗糖可以支持惡臭假單胞菌的生長，以催化5-羥甲基糠醛轉化為2,5-呋喃二羧酸[12]。

圖2 廉價底物的高效利用

1.2 強化底物利用能力

實現微生物利用廉價和豐富的底物生產高附加值化合物降低生產成本的重要策略。然而，并不是所有的底物都可以不經預處理直接利用[13]。因此，加強底物的利用能力尤為重要。為實現這一目標，目前主要有：優化傳質效率、促進底物解聚、擴大底物譜、實現底物脫毒等四種策略。

（1）優化傳質效率。微生物對底物利用能力的提高往往伴隨著底物傳質效率的提高。可以通過開發提高界面傳質效率的水-有機雙相轉化體系，提高底物傳質效率。例如，對二甲苯（PX）和對苯二甲酸（TPA）都是易揮發的化合物，幾乎不溶于水。為了提高傳質效率，采用具有生物相溶性的油醇作為有機相進行兩相轉化。PX 可以溶解在油醇中，并允許以特定的分配系數分配到水相中。在該雙相轉化體系中，工程大腸桿菌經過46h的生物轉化可獲得6.9g/L 的TPA[14]，通過將合成路徑整合到基因組上并進行轉化工藝優化，TPA產量進一步提升到了38.3g/L[15]。

（2）促進底物解聚。微生物可以高效利用五碳和六碳基質。然而，大部分微生物難以高效利用高度聚合的生物質原料，需要將這些聚合底物解聚為單糖后才能被微生物吸收利用。為了降解這些底物，可以采用多種物理或化學的底物解聚方法。例如，最近設計了一種共溶劑（NaOH/ChCl：TH/Water），可以在溫和條件下有效降低甘蔗渣的聚合度。工程大腸桿菌可以直接利用預處理后的甘蔗渣水解物生產己二酸，產率達0.39g/g 葡萄糖，具有較高的成本效益[16]。

（3）擴大底物譜。微生物在利用不同糖類底物時存在偏好性，導致資源浪費[17]。通過擴大微生物的底物譜，可大大降低整體生產成本。例如，野生型谷棒桿菌菌株不能直接利用低聚木糖。為解決這一問題，可利用細胞表面展示技術，借助PorH 錨定蛋白在谷棒桿菌細胞表面表達β-木糖苷酶，引入木糖同化途徑，使工程谷棒桿菌以低聚木糖為底物生產了11.6mmol/L的戊二胺[18]。類似的，在大腸桿菌細胞表面表達α-淀粉酶，工程菌株能夠以淀粉為底物直接生產1,2-丙二醇和1,3-丙二醇[17]。

（4）實現底物脫毒。對底物進行脫毒處理也有助于提高微生物的底物利用能力。預處理木質纖維素生物質的過程中會產生各種化學抑制劑，嚴重阻礙微生物的生長[19]。為了解決這一問題，可以開發一個微生物群落實現抑制劑的脫毒處理。例如，在由工程惡臭假單胞菌和凝結芽孢桿菌組成的微生物群落中，惡臭假單胞菌被設計用于木質纖維素水解物中有毒底物的脫毒處理，而凝結芽孢桿菌被設計用于從水解物中吸收碳源，并合成了35.8g/L 的乳酸[圖2(b)][20]。類似的，通過建立一個由惡臭假單胞菌和大腸桿菌組成的微生物合成群落，以木質纖維素水解物為底物，生產得到1.02g/L 中鏈聚羥基烷酸酯[21]。

1.3 優化底物轉化過程

除了設計底物利用途徑以提高底物利用能力外，還可以優化底物轉化過程，以促進底物的高效吸收和利用。總的來說，可以提出四種策略：過表達轉運蛋白優化底物轉運、緩解碳分解代謝抑制、實現一步生物轉化、強化能量供給提高底物轉運效率。

（1）過表達轉運蛋白。底物的利用率會受到底物傳輸效率的影響。適當過表達轉運蛋白可以增強細胞從胞外攝取底物的效率。例如，在解脂耶氏酵母中引入丁二酸合成途徑后，工程菌株在甘油培養基中生長速率較低。通過過表達甘油激酶GUT1，工程細胞對甘油的攝取速率較對照菌株提高了13.5%，細胞比生長速率由0.30h-1提高至0.37h-1，丁二酸產量和生產強度分別提高了32%和143%[22]。

（2）緩解碳分解代謝抑制。當多種底物同時存在時，可能會發生碳分解代謝抑制，從而抑制細胞對非偏好性碳源的利用效率[23]。為此，可以發展三種緩解分解代謝抑制效應的方法。首先，刪除碳抑制控制（Crc）基因。例如，惡臭假單胞菌可經工程改造轉化阿魏酸為黏康酸。然而，培養基中需要添加用于補充能量和細胞生長的葡萄糖，導致碳分解代謝抑制，降低細胞生產性能。通過將菌株的Crc 編碼基因刪除，可使工程菌株轉化阿魏酸為黏康酸的得率提高一倍[24]。其次，篩選木糖分解代謝操縱子XylR突變體。研究發現在XylR中引入R121C和P363S突變，可以激活木糖分解代謝。與野生型菌株相比，突變體菌株使用葡萄糖-木糖混合底物生產乳酸時，產量提高了50%[25]。第三，敲除葡萄糖轉運蛋白Crr。敲除肺炎克雷伯菌的葡萄糖轉運蛋白Crr，可以增加甘油進入1,3-丙二醇合成途徑的當量，緩解葡萄糖對甘油的代謝抑制。工程菌株的1,3-丙二醇濃度從61g/L增加到78g/L，甘油轉化率達到59.5%[26]。

（3）實現一步生物轉化。在轉化利用淀粉、纖維素和木聚糖等聚合底物時，需要涉及多個獨立的生物過程，包括水解酶的生產、底物水解成單糖、以及單糖代謝成目標產品。為降低生產成本和簡化過程，可以招募一些具有同時水解和發酵底物能力的菌株，以實現一步生物轉化過程[27]。例如，食木薯乳桿菌DSM13343具有分泌α-葡萄糖苷酶和蛋白酶并同時合成乳酸的能力，利用該特性，菌株可降解食物廢棄物直接發酵得到18.69g/L乳酸[28]。

（4）強化能量供給。優化生物轉化過程中能量供給，能使微生物以更低的能量消耗來利用底物，進而提高底物的利用效率。為了實現這一目標，可以提高細胞內ATP 濃度，以補償底物吸收和運輸過程（如碳固定和木糖運輸）中消耗的能量。例如，本文作者團隊[29]在改造大腸桿菌合成蘋果酸時，通過在大腸桿菌中過表達磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶與CO2固定途徑，蘋果酸生物合成途徑的CO2固定效率提高了110%。

綜上所述，通過設計底物利用途徑、提高利用能力、優化轉化過程，底物利用在生物基單體生物合成中起著重要作用。開發高效的底物利用策略具有多種優勢：①降低生產成本，建立高效利用廉價豐富底物的策略對于提高生物基單體相對于石油化工基單體的市場競爭力是非常重要的；②環境保護，生活垃圾往往造成資源浪費和環境污染，發展廢棄物高效利用策略是實現綠色生物制造的關鍵[8]；③微生物合成性能提高，通過緩解碳分解代謝抑制、加強能量供給等一系列策略，可以提高工程菌株在生物基單體生產中的效率。

2 提高生物基單體合成效率

通過對廉價底物的高效利用，可以大幅降低微生物基材料的生產成本。此外，為了促進底物轉化為目標產物，還可以從酶、途徑、細胞等不同調控水平發展精細調控策略，以提高微生物細胞工廠的合成效率。這些策略根據調控層次可以劃分三大類：強化關鍵酶性能、優化合成途徑效率以及調節細胞代謝網絡。

2.1 強化關鍵酶性能

強化關鍵酶的性能以提高微生物細胞工廠合成塑料單體的效率是一種常見的策略。可以從四個方面對途徑酶的性能進行改善：篩選異源酶以獲得最佳酶、促進蛋白質正確折疊最大化酶活、提高蛋白表達水平促進更多代謝通量、酶定向進化改變酶的特性。

（1）篩選異源酶。在合成途徑中，途徑酶的性能往往對合成效率和反應方向起著至關重要的作用。在微生物合成途徑中，當內源酶活性不夠高或缺乏能發揮特定作用的酶時，可通過篩選具有高催化效率的異源酶進行優化。例如，對不同來源的蘋果酸脫氫酶（MDH）進行了篩選，并在產琥珀酸曼氏桿菌中進行表征。結果表明，來源于谷棒桿菌的MDH 具有最高的酶活性，并進一步用于取代產琥珀酸曼氏桿菌內源MDH，使丁二酸濃度達到134.25g/L[30]。在一項類似的研究中，將來源于凝結芽孢桿菌的烯酸還原酶引入釀酒酵母，通過三段發酵工藝優化，最終工程菌株可直接以葡萄糖為底物生產己二酸[31]。

（2）促進蛋白質正確折疊。酶的正確折疊也在一定程度上增強酶的性能。通過正確的蛋白質折疊，可以提高途徑酶的表達水平和催化活性，加快生物合成過程。通常，蛋白質折疊可以通過優化蛋白質表達條件、表達宿主、表達質粒、信號肽、分子標簽和伴侶蛋白來調節[32]。例如，通過在賴氨酸脫羧酶中引入兩性離子肽來促進其正確折疊，工程型賴氨酸脫羧酶的酶活性是野生型賴氨酸脫羧酶的兩倍[33]。

（3）提高蛋白表達水平。提高路徑酶的表達量是強化代謝效率、消除代謝瓶頸、調節代謝物分布的一種簡單方法。隨著組學技術和表征技術的發展，已經獲得了許多可用于調控基因表達的基因元件，如啟動子元件、RBS元件、終止子元件等。例如，為了減少工程大腸桿菌細胞中戊二胺的積累和抑制，可以使用高拷貝質粒提高雙向戊二胺轉運蛋白PotE 的表達量，以驅動戊二胺到目標化合物戊二酸的轉化[34]。

（4）酶定向進化。途徑酶活性容易受到外部環境和內部環境的影響。因此，有必要對酶催化活性、穩定性和立體選擇性進行改造，以提高微生物細胞的性能[35]。例如，賴氨酸脫羧酶在轉化賴氨酸為戊二胺的過程中易受到pH 的影響，阻礙了其在工業生產中的應用。為此，通過對賴氨酸脫羧酶的pH 穩定性進行蛋白質定向進化。在pH 為10.0 時，突變體M3 的戊二胺產量比對照菌株提高了6 倍，工程菌株在15h內可產生418g/L戊二胺，這是迄今為止報道的最高濃度[36]。利用蛋白質定向進化可以同時對酶的不同特性進行改造。例如，結合定向進化和計算引導的虛擬篩選可以提高賴氨酸脫羧酶的熱穩定性和堿性穩定性。含有最佳突變體的工程菌株在50℃條件下，不經pH 調節可產生160.7g/L 戊二胺[37]。

2.2 優化合成途徑效率

微生物單體合成途徑往往存在代謝反應步驟長、副產物積累多等挑戰。因此，通過優化合成途徑效率，可使底物更高效地轉化為目標產物。目前用于優化合成途徑效率的策略主要包括平衡酶表達水平、重定向目標代謝通量、縮短空間距離、動態通路調節等。

（1）平衡酶表達水平。多種酶參與的合成途徑普遍存在代謝瓶頸，導致中間代謝物積累，影響代謝途徑的催化效率。為此，可以通過調控各酶的表達水平來提高代謝途徑的整體催化效率[圖3(a)]。常見的酶表達水平優化策略包括質粒優化[38]、啟動子工程[39]和核糖體結合位點工程[40]。例如，本文作者團隊[38]利用不同拷貝數質粒組合優化戊二酸生物轉化途徑中涉及的七種酶，提高了戊二酸的合成效率。類似的，通過不同強度的啟動子和核糖體結合位點優化，工程大腸桿菌以賴氨酸為底物可轉化合成77.62g/L戊二酸[32]。

圖3 提高路徑合成效率

（2）重定向目標代謝通量。微生物代謝網絡存在廣泛的調控和復雜的相互作用，導致目標產物合成效率低下。可以采用兩種方法將代謝通量重定向到目標產物合成。首先，過表達合成途徑關鍵酶以增加前體濃度。例如，通過優化釀酒酵母中丙二酰輔酶A 的合成途徑來改善前體丙二酰輔酶A 的供應，使丙二酸產量達到1.62g/L[41]。同樣的，通過增加合成前體5-氨基戊酸的積累量，工程谷棒桿菌的戊二酸產量達到22.7g/L[3]。其次，阻斷副產物合成途徑減少代謝損失。例如，本文作者團隊[42]通過引入CRISPRi、穩定期啟動子和蛋白質降解標簽等功能元件，構建了一個用于重定向代謝通量的自主調節回路。通過設置向導RNA，同時靶向抑制不同副產物合成途徑，戊二酸生產菌株的乙酸、乳酸和甲酸等副產物濃度分別比對照菌株降低了40%、41%和35%。

（3）縮短空間距離。構建底物通道是減少中間代謝物逸出、提高多酶級聯反應效率的重要方法之一。基于支架策略，可以將不同的途徑酶固定在DNA、RNA 或蛋白質支架上，縮短空間距離，提高合成途徑催化效率[43]。例如，通過將磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶和蘋果酸脫氫酶排列在工程大腸桿菌合成蛋白質支架復合物上，蘋果酸的產量提高了3.6倍[44]。

（4）動態通路調節。動態控制化學品生產與細胞生長是提高化學品合成效率的有效手段。通過動態途徑調控，碳通量可以在特定時間或代謝物濃度下定向到目標產品合成[45]。例如，通過設計一種傳感器調節器和基于RNAi 的雙功能動態開關，實現了目標生物合成模塊的上調和競爭通路基因的下調，使工程大腸桿菌菌株生產1.8g/L黏康酸，顯著高于靜態對照菌株[46]。此外，還可根據外界環境變化設計各種動態開關。例如，利用低pH 誘導的啟動子Pgas動態控制順式烏頭酸脫羧酶基因的表達，使工程菌株的衣康酸濃度提升到4.92g/L[47]。

2.3 調控細胞代謝網絡

通過優化細胞內碳通量和氧化還原平衡，可以提高工程微生物的合成效率。常用的策略包括組學輔助關鍵目標識別、代謝驅動設計、工程轉錄因子和調節氧化還原穩態。

（1）組學輔助關鍵靶點識別。為了適應復雜多變的外界環境，微生物進化出了多種反饋調控網絡，降低了理性代謝工程的成功率。為解決這一問題，可以采用基因組組、轉錄組和代謝組的方法篩選關鍵的調控靶點。例如，基于谷棒桿菌的基因組代謝網絡模型和組學分析，獲得了11 個與戊二酸生物合成相關的關鍵基因。將這些基因組合改造后，工程菌株戊二酸產量達105.3g/L[48]。第二種方法是建立高通量的篩選文庫，用于識別工程靶點，增強塑料單體生產效率。例如，為了獲得與戊二胺生產相關的關鍵基因，構建了67 個可抑制基因表達的sRNAs 庫，并在大腸桿菌中進行了測試。最優工程菌株能生產13.7g/L的尸胺[49]。

（2）代謝驅動設計。微生物細胞工廠中的輔因子和前體物質在目標產物的生物合成中起著至關重要的作用。通過偶聯輔因子或前體的再生和消耗反應，可以產生代謝驅動力，從而提高目標產物的合成效率。例如，在工程大腸桿菌中，通過將賴氨酸分解代謝途徑產生的多余NADP+和α-酮戊二酸循環到大腸桿菌中消耗NADP+和α-酮戊二酸的戊二酸生物合成途徑中，可以驅動戊二酸的高效生物合成，產量達54.5g/L[34][圖3(b)]。類似的，通過引入強制ATP消耗途徑來降低胞內過量的ATP，更多的碳通量被重定向到2,3-丁二醇合成途徑，使工程大腸桿菌2,3-丁二醇濃度提高了10倍[50]。

（3）工程轉錄因子。轉錄因子可以調控多個基因甚至全局代謝網絡基因，因此可以作為提高微生物單體合成效率的重要靶點。例如，基于轉錄組學分析，確定了刪除需鈉弧菌中的全局轉錄調控因子ArcA和GlpR可增強1,3-丙二醇合成途徑的碳通量，最終工程菌株的1,3-丙二醇的得率提高到0.50mol/mol甘油[51]。

（4）調節氧化還原穩態。氧化還原穩態可以通過調節ATP 或NAD+濃度來實現，調節微生物細胞工廠的氧化還原平衡，可以提高單體合成效率。例如，通過調節大腸桿菌胞內ATP 濃度[52]和NADH/NAD+濃度比[53]以適配丁二酸生物合成的需求，工程菌株丁二酸濃度可分別提高282%和39%。類似的，本文作者團隊[54]在大腸桿菌中開發了基于生物被膜雜合CdS納米的策略，使胞內NADH濃度提高83.3%，NADH 依賴性L-蘋果酸產量提升至45.93g/L。

綜上所述，通過強化關鍵酶的性能、優化合成途徑的效率、調控細胞代謝網絡等一系列的調控策略，可以顯著提高微生物細胞工廠的效率。未來，通過整合邏輯門和生物傳感器遺傳元件，塑料單體的合成途徑可以實現定時、定量、定需的表達，以提高細胞活性和生產效率[55]。

3 強化細胞環境耐受性

在微生物發酵生產過程中，塑料單體的持續合成會引起滲透壓、酸堿脅迫，使微生物細胞受到損傷或抑制，影響細胞的生長和生產[55]。因此，提高微生物對環境脅迫的耐受性顯得尤為重要。可以從三個方面加強底盤細胞的耐受性：增強酸堿脅迫耐受能力、提高滲透脅迫耐受性和增強代謝物耐受脅迫能力。

3.1 增強酸堿脅迫耐受性

隨著產物的積累，發酵體系的pH 也會發生變化。因此，有必要提高細胞的酸堿耐受性，以減少酸堿脅迫對微生物細胞的毒副作用。常用的解決策略包括：引入保護劑、工程細胞膜、表達耐酸基因、篩選耐受菌株。

（1）引入保護劑。維持細胞穩態的常見調節策略是引入pH 中和劑，以維持發酵環境的穩定。例如，使用賴氨酸作為底物生產戊二胺時，為了防止發酵體系pH 持續增加，可以對生物反應器進行修改，以重新捕獲賴氨酸脫羧過程中釋放的CO2。通過招募CO2作為pH 中和劑，并將其重新溶解到發酵液中，降低了發酵系統的pH，使戊二胺的轉化得率達到0.99mol/mol 賴氨酸[56][圖4(a)]。類似的，在丁酸梭菌發酵生產1,3-丙二醇的過程中，通過建立CO2原位捕集技術穩定生產體系pH，工程菌株的1,3-丙二醇產量達到88.6g/L[57]。

圖4 提高底盤細胞環境適應性

（2）工程細胞膜。雖然添加保護劑可以促進微生物的生長和生產，但它也增加了生產總成本。細胞膜作為抵御環境壓力的第一道屏障，可以通過改造其流動性和完整性，來增強細胞的環境抗性[58]。例如，通過增加反式不飽和脂肪酸的含量來改變細胞膜的流動性，可以提高產琥珀酸曼氏桿菌的產物耐受性，從而使丁二酸產量比對照菌株增加[59]。除了改變膜組部，也可以設計膜轉運蛋白來提高細胞的酸堿脅迫耐受性。例如，在乳酸乳球菌中過表達膜轉運蛋白ZitP和ZitQ，對提高細胞耐酸能力有顯著作用[60]。

（3）表達耐酸基因。基因工程也是提高細胞脅迫耐受能力的有效的策略。具體改造靶點包括過表達負責胞內質子轉化的基因或一些關鍵耐酸基因。例如，在大腸桿菌中，通過過表達氫化酶附屬蛋白HypB-HypC 催化質子還原生成氫[61]或通過引入三種質子消耗誘導的耐酸系統[62]，工程大腸桿菌可以在極低的pH 條件下存活。過表達某些關鍵基因可用于提高細胞的耐酸能力。例如，通過在釀酒酵母中過表達耐酸基因IoGAS1[63]或在大腸桿菌中過表達耐酸基因RecT[64]，這兩種工程菌株在高濃度乳酸下都表現出良好的細胞生長和生產性能。

（4）篩選耐受菌株。除了理性代謝工程方法外，非理性菌株篩選方法也可以提高菌株的脅迫耐受能力。例如，產丁二酸放線桿菌在低pH 條件下的產酸能力很差。通過適應性實驗室進化，獲得了在弱酸條件下細胞生長和丁二酸合成能力強化的突變菌株BC-4，在pH=4.0厭氧條件下，突變菌株的比生長速率和丁二酸產量分別較出發菌株提高了2.95倍和5.8倍[65]。

3.2 提高滲透脅迫耐受

在微生物生產過程中，滲透應激會隨著目標產物的積累而增加，導致細胞代謝活性降低，甚至細胞死亡。因此，提高細胞對滲透脅迫的耐受性，可促進細胞的可持續生長和生產。常用的策略包括：強化外排系統、突變關鍵蛋白、強化全局調控、添加保護劑。

（1）強化外排系統。通過加強工程菌株的外排系統，可以提高菌株的滲透脅迫耐受性。例如，在丁二酸生物生產過程中，隨著產物丁二酸的積累，導致高濃度的Cu(Ⅰ)會積聚在細胞周質中，引起高滲透脅迫。為了解決這一問題，研究人員篩選獲得了一種Cus銅外排系統，可用于激活CusCFBA的表達，將Cu(Ⅰ)運輸出細胞以減輕毒性。引入CusS突變后，在添加30g/L 丁二酸二鈉的培養基中，產丁二酸菌株的生物量增加了36%[66]。

（2）突變關鍵蛋白。一些關鍵蛋白在提高細胞抗滲透脅迫能力中起著重要作用。因此，理性調節它們的表達，可以獲得所需的細胞表型。例如，通過對關鍵耐受調節蛋白RNA 聚合酶RpoB 進行突變，細胞生長和丁二酸產量都可以增加40%以上[67]。非理性的菌株篩選也可以提高微生物的滲透耐受脅迫。例如，作者團隊在前期的研究中，通過對一株牛瘤胃篩選獲得的丁二酸高產菌株進行聯合誘變（ARTP 和60Co-γ 輻照）篩選，所獲得的突變菌株丁二酸產量增加了3.3倍[40]。

（3）強化全局調控。滲透壓的調控涉及多個基因的共表達，難以通過調節單個基因來實現細胞表型改變。全局轉錄因子可以影響與高滲有關的多種基因表達，因此可以作為調控微生物滲透脅迫的靶點。例如，通過過表達大腸桿菌全局調控因子IrrE，可以強化內源性滲透保護劑（如海藻糖和甘油）的合成，使工程大腸桿菌能在100%海水培養基中生產24.5g/L丁二酸[68]。

（4）添加保護劑。添加保護劑是提高細胞滲透壓耐受性的有效策略。在發酵后期，由于滲透脅迫的增加，導致部分途徑酶活性下降，影響細胞生產性能。為此，可以在培養基中加入一些保護劑。例如，在產琥珀酸放線桿菌發酵生產丁二酸的發酵后期添加脯氨酸時，丁二酸代謝網絡中的所有關鍵酶都表現出更高的比活性，促使工程細胞的滲透壓耐受性提高，使丁二酸濃度提高了22%[69]。

3.3 增強代謝物脅迫耐受

發酵后期代謝產物積累會引起代謝物脅迫，抑制微生物活性。為此，可以開發不同的方法來提高微生物的代謝物脅迫耐受能力，例如：適應性實驗室進化、建立細胞誘變、表達轉運蛋白、原位產物分離。

（1）適應性實驗室進化。適應性實驗室進化可通過逐漸增加產物濃度以增加進化壓力，輔助高通量篩選方法，快速獲得具有目標表型的進化菌株。例如，通過適應性實驗室進化獲得了具有高乳酸耐受性的釀酒酵母[70]。適應性實驗室進化存在的挑戰是如何建立一種遺傳工具來快速獲得所需的表型。為此，可以通過設計合適的遺傳電路來實現上述目的[71]。例如，將pH傳感器與核糖開關集成，設計了一種可自主控制應變進化的數字pH傳感系統RiDE，可用于快速獲得耐丁二酸或耐乳酸表型菌株[72]。

（2）建立細胞誘變。目前已發展出多種菌株誘變策略，如化學誘變技術或物理誘變技術。例如，通過結合化學（NTG）和等離子體誘變（ARTP）技術，獲得了一株耐受高濃度1,3-丙二醇的丁酸梭菌突變株，產量達到37g/L，比野生型菌株高29.48%[73]。有機酸的積累會抑制細胞生長和目標產物的生成。通過電子束輻照誘變，獲得了一個有機酸能力耐受能力提高18.6%的羅伊氏乳桿菌突變體。該突變株產生1,3-丙二醇達93.2g/L，比野生型菌株高34.6%[74]。

（3）表達轉運蛋白。通過表達轉運蛋白，可以降低細胞內代謝物的濃度，從而減少細胞的損傷和死亡[36]。例如，通過上調特異性多藥耐藥轉運蛋白Qdr3p的表達，己二酸對釀酒酵母細胞的毒副作用大幅下降[75][圖4(b)]。

（4）原位產物分離。提高微生物代謝產物耐受能力的第四種方法是原位產物分離。該方法可迅速降低生物反應器中代謝物的濃度，從而提高微生物菌株的存活率和產量。目前主要通過膜分離和介質交換兩種方法來實現這一目標。例如，通過開發膜分離-耦合發酵技術，降低發酵液中副產物丙酸積累對產丙酸桿菌的反饋抑制作用，工程菌株的丁二酸產量提高了48.54%[76]。通過建立培養基交換策略以消除丁二酸的產物抑制作用，有效提高了集孢藻PCC6803的存活率和丁二酸產量[77]。

在發酵過程中，各種內外部因素，如pH變化、溫度脅迫、滲透壓、氧化應激、代謝物積累等，都會影響塑料單體的高效生物生產。通過建立添加保護劑、膜工程、表達轉運蛋白等不同策略，有助于提高細胞存活率、代謝活性和微生物適應度，為高效微生物生物合成奠定堅實的基礎。

4 結語

基于微生物代謝工程策略的應用，目前許多塑料單體已經實現了微生物制造（表1）。本綜述總結了塑料單體細胞工廠的最新研究進展。盡管代謝工程策略和合成生物學工具在促進微生物生物基單體生產方面展示了巨大的潛力，但仍有一些挑戰需要解決。

表1 部分塑料單體的代謝工程策略

（1）如何提高塑料單體的得率。微生物在生產二羧酸和二元胺類塑料單體的過程中，由于存在脫羧反應，產物得率普遍較低。為了解決這個問題，可以通過多種方法來節省丟失的碳原子。首先，挖掘新型固碳酶元件[78]，通過將這些固碳酶元件在微生物中進行過表達或者基因組替換，可以將環境中的游離碳原子重新引入到胞內，提高底物到產物的碳得率；其次，設計塑料單體的新合成途徑，解決天然合成途徑中存在的CO2釋放問題；最后，構建CO2減排分子開關，精準平衡細胞生長和產物合成所需的碳流，減少不必要的CO2排放[9]。

（2）如何發揮非模式菌株優勢。部分非模式菌株相較于模式菌株在底物利用、培養周期、環境耐受性等領域展示出明顯優勢，因此可以用于改造合成塑料單體。挖掘非模式菌株資源的方向主要有兩個。第一，目標產品為導向。例如，某些微生物對高濃度二羧酸具體良好的耐受性，可通過篩選優勢菌株直接合成塑料單體；第二，生產工藝為導向。某些微生物對于極端環境，如高溫、高鹽等表現出良好的適應性，也可以被用于生物塑料單體的生產。例如，通過提高培養基中的鹽濃度，工程改造后的鹽單胞菌可以在開放的環境下，合成聚羥基脂肪酸酯[79]和戊二胺[80]，有效降低了設備投入成本，簡化了生產工藝。通過為這些非模式菌株建立遺傳操作工具，可以建立高效的微生物細胞工廠，解決當前模式菌株改造過程中存在的挑戰。