焦化污染場地中萘降解菌的分離及降解特性

楊靜，李博，李文軍，劉曉娜，湯劉元，劉月，錢天偉

（1 太原理工大學環(huán)境科學與工程學院，山西 太原 030024；2 山西交控生態(tài)環(huán)境股份有限公司，山西 太原 030006）

多環(huán)芳烴（polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs）是由兩個或兩個以上的苯環(huán)組成的一類持久性環(huán)境污染物，主要來自于化石燃料的加工和燃燒（如煉焦、燃煤）以及生物質(zhì)和有機物的不完全燃燒[1]。PAHs 疏水性強、毒性大、難降解及易致癌[2]，被很多國家列為優(yōu)先控制的對象。PAHs可在環(huán)境中四處擴散，最初以氣態(tài)形式存在于空氣中，經(jīng)過沉降作用最終進入土壤或水體中[3]。吸附在土壤顆粒中的PAHs可經(jīng)農(nóng)作物富集進入食物鏈，對人類健康構成了巨大的威脅[4]。此外，土壤中的PAHs 還可再次進入大氣和水體，造成二次污染。PAHs 污染的一個重要來源是焦化工業(yè)[5]，近年來，隨著我國產(chǎn)業(yè)結構的變動，大量焦化工業(yè)搬遷帶來的場地殘留污染問題日益突出[6]。因此，對焦化污染土壤中的PAHs進行治理尤為重要。

土壤PAHs 污染的修復方法主要有物理修復（如熱解吸、溶劑萃取等）、化學修復（如光催化、高級氧化等）和生物修復（如微生物修復、植物修復等）[7]，但傳統(tǒng)的物化方法具有成本高、污染物去除不徹底且易造成二次污染等弊端[8]。近年來，生物修復尤其是微生物修復因其具有成本低、無二次污染并且可原位修復等優(yōu)點逐漸成為降解PAHs 污染的重要手段[9]。通過微生物的生長代謝，把PAHs 同化成自身機體的組成部分或者異化成CO2和H2O，最終實現(xiàn)對PAHs 的降解。在降解過程中，功能菌群的篩選是微生物降解PAHs 的關鍵所在。眾多研究人員分離篩選了PAHs 可降解菌，如假單胞菌屬（Pseudomonas）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、諾卡氏菌屬（Nocardia）、鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）、分枝桿菌屬（Mycobacterium）和產(chǎn)堿桿菌屬（Alcaligenes）等細菌[10-15]，并進一步研究了其對PAHs 的降解特性。黃海英等[16]報道了使用假單胞菌菌株在48h 內(nèi)，對800mg/L 萘的最大降解率為77%；Lyu 等[17]分離出來的降解菌株Novophingobium pentaromativoransUS6.1 能夠降解菲、芘、苯并芘，且菌株對菲的降解在24h 可達86.62%；王巖[18]從近海的沉積物中分離得到可以高效降解菲、蒽、芘的菌群，降解率可達到91.7%。大量研究表明，從不同污染水體、土壤中分離篩選到的降解菌株有各自不同的特點。環(huán)境中污染物的降解與降解微生物的生態(tài)位情況密切相關，從污染區(qū)域中分離出的微生物更能有效利用相應的污染物，對污染物的轉化效率明顯高于其他來源的微生物[19]。

本研究基于對焦化污染場地中PAHs 污染的原位微生物修復需求，從該焦化污染場地中分離出一株高效萘降解菌株AO-4，并對其進行了鑒定，研究了菌株AO-4對萘的降解性能，評估了環(huán)境條件（溫度、pH、萘初始濃度和菌量）對菌株降解萘的影響，探討了降解機理，進一步考察了菌株對其他PAHs 芴、菲、蒽、芘在單一和混合體系中的降解能力，以期為焦化污染場地中PAHs的生物修復和治理提供理論依據(jù)和技術支撐。

1 材料和方法

1.1 實驗材料及儀器

1.1.1 土壤樣品的采集

供試土壤采集于山西省某煤焦化工污染場地，隨機采集多個取樣點的表層（0～10cm）土壤，將采集到的土壤樣品用2mm 土壤篩進行篩分，剔除雜質(zhì)。充分混勻后，于4℃冰箱中保存。

1.1.2 化學試劑

本研究所使用的主要藥品：萘、芴、菲等PAHs（純度大于97%，美國Aladdin公司）；甲醇、乙酸乙酯等有機試劑（色譜純，美國Fisher Chemical 公司）；蛋白胨等非有機試劑（分析純，上海生工生物工程公司化學試劑）。

1.1.3 實驗儀器

BCV-1FD 超凈工作臺（上海一恒科學儀器有限公司）、LRH生化培養(yǎng)箱（上海一恒科技有限公司）、Agilent 1260型高效液相色譜儀（安捷倫科技（中國）有限公司）、THZ-C恒溫振蕩培養(yǎng)箱（蘇州培英實驗設備有限公司）、LS-50H立式壓力蒸汽滅菌鍋（江陰濱江醫(yī)療設備有限公司）、UV8000S 紫外分光光度計（上海元析儀器有限公司）、KH20R高速冷凍離心機（湖南凱達科學儀器有限公司）、Nikon YS100生物顯微鏡[奧林巴斯（中國）有限公司]、SC850 全自動凝膠成像系統(tǒng)（上海山富科學儀器有限公司）、veriti96 PCR儀（賽默飛世爾科技有限公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 試劑配置

實驗用培養(yǎng)基包括LB培養(yǎng)基和MSM無機鹽培養(yǎng)基，配方如下。

LB 養(yǎng)基：蛋白胨10.00g/L，酵母膏10.00g/L，NaCl 5.00g/L，pH=7.2。

MSM 無機鹽培養(yǎng)基：K2HPO4·3H2O 4.25g/L，NaH2PO4·H2O 1.00g/L，NH4Cl 2.00g/L，MgSO4·7H2O 0.20g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.012g/L，MnSO4·H2O 0.003g/L，ZnSO4·7H2O 0.003g/L，CoSO4·7H2O 0.001g/L，pH=7.0～7.2。

配置時按以上濃度稱量，用蒸餾水定容至1000mL，固體培養(yǎng)基配方在此基礎上加15g/L 瓊脂，在121℃、0.103MPa條件下滅菌20min。

PAHs 的配置：用丙酮作為溶劑配制萘（濃度為100g/L）、芴、菲、蒽、芘（濃度分別為5g/L）的溶液，通過無菌有機濾頭（孔徑0.22μm）過濾除菌，按所需濃度添加到降解體系中后，待丙酮揮發(fā)完畢使用。

1.2.2 萘降解菌的篩選

取10g 污染土壤加入到90mL 無菌水中，于溫度30℃、轉速130r/min 條件下浸取5h，靜置30min后，取5mL 上清液加入到45mL 以萘（100mg/L）為唯一碳源的萘選擇性液體MSM 培養(yǎng)基中，在30℃、130r/min 的恒溫振蕩培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)7d，然后再次轉接到新鮮的萘（150mg/L）選擇性液體培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，如此重復。經(jīng)7個周期馴化培養(yǎng)，逐步將萘的濃度提升至400mg/L后，取適量富集培養(yǎng)液，梯度稀釋后涂布在含萘（400mg/L）的選擇性固體培養(yǎng)基平板上，置于30℃生化培養(yǎng)箱中；待菌落長出后，挑取菌落大小及形態(tài)顯著的單個菌落在含萘選擇性固體培養(yǎng)基上進一步純化，直至得到形態(tài)單一的純菌種。

1.2.3 萘降解菌的鑒定

1.2.3.1 革蘭氏染色鑒定

取少量活化后的菌液，滴加在干凈的載玻片上干燥固定后，滴加草酸銨結晶紫染色液染色2min，立即傾去染料，用細流蒸餾水沖洗直到流水為無色。再在涂菌區(qū)域滴加適量的革蘭氏碘液，作用1min 后傾去多余的碘液，最后用水流沖至流出液為無色。用吸水紙吸去載玻片上多余的水分，滴加體積分數(shù)為95%乙醇脫色30s 左右至流出液為無色，接著用蒸餾水沖去乙醇后吸干，番紅復染3min，水洗并使之干燥。在顯微鏡下用100倍油鏡觀察經(jīng)染色的菌落顏色。

1.2.3.2 16S rDNA擴增及測序鑒定

將純化的單菌落接種到LB 液體培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng)，取新鮮菌液用細菌基因組提取試劑盒（天根生化科技有限公司）提取基因組DNA。用通用引物27F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’) 和1492R(5’-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’)擴增其16S rDNA 基因序列。PCR 體系為：Super Mix 20μL、ddH2O 12μL、通用引物27F(10μmol/L) 1μL、通用引物1492R(10μmol/L) 1μL、模板DNA 6μL。擴增條件為：94℃、30s，55℃、30s，72℃、90s，35個循環(huán)。將PCR擴增得到的產(chǎn)物送至北京六合華大基因科技有限公司測序，測序結果在NCBI 的Genbank 數(shù)據(jù)庫進行序列同源性比對，用MEGA 7.0 進行同源性分析，依據(jù)鄰接法（neighbor joining）構建系統(tǒng)發(fā)育樹，確定萘降解菌AO-4 的種屬。

1.2.4 萘降解途徑中的部分關鍵酶基因的PCR擴增

選取萘降解途徑中的關鍵酶萘雙加氧酶的鐵硫蛋白大亞基基因nahAC[20]、水楊醛脫氫酶基因nahF[21]、水楊酸羥化酶基因nahG[22]及鄰苯二酚2,3-雙加氧酶基因nahH[23]進行PCR 擴增與鑒定。引物序列如下。

1.2.5 萘降解菌對PAHs（萘、芴、菲、蒽、芘）的降解體系

將處于對數(shù)生長期的AO-4菌液（OD600=1）按一定體積接種至含特定濃度的萘、芴、菲、蒽、芘MSM培養(yǎng)基中，于溫度30℃、轉速130r/min條件下?lián)u床避光培養(yǎng)，定時取樣，按需測定菌體濃度OD600、培養(yǎng)液中PAHs含量及菌體脫氫酶活性，實驗設置三組平行試樣，并設置無菌組作為空白對照。

1.2.6 環(huán)境單因素對萘降解的影響

本研究以降解率作為考察指標，研究環(huán)境因素包括溫度、pH、萘初始濃度和菌種接種量對萘降解的影響，培養(yǎng)條件均在30℃、130r/min的搖床避光培養(yǎng)。

設置體系的不同溫度分別為10℃、20℃、30℃、40℃，將處于對數(shù)生長期的菌液按2%（體積分數(shù)）的接種量接種至含有20mg/L 萘的無機鹽培養(yǎng)基（pH=7.0）中，定時取樣測定不同溫度下菌株AO-4對萘的降解率。

調(diào)整體系的初始pH分別為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，將處于對數(shù)生長期的菌液按2%（體積分數(shù)）的接種量接種至含有20mg/L 萘的無機鹽培養(yǎng)基中，定時取樣測定不同初始pH 下菌株AO-4對萘的降解率。

選取小于萘在水中溶解度的濃度（1mg/L、5mg/L、10mg/L、20mg/L），將處于對數(shù)生長期的菌液按2%（體積分數(shù)）接種量接種至含有以上濃度的萘的無機鹽培養(yǎng)基（pH=7.0）中，定時取樣測定菌株AO-4對不同濃度的萘的降解率。

將處于對數(shù)生長期的菌液分別按0、1%、2%、5%的接種量（體積分數(shù)）接種至含有20mg/L萘的無機鹽培養(yǎng)基（pH=7.0）中，定時取樣測定不同接種量下菌株AO-4對萘的降解率。

1.2.7 PAHs濃度的測定及降解率計算

試樣用等體積的乙酸乙酯萃取，在振蕩器上通過1500r/min 轉速振蕩5min 后超聲萃取10min，再經(jīng)10000r/min 轉速離心5min 后可分離有機相和水相，用0.22μm 孔徑的有機濾膜過濾乙酸乙酯萃取液后，利用高效液相色譜儀（HPLC）測定各PAHs的濃度，HPLC 測試條件：ZORBAX Eclipse PAHs色譜柱，紫外檢測器，柱溫30℃，流動相為甲醇和水，流速1mL/min，進樣量20μL，檢測波長220nm。

降解率η的計算依據(jù)式(1)。

式中，C0為PAHs 的初始濃度，mg/L；Ct為反應t時間后PAHs的濃度，mg/L。

1.2.8 脫氫酶活性的測定

通過測定微生物的脫氫酶活性可以了解微生物對有機污染物的氧化分解能力，按照文獻[24]方法：在具塞試管中，加入降解后的培養(yǎng)液、Tris-HCl 緩沖溶液（pH=8.5、0.05mol/L）、葡萄糖溶液（0.10mol/L）、TTC（質(zhì)量分數(shù)為0.5%）各2mL，置于30℃恒溫培養(yǎng)箱中避光反應。反應4h后，加入400μL濃硫酸中止反應，并加入5mL 甲苯，1500r/min振蕩10min 進行萃取。待反應生成的紅色三苯基甲臜（TF）被完全萃取到有機相時，將有機相在4000r/min 下離心5min，過濾后測定濾液于486nm處的吸光度（OD486），以此表征萘降解菌的脫氫酶活性。

2 結果與討論

2.1 萘降解菌的篩選及鑒定

通過增加環(huán)境選擇的壓力，逐步提高萘的濃度對菌種進行馴化、篩選，分離到一株萘的高效降解菌株AO-4。菌株在萘選擇性培養(yǎng)基中的生長良好，驗證了其以萘作為唯一碳源生長的能力，表明其可用于含萘污染物的生物修復。

AO-4菌株在含萘的MSM固體培養(yǎng)基上菌落呈乳白色，扁平狀，邊緣不整齊，大小不一，平均直徑約為2.0～3.0mm[圖1(a)]。顯微鏡下可見菌體為桿菌，長約1.5～3.0μm，寬約0.5～0.8μm，革蘭氏染色后呈紅色，為革蘭氏陰性細菌[圖1(b)]。桿狀細菌在污染物的微生物降解中非常常見[25-27]，因為在富集培養(yǎng)過程中，桿菌比球菌能更好地適應環(huán)境，可高效利用一些致密顆粒（如PAHs），比球菌分裂更快而成為優(yōu)勢菌群[28]。

圖1 菌株AO-4的菌落形態(tài)(a)及革蘭氏染色后細胞形態(tài)(b)

通過16S rDNA 測序及Genbank 數(shù)據(jù)庫序列比對，發(fā)現(xiàn)菌株AO-4與銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）的同源性最高，序列相似度達到99.9%。采用鄰域連接法構建了系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2），顯示菌株AO-4 與多株銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）具有高度同源性。已有眾多研究證明，銅綠假單胞菌對多種PAHs 具有較強的降解能力[29-30]，如Patowary 等[31]發(fā)現(xiàn)銅綠假單胞菌在35℃和pH=7條件下，對0.3%的萘降解率可達89.2%。

圖2 基于菌株AO-4的16S rDNA基因片段序列構建的系統(tǒng)發(fā)育樹

綜上，依據(jù)菌株AO-4 的形態(tài)特征以及分子生物學鑒定結果，將菌株AO-4 鑒定為銅綠假單胞菌，此菌株16S rDNA 序列已提交到國家微生物科學數(shù)據(jù)中心（DOI：http://dx.doi.org/10.12210/sequence.NMDCN00011F3）。

2.2 萘降解途徑關鍵酶的基因檢測

假單胞菌對萘的降解通常是通過水楊酸途徑完成的[32]。萘經(jīng)萘雙加氧酶催化開環(huán)形成順-萘雙氫二醇后，在脫氫酶的催化下形成1,2-二羥基萘，再經(jīng)過一系列反應生成水楊醛，隨后經(jīng)水楊醛脫氫酶作用形成水楊酸，水楊酸在水楊酸羥化酶催化下形成鄰苯二酚，通過鄰苯二酚2,3-雙加氧酶開環(huán)后被轉化為乙醛和丙酮酸進入三羧酸循環(huán)，最終被降解為H2O和CO2[33]。

選取了萘經(jīng)水楊酸代謝途徑降解的關鍵酶基因：萘雙加氧酶的鐵硫蛋白大亞基（nahAC）、水楊醛脫氫酶（nahF）、水楊酸羥化酶（nahG）和鄰苯二酚2,3-雙加氧酶（nahH）分析菌株對萘可能的降解途徑。以菌株AO-4染色體為模板進行上述四種基因的特異性擴增，凝膠電泳圖（圖3）上可見nahAC和nahH在750～1000bp 位置均出現(xiàn)明顯條帶，與文獻中假單胞菌的nahAC[20]（1009bp）、nahH[23]（923bp）基因大小基本一致，可基本判斷AO-4 的基因組中含有nahAC、nahH兩個基因。在AO-4 的基因組中未檢測到基因nahF和nahG，一方面這可能是由于該菌株對污染物萘的降解有別于已知的降解途徑；另一方面有研究表明[34]，PAHs的部分降解基因位于菌株的質(zhì)粒上，此處未對菌株的質(zhì)粒DNA進行擴增，這可能是nahF和nahG這兩個基因未被檢出的原因。

圖3 萘降解途徑中的部分關鍵酶基因nahG、nahF、nahAC和nahH的PCR擴增結果

先前研究表明所有的萘降解菌都含有nahAC基因[35]，通過對萘降解途徑中的關鍵酶基因（nahAC、nahH、nahF和nahG等）進行檢測，可以初步篩選萘降解菌株、判斷菌株的萘降解途徑[32]，但對降解途徑的進一步探究還需對中間產(chǎn)物進行檢測。

2.3 菌株AO-4對萘的降解性能

研究考察了菌株AO-4在液體中對萘的降解能力，萘濃度為菌株馴化的最高濃度400mg/L，體系的pH為7.0，接種菌量為2%（體積分數(shù)）。在降解過程中監(jiān)測了菌株AO-4的生長曲線、萘的降解率和菌體脫氫酶活性隨時間的變化，結果如圖4所示。

圖4 菌株AO-4對萘的降解特性

從菌株生長曲線[圖4(a)]可以發(fā)現(xiàn)，菌體濃度隨時間變化逐漸增大，在24h OD600達到0.325 后增長速度減緩，菌株生長經(jīng)歷了適應期、對數(shù)期后將進入穩(wěn)定期。菌株AO-4在以萘為唯一碳源的無機鹽培養(yǎng)液的生長再次驗證了菌株AO-4 代謝萘的能力。

菌株AO-4對萘的降解率[圖4(b)]在反應開始的8h內(nèi)略有增長，在8～24h之間400mg/L的萘近乎被完全降解，24h 時萘的降解率達到97.67%，48h 降解完全。這與菌株生長曲線變化趨勢相近，8～24h期間，菌株迅速生長，降解率快速攀升；24h后菌株處于穩(wěn)定期，代謝過程緩慢。高秀榮等[36]在研究玫瑰色紅球菌對芘降解特性時，也有類似現(xiàn)象，菌株在8d 降解率達到47%后，8～16d 時菌株處于穩(wěn)定期或衰亡期，降解率無明顯變化。

脫氫酶活性[圖4(c)]在前8h 升高比較緩慢，8～24h 迅速升高，在24h 后仍有緩慢增長的趨勢。PAHs 的降解是基于PAHs 的氧化，降解過程中脫氫酶可以使PAHs的氫原子活化并轉移至特定的受氫體，使PAHs 被氧化[37]。脫氫酶活性可在一定程度上反應微生物對有機污染物的氧化降解能力。以上結果表明菌株AO-4 可有效利用400mg/L 萘作為碳源生長，菌體的脫氫酶活性，菌株生長情況與萘的降解率表現(xiàn)出正相關。

2.4 菌株AO-4降解萘的影響因素

污染物的微生物降解是基于菌體生長代謝的活性來消耗利用底物，與菌體的生長情況密切相關。此實驗探討了菌株培養(yǎng)條件：溫度、pH、萘的初始濃度和接種量對萘降解效果的影響。

2.4.1 溫度對菌株AO-4降解萘的影響

溫度是影響微生物體內(nèi)物質(zhì)代謝過程的一個重要環(huán)境因素。溫度可以通過影響微生物酶的活性來調(diào)節(jié)體內(nèi)酶促反應的速率，溫度還會影響底物的生物利用性能。在適宜的溫度范圍內(nèi)，生物體的代謝速率較快，可迅速地降解外源物質(zhì)。溫度單因素對AO-4降解萘的影響如圖5所示，菌株AO-4對萘的降解隨溫度升高而加快。反應開始的10h 時內(nèi)，10℃條件下菌株AO-4 對萘的降解率僅為19.01%，隨著溫度升高降解率在30℃達到最高為97.89%；在溫度達到40℃時略有降低，降解率為93.92%。這可能由于在一定溫度范圍內(nèi)，微生物的酶活性隨著溫度的升高而增大，加速了萘的降解。菌株最適降解溫度為30℃，而40℃超過了菌株的最適生長溫度導致降解略有減緩之勢。反應24h 后，10～40℃條件下萘近乎完全被降解，說明菌株AO-4可以較好的適應10～40℃的溫度，能有效降解萘污染物。在實際污染場地土壤生物修復應用中可適應冬夏季的溫度差異，具有較好的應用價值。

圖5 菌株AO-4在不同溫度條件下對萘降解的影響

2.4.2 pH對菌株AO-4降解萘的影響

微生物在一定pH 范圍內(nèi)可以正常生長代謝消耗底物。為使體系中的萘更好地被菌株降解，選取了5個pH，研究了pH對該菌降解萘的影響。實驗選取了低于萘溶解度（34mg/L）的20mg/L 的萘濃度進行影響因素的測試。圖6(a)為培養(yǎng)24h時AO-4對萘的降解結果，可以看出，在pH在4.0～9.0的范圍內(nèi)，菌株AO-4對萘均有不同程度的降解，該菌株對pH 環(huán)境具有良好的適應性。培養(yǎng)24h時，pH為5.0～7.0 的降解率可達到98%以上，pH 在4.0 和9.0 的降解率相對較低，分別為74.78%、73.63%。菌株AO-4在pH為5.0到7.0范圍內(nèi)降解效果較好，過高或過低的pH 會導致降解率下降。這可能是因為在酸性或堿性條件下細胞膜上的電荷發(fā)生變化，會影響菌株對底物的吸收轉化，導致微生物生長代謝速度減慢，同時pH會影響微生物酶的空間構象，使酶變性失活，影響菌體代謝[38]。有研究表明[39]施氏假單胞菌YC-YH1在中性pH范圍對萘的降解率接近100%，而在pH5.0和9.0時的降解率僅為20%左右。在pH 為5.0～7.0 范圍內(nèi)，由圖6(b)可以看出，萘的降解率均隨反應時間延長逐漸提升，在24h時對萘的降解近乎完全。

圖6 菌株AO-4在不同pH條件下對萘降解的影響

2.4.3 萘初始濃度對菌株AO-4降解萘的影響

在以萘為唯一碳源的培養(yǎng)基中，萘的濃度會影響菌體的生長，進而影響其生物降解效果[40]。萘濃度過低會因碳源不足延緩菌體的生長，而萘作為一種含有苯環(huán)的有機化合物，濃度過高會對菌體產(chǎn)生毒害作用[41]。在溫度為30℃，菌量投加量為2%，pH=7.0的條件下，研究了菌AO-4對不同萘濃度的降解效果，以明確污染物初始濃度對菌株AO-4降解萘的影響。為了排除萘溶解過程的干擾因素，實驗選取了低于萘溶解度（31mg/L）的濃度1mg/L、5mg/L、10mg/L、20mg/L 進行實驗。結果如圖7 所示，在5mg/L、10mg/L、20mg/L萘濃度下，萘的降解率隨時間變化在8h內(nèi)迅速增長后逐漸趨于平穩(wěn)。67h時萘濃度為1mg/L、5mg/L、10mg/L和20mg/L的降解率分別為57.01%、83.76%、84.75%和96.77%。由此可見，在該體系中萘作為菌株生長的唯一碳源，1mg/L的萘濃度會延緩菌體的生長，因菌體生物量不足而使降解率偏低。而萘濃度的升高可促進萘向細胞內(nèi)的擴散，提高其生物利用度，有助于萘的轉化降解。

圖7 菌株AO-4對不同初始萘濃度的降解

2.4.4 接種量對菌株AO-4降解萘的影響

降解菌的生物量是影響微生物對污染物降解的重要因素，較高的生物量可使得更多的降解菌參與污染物的降解，加快降解進程[42]。本文研究了菌株接種量為0、1%、2%、5%（體積分數(shù)）對萘降解的影響。如圖8(a)所示，在沒有接種菌的情況下，萘的降解率在1h達到34.49%后基本保持平穩(wěn)，這可能是由于萘的自然降解及揮發(fā)所導致，萘會按照一定比例向自由相擴散，而所測定的萘均為溶解態(tài)的萘。在培養(yǎng)0.5h內(nèi)，接種菌量未對萘的降解造成明顯影響。因為培養(yǎng)時間較短，菌體尚未進入生長對數(shù)期。反應1h 后，菌量因素對萘降解產(chǎn)生明顯影響。隨著接種量的增大，萘的降解率逐漸提高。培養(yǎng)3h 時，接種量為1%、2%、5%菌株對萘的降解率分別為46.02%、50.31%、54.5%。如圖8(b)所示，在12h 內(nèi)，接種量為1%、2%和5%的降解率依次為56.37%和64.90%和73.66%。24h 后，各組細菌降解率均達到96%以上，基本完成了對萘的降解。由此可見，在該體系中，加大降解菌接種量會在短期內(nèi)（12h）加速對萘的降解，經(jīng)過一定時間當菌體繁殖達到一定菌量后，接種量對污染物降解的影響不明顯。因為按照微生物正常生長曲線，菌體經(jīng)過對數(shù)期的迅速繁殖后將進入平穩(wěn)期，菌體受限于環(huán)境及培養(yǎng)基不會無限繁殖，菌量將保持平穩(wěn)。

圖8 菌株AO-4在不同接種量條件下對萘降解的影響

2.5 菌株AO-4對PAHs降解的廣譜性

2.5.1 菌株AO-4對單一PAHs的降解

實際污染場地通常涉及多種PAHs 的污染，為探討菌株降解的廣譜性，進一步測試了該降解菌AO-4對其他4種常見PAHs芴、菲、蒽和芘各自的降解能力。實驗中5種污染物萘、芴、菲、蒽和芘的初始濃度各為50mg/L（各體系污染物濃度為50mg/L），體系pH 為7.0，菌量為5%（OD600=1）。菌株AO-4 對不同PAHs 的降解率見圖9，菌株對5 種污染物有不同程度的降解。萘的降解率在24h達到99.85%，菲、芴、芘和蒽的降解率分別為23.94%、18.16%、7.44%和2.47%，反應至5d 時，萘、菲、芴、芘和蒽降解率分別達到100%、33.13%、24.70%、14.84%和7.30%，表明該菌可不同程度降解萘、菲、芴、芘和蒽。PAHs 的生物降解與污染物的結構密切相關，萘含有2個苯環(huán)，芴和菲同屬于3環(huán)的PAHs，但芴的兩個苯環(huán)中間含一個5環(huán)的稠環(huán)芳烴[43]，難于降解，所以對萘的降解率高于菲，對芴的較低。高闖等[44]研究也發(fā)現(xiàn)銅綠假單胞菌對菲的降解率高于芴，84h后對50mg/L的芴、菲的降解率分別為23.47%、34.83%。隨著苯環(huán)數(shù)量的增加，PAHs 的降解難度增大[45]。芘為4 環(huán)的PAHs，比3 環(huán)的PAHs 難降解。Zhang 等[46]研究了銅綠假單胞菌DQ8對PAHs 的降解特性，發(fā)現(xiàn)DQ8可有效降解3 環(huán)和4 環(huán)的PAHs，且4 環(huán)PAHs 比3 環(huán)PAHs 更難降解；且在四種PAHs（芴、菲、蒽、芘）混合體系中，菲和芴可在7d 內(nèi)被完全降解，但蒽和芘在12d 之內(nèi)分別只被降解了40.50%和34.50%。菌株AO-4對蒽的降解率較小，可能是因為蒽在水中的溶解度較小，導致其生物利用度較低。

圖9 菌株AO-4對單一體系PAHs（萘、菲、芴、芘和蒽）的降解

2.5.2 菌株AO-4對混合PAHs的降解

環(huán)境介質(zhì)中的PAHs 多以混合形式存在，考察菌株對混合PAHs 的降解效果具有重要的現(xiàn)實意義。菌株AO-4 對混合PAHs 的降解效果如圖10 所示。5種污染物萘、芴、菲、蒽和芘的初始濃度均為50mg/L（總體系污染物濃度為250mg/L），體系pH為7.0，菌量為5%（OD600=1）。由圖可知，菌株對混合的5種污染物有不同程度的降解。萘的降解率在1d達到99.54%后保持平穩(wěn)，芴、菲、蒽和芘的降解率分別為8.79%、5.14%、1.55%和0.06%；發(fā)現(xiàn)菌株AO-4優(yōu)先以萘為碳源，萘的降解主要發(fā)生在1d 內(nèi)，而其他PAHs 的降解率隨著PAHs 環(huán)數(shù)的增加而下降，說明菌株AO-4 優(yōu)先以低環(huán)PAHs為碳源。張娟琴等[47]研究菌株B5 降解混合PAHs（萘、蒽、芘）時也發(fā)現(xiàn)類似現(xiàn)象，萘在混合體系中72h降解率可達99.13%，而對蒽和芘的降解率分別為87.25%、75.07%。反應至5d時，芴、菲、蒽和芘降解率分別為20.95%、18.28%、4.75%和4.44%，均低于單一體系。這可能是因為PAHs種類和濃度的增加顯著抑制了降解菌的活性。高秀榮等[36]也有類似發(fā)現(xiàn)，菌株Q3 對單一底物菲、芘和苯并[a]芘降解率可達到98%、47%和65%；而對混合PAHs中的菲、芘和苯并[a]芘降解率僅為57%、29%和33%。盧曉霞等[48]研究了單一菌株在16 種PAHs 混合物初始總量分別為17μg/mL 和166μg/mL 時的生長情況，發(fā)現(xiàn)菌株在低濃度的PAHs 中生長良好，能降解低環(huán)PAHs，而在高濃度的PAHs 中菌株的生長和活性受到了抑制。經(jīng)過5d 的降解，混合體系菌株AO-4 對5 種PAHs 降解能力大小順序為萘>芴>菲>蒽>芘，這可能與PAHs 在水中的溶解度相關，水溶性越好的PAHs更易被生物利用。萘為2環(huán)PAHs，芴為3環(huán)，25℃其在水中的溶解度分別為31mg/L、1.69mg/L。菲與蒽均為3 環(huán)PAHs，且為同分異構體，但蒽為線性分子，菲是角性分子，一般來說角性分子比線性分子在水中的溶解度大，25℃時菲和蒽在水中的溶解度分別為1.15mg/L 和0.04mg/L[49]，導致在混合體系中菲比蒽更容易被利用。芘為4 環(huán)PAHs，隨著環(huán)數(shù)的增加，其疏水性和毒性比其他四種PAHs 更大。Sharma 等[50]也發(fā)現(xiàn)混合菌株在7d 對芴、菲、蒽和芘的降解率分別為75%、67.8%、52.2%和39.2%，隨著環(huán)數(shù)的增加，降解率也在降低。

圖10 菌株AO-4對混合體系PAHs（萘、芴、菲、蒽和芘）的降解

3 結論

（1）從焦化污染土壤中分離篩選得到1株萘高效降解菌AO-4，通過形態(tài)結合16S rDNA序列，將其鑒定為銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）。

（2）在菌株AO-4的染色體中可檢測到萘代謝途徑（水楊酸代謝途徑）中的關鍵酶基因，萘雙加氧酶基因（nahAC）和兒茶酚2,3-雙加氧酶基因（nahH）。推測AO-4對萘的降解是以水楊酸途徑進行降解的，進一步的判斷需要對其中間產(chǎn)物進行檢測。

（3）菌株AO-4 對400mg/L 萘的降解率在24h可達97.67%，降解過程中菌株的生長、脫氫酶活性與萘的降解率表現(xiàn)為正相關。

（4）菌株AO-4可降解從1～400mg/L濃度的萘，降解率受萘初始濃度、溫度、pH 和菌量的影響，最適降解溫度為30℃、pH 為5.0～7.0；在一定范圍內(nèi)，菌株降解能力隨著菌量（體積分數(shù)1%～5%）和初始濃度（1～20mg/L）的增大而增強。

（5）菌株AO-4 對PAHs 的降解具有廣譜性，可有效降解萘、菲、芴、芘和蒽。在單一體系中，對萘、菲、芴、芘和蒽5d 的降解率分別為100%、33.13%、24.70%、14.84%和7.30%；混合體系中，對萘、芴、菲、蒽和芘5d 的降解率分別為100%、20.95%、18.28%、4.75%和4.44%。

致謝：感謝山西靖田會澤環(huán)境科技有限公司為本研究提供了部分資金支持！