竹黃菌角質酶Sb_5623的生物信息學分析及其原核表達

◎ 王 珞 ，羅 可 ，任錫毅

（1.貴州省生物技術研究所，貴州 貴陽 550006；2.貴州省農業生物技術重點實驗室，貴州 貴陽 550006）

竹黃菌（Shiraia bambusicola）是一種罕見的藥用真菌，隸屬于子囊菌門，常寄生于竹子的嫩枝，大量發生會導致竹子衰敗死亡。竹黃菌可寄生于包括剛竹屬（Phyllostachys）、箭竹屬（Fargesia）在內的10多種竹子，但其僅生長在超過一年生的枝條上，具有明顯的組織特異性[1-2]。竹黃菌自然生長周期短，對光照、溫度、濕度等條件要求較高，室內培養難以形成子實體和孢子[3]。對竹黃菌基因組的組裝、轉錄組與代謝組的分析[4]，可以為竹黃菌基因功能的研究奠定基礎。

角質酶是屬于α/β水解酶超家族的絲氨酸酯酶，可以通過水解單體之間的酯鍵來分解角質聚酯。角質酶來源廣泛，在植物花粉、真菌和少量原核生物中均有表達[5]。真菌角質酶是一種誘導酶，病原真菌能夠通過分泌角質酶降解植物細胞的角質或栓質，從而突破植物表面屏障，削弱宿主抗性[6]。病原真菌的休眠孢子含有“組成型”角質酶，以空間定位的方式從宿主植物角質層釋放少量角質，破壞植物表面角質層。在灰霉菌、鐮刀菌、彎孢菌、稻瘟病菌和炭疽菌的休眠孢子中，均在感染早期檢測到組成型表皮酶活性。這些孢子粘附在寄主植物表面，并從角質層釋放對感染后續階段至關重要的角質單體，在侵染過程中發揮關鍵作用。

本研究以竹黃菌為材料，構建了角質酶Sb_5623基因原核表達載體pET28a_5623，在大腸桿菌中誘導表達融合蛋白并進行純化，以期為后續角質酶Sb_5623的功能研究提供蛋白材料與科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

Sb_5623序列由竹黃菌基因組數據中獲得[3]；原核表達載體pET28a_5623由武漢擎科生物科技有限公司構建；感受態E.Coli BL21購于武漢擎科生物科技有限公司。

硫酸卡那霉素（Kan）、異丙基β-D 硫代半乳糖苷（IPTG）、十二烷基磺酸鈉（SDS）、丙烯酰胺、過硫酸銨及甲醇等，均購自索萊寶生物科技有限公司。

1.2 Sb_5623生物信息學分析

利用在線軟件InterPro（https://www.ebi.ac.uk/interpro/）預測蛋白結構；通過在線程序SignalP（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）和TMHMM（http: //www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）分析蛋白信號肽位點和跨膜結構域。

1.3 重組蛋白的誘導表達與純化

參照已建立的原核表達與Ni-NTA誘導純化的方法[7]，將重組載體轉入大腸桿菌感受態BL21，設置IPTG的誘導濃度為0.2 mM，設置不同的溫度梯度，摸索出重組蛋白誘導表達的最適條件、探索純化蛋白的最適上清洗脫條件。

1.4 Western Blot鑒定重組蛋白

根據 Western Blot 操作步驟，誘導后蛋白先于15% SDS-PAGE 跑膠，然后100 V 80 min 恒壓轉移至PVDF 膜上；1×PBST 溶液洗膜4次，每次4 min；PVDF膜封閉30 min； 1×PBST溶液洗膜4次；帶His標簽的一抗低溫孵育過夜；1×PBST清洗；二抗常溫孵育1 h；電化學發光法顯色，全自動熒光化學發光成像系統成像。

2 結果與分析

2.1 角質酶Sb_5623蛋白生物信息學分析

通過InterPro對Sb_5623蛋白進行結構域預測，發現其第37至第255個氨基酸的位置含一個Cutinase角質酶結構，屬于α/β水解酶超家族（AB_hydrolase）；而1～27個氨基酸的位置存在一段信號肽（如圖1）。

圖1 Sb_5623蛋白保守結構域預測圖

根據信號肽位點預測的結果，可見Sb_5623的信號肽屬于Sec/SPI類型，即由Sec轉座轉運，并且由信號肽酶I（Lep）切割的標準型分泌信號肽，概率為0.974 6。此信號肽的剪切位點預測在第19個和第20個氨基酸之間，概率為0.467 6（如圖2A）。

圖2 角質酶Sb_5623生物信息學分析圖

Sb_5623蛋白共計324個氨基酸，有一個跨膜螺旋結構，大部分序列在膜內，其余序列在膜外，跨膜螺旋中氨基酸預期數量為22個，推測該蛋白屬于分泌蛋白（如圖2B）。

2.2 Sb_5623重組蛋白誘導表達

設置蛋白誘導得到IPTG濃度為0.2 mM，誘導條件為過夜誘導，設置18、28、37 ℃3個溫度梯度，探究蛋白誘導的最適溫度。經過SDS-PAGE凝膠電泳檢測，結果發現，在33～43 kd之間有目的帶大小的條帶，但是誘導前后不明顯，且沉淀中的表達量多于上清中（如圖3A）。為了確認該條帶是否為目的帶以及融合蛋白是否表達成功，利用帶His標簽的抗體，通過western blot實驗檢驗蛋白表達，結果表明，不同溫度條件下，沉淀中均有Sb_5623重組蛋白表達，但僅在18 ℃誘導條件的上清中，出現Sb_5623蛋白表達（如圖3B）。沉淀中Sb_5623蛋白表達量多于上清中，但上清中蛋白表達條帶單一，產物干凈。

圖3 Sb_5623蛋白分子原核表達圖

2.3 Sb_5623重組蛋白純化分析

將18 ℃誘導后的上清液使用Ni-NTA 親和層析純化分析，經過不同濃度的咪唑洗脫后，結果表明，250 mmol/L咪唑洗脫出來的目的蛋白能夠洗脫下大部分的雜帶，純度較高，可對其進行收集。該蛋白具備生物活性，后續可用于抗體及材料制備，深入研究Sb_5623的基因功能（如圖4）。

圖4 Sb_5623蛋白分子純化分析圖

3 結語

本研究對竹黃菌Sb_5623基因的編碼蛋白進行了生物信息學預測，發現其編碼一個隸屬于α/β水解酶超家族的角質酶，在病原真菌侵染寄主植物時起著關鍵的作用。通過信號肽預測與跨膜結構預測發現，Sb_5623存在信號肽區段與跨膜結構域，該蛋白推測屬于分泌蛋白。隨后，本實驗構建了原核表達載體pET28a_5623，經IPTG誘導后，發現在18 ℃誘導過夜的條件下，上清中出現了條帶單一的重組蛋白，隨后對上清液進行純化分析，在250 mM咪唑的洗脫條件下，得到了純度較高且具備生物活性的目的蛋白。因此，本文可以為竹黃菌角質酶Sb_5623的蛋白結構解析與基因功能研究提供參考。