UPLC-MS/MS同時測定醬鹵制品中15種大環內酯類抗生素

梁婷婷,曾云想,柯建賽,蔣武毅

(1.溫州市農產品檢驗測試中心,浙江 溫州 325000; 2.蒼南縣質量技術監督檢測院,浙江 蒼南 325800;3.浙江省醬鹵休閑食品質量檢測中心,浙江 蒼南 325800)

大環內酯類抗生素是一類含有12～16個碳原子組成內酯環化學結構的抗菌藥。目前根據大環結構含碳母核數量的不同,可分為14元環類、15元環類和16元環類3類[1]。由于其有廣譜抗菌作用,除臨床應用外還廣泛應用于獸藥中,常用于防治畜禽呼吸道及胃腸道感染等疾病;在低濃度時其還可作生長促進劑使用[2-3],因此在畜牧養殖業得到廣泛使用[4-6]。對抗生素的濫用或違規使用容易導致食品中獸藥殘留,其主要可引起人體胃腸道的不良反應,造成肝腎功能損傷及導致耐藥菌株擴散。為保障食品安全,各國政府均對動物源性食品中大環內酯類藥物的最大殘留限量作出相關規定[7-9]。因此,開展動物源性食品中大環內酯類藥物殘留的定量分析方法研究具有現實意義。當前對于10種以上同類抗生素同時檢測方法較少,然而在實際養殖過程中可能同時使用多種抗生素,因此建立一種能夠同時檢測多種大環內酯類抗生素的聯合檢測方法尤為重要。本研究前處理操作簡單,縮短提取時間,回收率穩定,靈敏度高,能夠對低濃度的樣品進行很好的定性確認;另外,建立同時測定15種大環內酯類抗生素的方法,能滿足對該類藥物殘留限量的檢測要求。同時為醬鹵禽畜肉食品的檢測及評估其抗生素殘留情況提供一個操作簡單、回收率穩定的方法,并為未來研究多類抗生素的聯合檢測方法提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Agilent1290-6460型超高效液相色譜-串聯質譜儀;瑞典Biotage固相萃取儀;KH3200B型臺式超聲波清洗器;Direct-Pure UP型純水機;梅特勒LE204E/02型分析天平;IKA旋渦混合器、固相萃取柱。

大環內酯類藥物標準溶液:林可霉素、竹桃霉素、紅霉素、替米考星、泰樂菌素、克林霉素、螺旋霉素、吉他霉素、交沙霉素、克拉霉素、羅紅霉素、阿奇霉素、麥迪霉素、伊維菌素、地紅霉素(純度均≥92%,Dr.Ehrenstofer公司,德國);甲醇、甲酸、乙腈、正己烷(HPLC級,德國Merck公司)。

15種大環內酯類藥物標準儲備溶液:準確量取適量大環內酯類標準物質,以甲醇溶解并定容至10 mL容量瓶中,配制成質量濃度為1.00 mg/mL的單標準儲備液,在-18 ℃下保存;15種大環內酯類藥物標準使用溶液:取低溫下標準儲備液,放置至室溫,準確量取100 μL的標準儲備液于100 mL容量瓶中,用甲醇定容至刻度線,配制成1.00 mg/L的單標準使用液,在-18 ℃下保存。使用前用乙腈配制成2.00、5.00、10.00、20.00、50.00、100.00、200.00 ng/mL 15種物質混合的標準工作溶液,現配現用。

醬鹵制品:醬鹵制品是畜禽肉及可食副產品加調味料和香辛料,以水為加熱介質煮制而成的一大類熟肉制品。

1.2 試驗方法

參考SN/T 1777.2-2007進行樣品制備,取預包裝的醬鹵食品中可食用部分用研磨機充分粉碎并攪拌均勻,裝入玻璃容器中,密封,試樣于-18 ℃保存。

稱取粉碎均勻后的固體試樣5 g(精確到0.001 g)置于50 mL聚丙烯離心管中,加入10 mL 1%甲酸乙腈(V/V),旋渦振蕩器振蕩2 min,超聲提取10 min,以8000 r/min冷凍離心3 min,移取上清液,殘渣用10 mL乙腈再次提取,合并2次提取液,將提取液用20 mL正己烷凈化后移取下層溶液,將下層液過5 mL水、5 mL甲醇預淋洗的HLB固相萃取柱,用3.0 mL甲醇洗脫2次,收集洗脫液。洗脫液于75 ℃水浴氮吹至近干,甲醇定容至1.00 mL,過0.22 μm微孔濾膜供液質分析。

1.3 數學模型

C=c×V/m

式中:C為測試樣中被測組分的殘留量(μg/kg);c為回歸方程擬合得到的樣品溶液的濃度(ng/mL);V為測試樣定容體積(mL);m為測試樣溶液中的樣品質量(g)。

1.4 儀器工作條件

1.4.1色譜條件

Agilent ZORBAX SB C8(2.1 mm×150 mm,3.5 μm),流動相:A為0.1%(體積分數,下同)甲酸水溶液,B為甲醇;柱溫35 ℃,進樣量10 μL。流動相梯度洗脫程序:0～3 min,5%～10%B;3～5 min,10%～30%B;5～8.5 min,30%～60%B;8.5～12 min,60%～95%B;12～13 min,95%～5%B,13～16 min,5%B。流量0.3 mL/min。

1.4.2質譜條件

配制1.0 μg/kg的大環內酯類藥物單標準溶液,在正離子模式下,分別進行一級質譜掃描(Q1掃描)、二級質譜掃描(子離子掃描)和多反應監測(MRM)掃描。在Q1掃描中找出每個化合物的母離子,在子離子掃描中找到3～4個響應較大的子離子,最后在MRM掃描下優化CE和DP參數,選擇響應較高、穩定性好的1個子離子作為定量離子。優化的質譜參數見表1。

表1 質譜參數

電噴霧電離正離子模式(ESI+);質譜掃描方式:多反應離子監測(MRM);脫溶劑氣:氮氣;碰撞氣:氬氣;干燥氣流量:10 L/min;干燥氣溫度:350 ℃;毛細管電壓:3.0 kV;噴霧壓力:207 kPa。其他質譜參數見表1。其中標*為定量離子。

2 結果與分析

2.1 色譜條件優化

2.1.1色譜柱優化

分別選擇Agilent ZORBAX SB C8(2.1 mm×150 mm,3.5 μm)和Waters Acquity BEH-C18色譜柱(2.1 mm×150 mm,3.5 μm)進行分離試驗比對。結果表明,使用前者進行分離,各化合物的峰形和信噪比較好。這可能是由于大環內酯類藥物中含有叔氨基結構,而不會與Agilent ZORBAX SB C8固定相中二異丙基之間產生非特異性相互作用,所以不會在柱上出現峰形拖尾,可以改善峰形。因此,最終選擇Agilent ZORBAX SB C8(2.1 mm×150 mm,3.5 μm)作為分離柱。

2.1.2流動相優化

分別選擇甲醇和乙腈作為有機相進行分離效果對比,結果表明乙腈作為洗脫溶劑時,交沙霉素、克拉霉素、羅紅霉素、麥迪霉素不能有效分離,出現重疊峰。而選擇甲醇作為洗脫劑時,各化合物離子化效率高,峰形較好,靈敏度較高。

確定甲醇作為有機相洗脫劑后,水相洗脫劑分別選擇0.1%甲酸水溶液(V/V)和0.1%乙酸銨水溶液(V/V)進行對比,在相同的液相色譜分離程序下,考察15種化合物的出峰情況。結果表明,0.1%乙酸銨水溶液能改善峰形,但0.1%乙酸銨水溶液容易在Agilent ZORBAX SB C8柱內形成鹽粒堵塞色譜柱,導致試驗重現性較差。所以試驗最終選擇0.1%的甲酸水溶液-甲醇作為流動相洗脫劑。

2.2 前處理條件的優化

2.2.1提取液的選擇

大環內酯類化合物特性為弱堿性,易溶于酸性水溶液和極性溶劑。本試驗樣品蛋白質、油脂和糖含量較高,由于高濃度乙腈有蛋白沉淀作用,對糖和油脂溶解度較小,低濃度的甲酸可創造酸性環境提高弱堿性藥物大環內酯類的提取率,所以試驗選用1%甲酸乙腈(V/V)作為提取溶劑。

2.2.2提取條件的選擇

由于試樣中油脂部分在低溫條件下可凝固,并且低溫條件下分層效果更好,不易堵塞凈化柱,且能縮短前處理時間。因而參考現行國標GB/T 20762-2006等[7-8]在樣品制備過程中設定的離心機轉速3000 r/min,時間6 min的試驗條件。本研究將離心機轉速調整為8000 r/min,-2 ℃下冷凍離心3 min。

2.3 線性關系、檢出限與定量限

用大環內酯類藥物標準儲備液配成一系列混合標準使用液,在選定的色譜條件和質譜條件下進行測定,以目標化合物定量離子的峰面積為縱坐標,相應的質量濃度為橫坐標進行標準曲線的繪制。以3倍信噪比(S/N>3)所對應的待測物的濃度為樣品的檢出限(LOD),以10倍信噪比(S/N>10)所對應待測物的濃度為定量限(LOQ),結果見表2。本方法的檢出限、定量限均低于國標中的檢出限和定量限,并且能夠同時對多種低濃度大環內酯類藥進行很好的定性確認,滿足對該類藥物殘留限量的檢測要求。

表2 15種抗生素線性回歸方程、線性范圍、相關系數(r2)、檢出限和定量限

2.4 方法的回收率和精密度

選取經檢測而未檢出這15種抗生素的雞胸肉樣品作為空白樣品,用空白樣品做添加回收和精密度試驗。取空白樣品雞胸肉中可食用部分用研磨機充分粉碎并攪拌均勻,稱取粉碎均勻后的固體試樣5 g(精確到0.001 g)置于50 mL聚丙烯離心管中,向離心管中分別添加0.10,1.00,10.00 mg/kg低中高三個濃度的標準溶液后,按照1.2試驗方法進行提取、離心、過柱;最后按1.4儀器工作條件測定結果,分析結果表明分析物的平均回收率為89.2%～101.5%;對每一濃度水平分別做6次平行測定,相對標準偏差為0.9%～3.6%,結果見表3。方法回收率和精密度良好,能滿足檢測的要求。

2.5 不同基質樣品的加標試驗

分別選取經檢測不含15種抗生素的雞肉、豬肉、牛肉、羊肉等4種樣品作為研究對象,在添加1.00 mg/kg待分析物下,按照1.2試驗方法進行提取、離心、過柱,按1.4儀器工作條件測定結果,同一濃度水平進行6次平行試驗。結果見表4,4種基質樣品中待測物的平均加標回收率在80%～120%范圍內,RSD在10%以內,說明本方法具有良好的實用性(表4)。另外,試驗結果顯示,在豬肉和羊肉試驗中回收率普遍低于雞肉和牛肉中的回收率,其中在豬肉中替米考星、克拉霉素和羊肉中替米考星、克拉霉素、麥迪霉素的相對標準偏差高于5%,可能因這兩類肉制品中的脂肪含量較高而對回收率有一定的影響。

表4 4種基質樣品精密度與回收試驗結果(n=6)

3 結論與討論

本文研究超高效液相色譜-串聯質譜法同時測定醬鹵畜禽肉中15種大環內酯類抗生素的方法,對《動物源性食品中大環內酯類抗生素殘留測定方法》(SN/T 1777.2-2007)及《畜禽肉中林可霉素、竹桃霉素、紅霉素、替米考星、泰樂菌素、克林霉素、螺旋霉素、吉他霉素、交沙霉素殘留量的測定液相色譜-串聯質譜法》(GB/T 20762-2006)進行方法優化,縮短檢測時間,增加檢測克拉霉素、阿奇霉素、麥迪霉素、伊維菌素、地紅霉素等5種抗生素種類。經試驗研究發現,選用Agilent ZORBAX SB C8可以消除色譜峰拖尾,改善峰性;流動相選取0.1%的甲酸水溶液-甲醇溶液時,可以防止鹽化堵塞色譜柱;對提取方式優化,使用超聲提取,固相萃取可以有效凈化提取液,減輕基質效應。結果表明:15種抗生素目標物方法檢出限在0.1～0.6 μg/kg,相關系數≥0.9994,回收率在82.7%～101.5%之間,RSD%為0.9%～6.2%。該方法能夠對低濃度的樣品進行很好的定性確認,滿足對該類藥物殘留限量的檢測要求。本研究使用固相萃取法(SPE)提取,目前人們探索了多種SPE新型技術,分子印跡固相萃取及新型吸附劑萃取等。這些研究均表現出改進后的SPE技術在抗生素檢測方面有著高靈敏度,但缺乏對大環內酯類抗生素的專項研究,為使SPE法在檢測大環內酯類抗生素中發揮更好的作用,需要進一步研究新型材料對大環內酯類抗生素的吸附性能。同時本試驗中對15種大環內酯類抗生素的提取方法相較國標有變化,但沒有就兩種提取工藝的優缺點進行深入對比,也沒有對比兩種提取法對提取率的影響。后續工作將是圍繞這兩種提取工藝進行條件優化,以篩選出提取率最高的提取條件。