吸附樹脂對唾液酸的分離純化

張振，李丹，陳辰，吳菁嵐，應漢杰，喬浩

（南京工業大學國家生化工程技術研究中心，江蘇 南京 211816）

唾液酸（sialic acid，SA）是含有9個碳原子的一類羧基化單糖酰化衍生物的統稱[1-2]。因為N-乙酰神經氨酸最廣泛存在于自然界，所以通常所說的SA 是指N-乙酰神經氨酸，本文中提到的SA 均為N-乙酰神經氨酸。N-乙酰神經氨酸純品為無色固體，無氣味，易溶于水，在水溶液中不發生變旋作用，CAS 登記號為131-48-6，分子式為C11H19NO9，分子量為306.3[3]。同時N-乙酰神經氨酸在堿性環境中不穩定，易溶于水，在甲醇和乙醇中微溶，在乙醚和酯類等溶劑中溶解度較低。SA在動物細胞表面的糖蛋白和糖脂的糖鏈末端上廣泛地分布，能夠在細胞表面多種生理功能活動中發揮重要作用[3-4]。SA可以給大腦提供營養，是一種純天然的營養素，對于嬰兒的記憶提升和智力發育有很大的促進作用[5]，因此可以作為嬰幼兒配方奶粉的組成成分。SA 因其本身能作為可被識別的受體用來掩蓋其他分子，所以被用來遮蓋惡性腫瘤細胞表面的抗原決定簇，增強機體自身的免疫力。與此同時SA及其衍生物因其重要價值，在治療流感、神經性疾病、炎癥、腫瘤等方面也發揮著重要的作用[6-8]。

目前制備SA 的方法主要有：化學合成法，該方法用N-乙酰甘露糖胺和二叔丁基氧代丁二酸的鉀鹽縮合，在堿的催化下經脫羧反應可生成N-乙酰神經氨酸[9]，缺點是反應條件苛刻；酶法合成法，該方法利用N-乙酰甘露糖胺、丙酮酸鈉和ATP 在SA 醛縮酶的催化下合成N-乙酰神經氨酸[10-11]，缺點是合成原料價格昂貴；天然物抽提法，Juneja等[12]從禽蛋的蛋黃膜和系帶中提取SA已獲成功并已應用于生產，Whitehouse 等[13]從牛乳乳清中提取SA，Schauer 等[14]報道了用熱乙醇法從血清中提取SA，該方法缺點是過程復雜，收率較低。目前被廣泛應用的SA 制備方法為生物轉化法，該方法主要是以N-乙酰葡萄糖胺和過量的丙酮酸鈉為底物，以N-乙酰甘露糖胺為中間產物，通過生物合成的方法得到SA[15]。生物轉化法具有成本低廉、操作簡單的優勢，為后續大規模生產SA 提供了可能。目前從轉化液中分離回收SA 主要通過強甲酸型的堿樹脂吸附SA，以甲酸作為洗脫劑[16]。甲酸屬于危險化學品，腐蝕性大，會導致對SA 產品二次污染；且樹脂預處理步驟和后續再生過程比較復雜，造成SA的分離成本高。

本文采用一種實驗室自制的新型吸附樹脂RH-1來分離回收轉化液中的SA，僅用水就可實現高效洗脫，研究了SA 在樹脂上的吸附平衡和吸附動力學以及不同工藝條件下的柱動態吸附和解吸的過程。

1 材料和方法

1.1 實驗原料

唾液酸轉化液，由南京工業大學國家生化中心提供，以N-乙酰葡萄糖胺和過量的丙酮酸鈉為底物混合培養催化合成SA，最終轉化液中SA含量為20～35g/L。

轉化液的預處理：首先通過離心去除發酵液中的微生物細胞及其殘片等（4000r/min，20min），之后得到的上清液通過超濾進一步地去除雜蛋白和色素等雜質，即可得到包含目標產物SA的清液。

樹脂的預處理：吸附樹脂RH-1由南京工業大學國家生化中心提供，實驗前將樹脂先在無水乙醇中充分浸泡并不斷用玻璃棒攪拌，將樹脂中不溶于水的化合物充分洗出，浸泡完畢后用純水將樹脂上的乙醇沖凈以便備用。

1.2 SA檢測方法

SA分析方法由文獻[17]改進得到。使用安捷倫高效液相色譜法（安捷倫1260型示差檢測器），固定相為a Bio-Rad Aminex HPX-87H column（300mm×7.8mm）、流動相為10mmol/L H2SO4、流速為0.4 mL/min、柱溫為55℃、進樣量為20μL。

1.3 SA吸附等溫線實驗

經過預處理之后的樹脂，通過抽濾抽干水分，準確稱取4g濕樹脂放入50mL的錐形瓶中。接著加入20mL 的SA 溶液，緊接著使用封口膜將錐形瓶密封完好，將密封完好的錐形瓶放入恒溫搖床以120r/min 的速度振蕩10h，振蕩至溶液和樹脂充分平衡后，取上清液測定溶液中目標產物的濃度，計算交換容量。樹脂的靜態吸附容量見式(1)。

式中，qe為樹脂平衡吸附量，mg/g；c0為溶液初始濃度，g/L；ce為溶液達到吸附平衡時溶質的平衡濃度，g/L；m為樹脂的質量，g；V為溶液體積，mL。

1.4 SA吸附動力學實驗

把三口燒瓶置于恒溫水浴中攪拌預熱至所需溫度后，準確地稱取40g濕樹脂，將其放入三口燒瓶中，并且加入240mL的料液，以200r/min的攪拌速率進行攪拌。立即攪拌計時，間隔一定時間取溶液測定SA 濃度。以時間t為橫坐標，樹脂吸附的SA濃度為縱坐標作出SA的動力學曲線。

1.5 SA動態吸附實驗

將初始濃度c0的目標產物溶液，用蠕動泵以一定的進樣流量輸入裝滿樹脂的帶夾套的玻璃離子交換柱中，玻璃柱內部直徑2cm，長度27cm，夾套內通入用來保持恒溫環境的循環水。在柱的出口處用分布收集器定量收集樣品流出液，流出液每隔5min 收集一次，檢測其中的SA 濃度，直到流出液中SA 的濃度與進料液中的濃度相等，說明此時的樹脂吸附達飽和。以流出液的體積為橫坐標，SA流出液濃度與初始溶液濃度的比值c/c0為縱坐標作圖。考察溫度、流速、高徑比、進樣濃度對SA 動態吸附的影響，得到不同條件下的穿透曲線。

2 結果與討論

2.1 SA在樹脂上的靜態吸附結果

2.1.1 SA在樹脂上的吸附等溫線模型

考察了在不同溫度（10℃、30℃、50℃）下，SA 在RH-1 上的吸附行為，并用Henry 模型[18-19]進行擬合。

Henry吸附等溫線模型如式(2)所示。

式中，qe為樹脂達到吸附平衡時的平衡吸附量，mg/g；kL為Henry吸附等溫線Henry常數；ce為達到吸附平衡時溶液中的溶質的質量濃度，g/L。

2.1.2 溫度對SA吸附等溫線的影響

采用Henry 模型對SA 的吸附等溫線實驗得到的數據進行擬合，結果如圖1所示，擬合得到的結果列于表1中。由擬合得到的結果可以看出不同溫度下SA 在RH-1 樹脂上的吸附均滿足Henry 模型（R2=0.998），表現出了線性吸附行為。

表1 SA在RH-1樹脂上的吸附平衡參數

圖1 不同溫度下SA在RH-1樹脂上的吸附等溫線

由圖1 可知，SA 在RH-1 樹脂上的Henry 系數隨著溫度的升高而降低，這說明SA 在樹脂上的吸附過程是一個放熱的過程[20-21]，降低溫度有助于吸附，升高溫度有助于解吸。

2.2 樹脂吸附SA動力學

2.2.1 表面擴散模型

利用表面擴散模型[22]研究RH-1樹脂吸附SA的動力學，考察吸附時間t與樹脂吸附量之間的關系。表面擴散模型可以模擬RH-1 樹脂吸附SA 的動力學過程，也可以模擬SA 在樹脂RH-1 顆粒表面的擴散過程。通過表面擴散模型對不同初始濃度條件下SA吸附動力學曲線進行擬合。

表面擴散模型如式(3)所示。

式中，r為樹脂的半徑，m；t為吸附時間，s；De為有效擴散系數；Q為體積濃度，g/L。

當邊界和初始條件為0時：

當r=0時，= 0，Q=0，t=0

當Q=q時，r=rP，t=無窮大

式中，q為實際進樣濃度，g/L；rP為實際所用樹脂半徑，m。

平均絕對偏差D（%）如式(4)所示。

式中，cexp為實驗濃度；cpred為根據擬合模型的濃度預測值。當D值最小時，就表明該模型能很好地描述該動力學過程。

2.2.2 初始濃度對SA吸附動力學的影響

據初始條件溫度30℃，攪拌速率200r/min，分別選擇SA 初始濃度為10g/L、26.5g/L、60g/L 的實驗數據用表面擴散模型進行擬合，考察不同的初始濃度對其影響。以吸附時間t為橫坐標，樹脂吸附量為縱坐標，實驗與擬合結果如圖2所示，模型的參數與其相關聯的平均偏差列于表2中。

表2 不同操作條件下表面擴散模型參數

圖2 不同初始濃度條件下SA在RH-1樹脂上吸附動力學

由圖2可以看出，SA在10min左右在樹脂上達到吸附平衡，說明SA 在樹脂上的傳質速率較快。隨著SA 初始濃度的增加，樹脂對其吸附量也在增加。

由表2 可知，在同一溫度下，不同SA 的初始濃度，其De值一直保持穩定，表明物質的表面擴散能力并不隨著溶液初始濃度的改變而改變。平均絕對偏差較小，表明表面擴散模型能夠很好地擬合SA在RH-1樹脂上的動力學過程。

2.3 SA的動態吸附與解吸行為

2.3.1 不同溫度下SA在RH-1上的穿透曲線

考慮在不同的溫度下，SA在RH-1樹脂上的穿透曲線，結果如圖3所示。由圖3可知，隨著溫度的升高，SA 的穿透曲線提前[23]，其原因是該吸附過程為放熱過程，溫度升高使得SA 在樹脂上的吸附量下降，從而導致了SA 穿透曲線的提前，這與測定的吸附等溫線結果一致。由此可見，高溫更有利于SA在樹脂上的洗脫。隨著溫度的升高，SA在樹脂上的傳質速率增大，能更快地達到吸附平衡。

圖3 溫度對SA在RH-1樹脂上穿透曲線的影響

2.3.2 不同初始濃度下SA在RH-1上的穿透曲線

分別測定不同初始質量濃度（10g/L、30g/L 和50g/L）條件下SA 在RH-1 樹脂柱上的穿透曲線，結果如圖4所示。由圖4可知，不同初始濃度的SA在達到吸附平衡時所用時間相同，隨著SA 初始濃度提高，穿透時間不變。實驗結果顯示樹脂吸附容量隨著SA濃度的提升而增大。

圖4 初始濃度對SA在RH-1樹脂上穿透曲線的影響

2.3.3 不同流速下SA在RH-1上的穿透曲線

考察在不同流速（1mL/min、1.5mL/min 和2mL/min）條件下SA在樹脂柱上的穿透曲線，其結果如圖5所示，由圖5可知，在溫度和進樣濃度相同的條件下，流量對穿透曲線的影響是隨著流速的增加，SA 穿透時間提前。由于吸附量是由其吸附等溫線決定，所以流速對SA 在樹脂上的吸附量沒有影響[24]。隨著流速的增大，唾液酸來不及在樹脂上達到吸附平衡，就開始流出，因此穿透時間提前。在較低的流速下，有利于唾液酸在RH-1樹脂上的吸附。但在較低的流速下，分離所需的時間也相應較長。因此將傳質效率與生產效率結合在一起考慮，流速選擇在1mL/min時較為合適。

圖5 流速對SA在RH-1樹脂上穿透曲線的影響

2.3.4 不同高徑比下SA在RH-1上的穿透曲線

隨著樹脂柱的高徑比增加，代表其理論塔板數增加，如果分離多組分物質，每個組分之間的分離度也會隨其增加；但是增加高徑比也會導致物質分離時間增加，柱壓增大，導致耗能增加，降低生產效率。因此在不同高徑比（6.5∶1、10∶1和13.5∶1）的條件下考察了SA在RH-1樹脂柱中的穿透曲線，結果如圖6。

圖6 高徑比對SA在RH-1樹脂上穿透曲線的影響

由圖6 可知，SA 的穿透時間隨著高徑比的增加而延長，吸附平衡時間增加，導致所需SA 進樣量增加。為實現多組分的高效分離，因此可以選擇較大的高徑比。

2.3.5 SA在RH-1樹脂上的動態吸附-解吸曲線

圖7 是在溫度30℃、流速為1mL/min、進樣的質量濃度為35g/L、進樣量為0.1BV（1BV=11.2mL）、高徑比為13.5∶1的條件下SA在樹脂上的吸附-洗脫曲線。由圖7可知，采用水為洗脫劑，可以很快地把吸附在樹脂上的SA給洗脫下來，最終經計算SA收率達到了99.8%。

圖7 SA在RH-1樹脂中的動態吸附-脫附曲線

3 結論

選用了一種實驗室自制的吸附樹脂RH-1用于SA的吸附分離，結論如下。

（1）靜態吸附實驗說明，Henry 模型能夠很好地擬合SA 的吸附等溫線，隨著溫度升高，樹脂對SA 的吸附量減小；動力學實驗說明，SA 在RH-1樹脂上的吸附動力學曲線符合表面擴散模型，且SA在樹脂上的吸附速率較快，10min內即可達到吸附平衡。

（2）研究了溫度、進樣料液濃度、上樣流速、高徑比對樹脂RH-1 吸附SA 的穿透曲線的影響，獲得了較佳動態吸附工藝條件：溫度30℃，流速1mL/min，料液濃度35g/L，高徑比13.5∶1。經純水洗脫后，SA收率為99.8%。