鰱嗜麥芽窄食單胞菌分離及藥敏試驗

林松泉

（廈門惠盈動物科技有限公司，福建 廈門 361023）

鰱（Hypophthalmichthys molitrix），屬鯉形目，鯉科，鰱亞科，鰱屬，俗稱鰱子、白鰱、邊魚。鰱廣泛分布于亞洲東部，在我國各大水系，隨處可見，是著名的四大家魚之一。鰱是典型的濾食性魚類，在魚苗階段，主要攝食浮游動物，體長＞1.5 cm 時，逐漸轉(zhuǎn)為吃浮游植物，亦吃豆?jié){、豆渣粉、麩皮和米糠等，更喜吃人工微顆粒配合飼料，為我國主要的淡水養(yǎng)殖魚類之一。

2021 年6 月，福建佛曇某淡水魚類養(yǎng)殖場中，突發(fā)鰱大面積死亡，多次用藥，但效果不佳。死亡鰱體表出血，尤其在體表兩側(cè)、頭部、鰓蓋、鰭基等部位較為明顯。解剖發(fā)現(xiàn)，其內(nèi)臟也有不同程度充血，部分腸道出現(xiàn)腫脹，腹腔積有血水，肛門紅腫。為查明鰱大面積死亡原因，對發(fā)病鰱腸道內(nèi)容物、肛門出血分泌物及養(yǎng)殖塘池水中病原菌進行分離、鑒定，對分離菌進行致病性和藥敏試驗。

1 材料與方法

1.1 材料

營養(yǎng)瓊脂（生產(chǎn)批號：1101791），來自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；營養(yǎng)肉湯（生產(chǎn)批號：1094671），來自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；無菌脫纖維兔血（生產(chǎn)批號：20230118001），來自南京全隆生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；15 種藥敏紙片（生產(chǎn)批號：220512），來自杭州濱和微生物試劑有限公司。試驗魚缸（2 m×0.55 m×0.5 m）7 個。

1.2 方法

1.2.1 病菌分離、鑒定

取發(fā)病死亡的鰱腸道內(nèi)容物、肛門出血分泌物及養(yǎng)殖塘池水樣品各10 g，采用無菌生理鹽水90 mL，分別對樣品稀釋10 倍，各取0.1 mL 涂布營養(yǎng)瓊脂平板，28 ℃好氧培養(yǎng)48 h。對分離得到的菌株，選取活菌數(shù)較高的進行分離純化，待純化后染色、鏡檢，初步判斷菌株類別后，進行16S rDNA 測序，其中正向引物為27F：5'-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，反向引物為1492R：5'-TACGGCTACCTTGTTACGAC-3'[1]。經(jīng)NCBI 數(shù)據(jù)庫blast 同源性比對，從而確定菌株名稱。

1.2.2 溶血性及致病性試驗

將純化后的菌株，挑取一環(huán)菌泥，稀釋于無菌生理鹽水中備用。將無菌圓形濾紙片貼于含5%的兔血瓊脂平板上，吸取50 μL 菌液，接種于無菌圓形濾紙片上，28 ℃好氧培養(yǎng)48 h，觀察有無溶血圈形成。

選取暫養(yǎng)1 周的健康鰱140 條，規(guī)格基本一致。設(shè)置7 組，1#—6#為試驗組，7#為對照組，每組20 條鰱。配置病原菌濃度分別為4.0×103，4.0×104和4.0×105cfu/mL，每2 個缸加入1 種濃度病原菌，對照組不做任何處理。觀察記錄魚患病癥狀及死亡時間，為期5 d，對死亡鰱解剖，分離病菌并鑒定。

1.2.3 藥敏試驗

將純化后的菌株活化后，挑取一環(huán)菌泥采用無菌生理鹽水稀釋，使菌液濃度為1.0×108cfu/mL，備用。吸取1 mL 菌懸液，加入50 ℃100 mL 營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中搖勻，傾倒平板，冷卻凝固后貼上藥敏紙片，靜置15 min 后，將平皿置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，觀察并測量抑菌圈直徑大小。

2 結(jié)果與分析

2.1 病菌分離、鑒定

從發(fā)病死亡的鰱腸道內(nèi)容物、肛門出血分泌物及養(yǎng)殖池塘水中，皆分離出2 株具較多活菌數(shù)的菌株，分別為X1，X2。這2 株菌在鰱腸道內(nèi)容物、肛門出血分泌物中活菌數(shù)均約8.0×105cfu/mL，在養(yǎng)殖塘池水中活菌數(shù)約4.0×104cfu/mL。通過16S rDNA 測序，經(jīng)NCBI 數(shù)據(jù)庫blast 同源性比對，X1 菌株與嗜麥芽窄食單胞菌（Stenotrophom-onas maltophilia）SD28L的核苷酸系列同源性為99.93%；X2 菌株與嗜水氣單胞菌（Aero-monas hydrophila）CH-GX-YL-BL-1-2021 的核苷酸系列同源性為100%。

嗜麥芽窄食單胞菌，廣泛存在于水、土壤、下水道污水中，為條件致病菌。國內(nèi)對該菌株的研究報道多數(shù)在耐藥機制及人類感染防治方面[2-5]，而在水產(chǎn)動物方面鮮有報道[6]。嗜水氣單胞菌為人畜及淡水水產(chǎn)動物共患的條件致病菌，可感染多種水產(chǎn)動物，多數(shù)表現(xiàn)為出血性敗血癥[7-11]。

2.2 溶血性及致病性

溶血性試驗結(jié)果表明，X1、X2 菌株皆具有溶血性，其中X1 溶血圈（23.23±0.22）mm，X2 溶血圈（20.42±0.35）mm。

在X1、X2 菌株的致病性試驗中發(fā)現(xiàn)，2 株菌株均可導(dǎo)致鰱死亡。養(yǎng)殖水環(huán)境中，不同菌濃度導(dǎo)致鰱死亡情況不同。對照組在試驗觀察期內(nèi)，未出現(xiàn)死亡。隨著水體中菌濃度增加，鰱的死亡率升高，且死亡時間較提前，呈正相關(guān)。取死亡的鰱解剖，從內(nèi)臟組織、血液中均分離出原感染菌，經(jīng)鑒定與原菌株一致。

X1、X2 菌株對健康鰱致病試驗結(jié)果見表1。由表1 可見，當X1、X2 菌株水體活菌數(shù)在4.0×103cfu/mL 時，其死亡率較低，致病性不強；在4.0×104cfu/mL 時，致病性大幅度提高，且X1 菌株的致病性比X2 菌株強。

表1 X1、X2 菌株對健康鰱致病試驗結(jié)果

2.3 藥物敏感性

采用15 種抗生素，對X1 菌株進行藥敏試驗。結(jié)果顯示，X1 菌株對試驗15 種抗生素均表現(xiàn)出耐藥性，說明X1 菌株具有較強的耐藥能力，見表2。有研究表明[12-13]，嗜麥芽窄食單胞菌對頭孢類、β-內(nèi)酰胺類、氨基糖苷類、喹諾酮類與碳青酶烯類等大多數(shù)常用抗菌藥物具有不同的耐藥性。其耐藥機制：一是產(chǎn)生各種滅活酶，降低抗生素對自身的危害，如β-內(nèi)酰胺酶[14]、氨基糖苷類鈍化酶[15-17]；二是通過改變自身細胞膜通透性[18-19]，阻礙一些抗菌藥物進入，從而對許多抗菌藥物產(chǎn)生耐藥。

表2 X1 菌株對15 種藥敏紙片的敏感性

X2 菌株對阿莫西林、復(fù)方新諾明耐藥，對卡那霉素、利福平敏感中介，而對新霉素、氯霉素、青霉素G 等11 種抗生素敏感，見表3。由表3 可見，本試驗結(jié)果與文獻[20-22]研究結(jié)果，存在不同程度的差異，說明來自不同區(qū)域或養(yǎng)殖品種的差異，導(dǎo)致病原菌具有不同的耐藥性。

表3 X2 菌株對15 種藥敏紙片的敏感性

3 結(jié)論

從發(fā)病死亡的鰱腸道內(nèi)容物、肛門出血分泌物及養(yǎng)殖塘池水中，分離得到2 株病原菌，X1 為嗜麥芽窄食單胞菌，X2 為嗜水氣單胞菌。對這2 菌株的致病性及藥物敏感性進行試驗，發(fā)現(xiàn)該2 株菌株對兔血具有溶血性，當水體病菌濃度高于4.0×104cfu/mL時，對鰱的致死率大幅度上升，且嗜麥芽窄食單胞菌的致病性高于嗜水氣單胞菌。嗜麥芽窄食單胞菌對15 種抗生素表現(xiàn)出耐藥性，嗜水氣單胞菌對新霉素、氯霉素、青霉素G 等11 種抗生素敏感，對阿莫西林、復(fù)方新諾明表現(xiàn)出耐藥性。