高效液相色譜法同時測定薏米中3種B族維生素

◎ 商云帥，解道博，謝新娜，羅 婧

（1.吉林工商學院糧食學院，吉林 長春 130507；2.中國農業科學院特產研究所，吉林 長春 130112）

B族維生素也叫乙族維生素、維他命B、維生素B復合體，共8種，統稱為族，其結構上沒有同一性，但有共同特點。維生素B為水溶性維生素，見光易分解，易被氧化，溫度高結構易破壞[1]。維生素B是人體代謝所必須的，是糖、蛋白質、脂肪等轉化成熱量時不可或缺的物質之一，機體如果缺少維生素B，會降低細胞功能，引起代謝障礙[2-3]。人體無法自主合成維生素B，只能額外補充，市面上相關產品眾多，但是藥品、保健品的攝入會對肝臟腎臟帶來代謝負荷。米糠、麩皮、粗糧、蔬菜等食物中廣泛存在維生素B，因此，正確合理地從食物中攝取是補充維生素B健康的方式。其中，薏米是不錯的選擇[4-5]。

薏米是中國傳統藥用兼食用的植物，作用溫和，有世界禾本植物之王的美譽。薏米味甘，寒性，可利水滲濕、健脾止瀉[6]。薏米雖然富含多種維生素，往往由于烹飪方法不當，從中攝取的維生素含量并不高[7]。因此，通過定量檢測的方法準確測定薏米中維生素B的種類和含量，有利于指導維生素的合理補充，避免維生素B的流失。

維生素B1又被稱為抗神經炎素，經常處于緊張狀態的人尤其需要，可改善精神狀況。維生素B2即核黃素，可消除口腔、舌、唇的炎癥，促使皮膚、毛發、指甲正常生長。維生素B3即煙酸，可改善腸胃功能障礙，促進消化系統的健康，有助于降低血液中膽固醇、甘油三酯水平[8-9]。目前，維生素B1、B2、B3這三種B族維生素的檢測有相關國家標準和文獻。其中，DB37/T 2140—2012和GB/T 36921—2018標準中推薦了預混合飼料和牙膏中維生素B1、B2、B3的高效液相色譜檢測方法[10-11]。薛淼等人以4種不同茶葉為材料，實現5種水溶性維生素含量的測定，主要采用甲醇和乙酸鈉-乙酸為流動相，梯度洗脫[12]。楊潤等人建立了保健食品中維生素B1、維生素B2、維生素B6及煙酰胺等4種水溶性維生素的高效液相色譜測定法，方法以甲醇、冰乙酸溶液（含己烷磺酸鈉）為流動相[13]。王浩等人建立了同時測定嬰幼兒配方奶粉中煙酰胺、泛酸、煙酸、維生素B2、維生素B6等5種水溶性維生素的高效液相色譜測定法，方法以辛烷磺酸鈉、甲醇-乙腈為流動相[14]。張媛媛等人以甲醇和庚烷磺酸鈉溶液為流動相，建立了復合維生素B片中煙酰胺、維生素B1、維生素B2及維生素B6的超高效液相色譜含量測定方法[15]。

綜合文獻可知，不同類別樣品可以通過高效液相色譜法實現維生素B的檢測。因此，建立一套高效液相色譜法同時測定薏米中的維生素B種類，很有必要。基于此，本文以維生素混合標準品色譜峰的分離效果和洗脫程序運行時間為評價依據，摸索并確定儀器方法，優化流動相配比、流速、柱溫等色譜條件，進行方法學研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

薏米產地吉林省；維生素B1、B2、B3標準品（純度分別大于98.9%、96.8%、99.9%，LGC有限公司）；甲醇（色譜純，美國Fisher公司）；乙酸銨、冰乙酸、鹽酸（分析純）等化學試劑。

1.2 儀器與設備

高效液相色譜儀（U3000，賽默飛世爾科技有限公司）；電子天平（FA2004N，上海精密科學儀器公司）；超聲波清洗機（KQ-500E，昆山市超聲儀器有限公司）；恒溫干燥箱（GZX-9070MBE，上海博訊實業有限公司）；pH計（PHS-3C，上海精密科學儀器有限公司）；粉碎機（JY7114，上海微型電機廠）；低速離心機（SC-3610，安徽中科中佳科學儀器有限公司）。

1.3 提取方法

薏米除去雜質，105 ℃干燥2 h，粉碎，過篩（60目），制得薏米粉，備用。準確稱取樣品0.5 g（精確至0.000 1 g），置于25 mL離心管中，加入10 mL甲醇超聲30 min后過濾，用適量甲醇清洗濾渣3～4次，棄掉濾液。將濾渣轉移至25 mL離心管中，加入0.01 mol/L鹽酸10 mL超聲提取30 min，離心后，將上清液轉移到10 mL容量瓶中，并用0.01 mol/L鹽酸定容。經0.22 μm微孔濾膜過濾至進樣小瓶后上機分析。

1.4 色譜條件

色譜柱（C18，4.6 mm×250 mm×5 μm），柱溫30 ℃，流速1.0 mL/min，檢測波長268 nm，流動相為甲醇和0.02 mol/L乙酸銨-乙酸緩沖溶液（pH=3.5）；洗脫程序為：0～2 min，70～66 ℃；2～4 min，66～64 ℃；4～6 min，64～66 ℃；6～8 min，66～70℃；8～10 min，70 ℃。

2 結果與討論

2.1 標準曲線及線性范圍

分別準確稱取5 mg（精確至0.000 1 g）維生素B1、B2、B3標準品置于50 mL容量瓶中，加入適量甲醇水溶解定容，配制成濃度為100 μg/mL的B1、B2、B3單一標準儲備液。分別吸取3種單一標準儲備液0.1、0.2 、0.5、1、2、3 mL到10 mL容量瓶中，甲醇水定容，配制成濃度為1、2、5、10、20、30 μg/mL的混合標準使用液，上機測試。維生素B1、B2、B3標準溶液濃度在1～30 μg/mL范圍內呈線性關系，回歸方程分別為Y=0.306 8X-0.045 7、Y=0.800 1X+0.092 4、Y=0.237 7X+0.105 8，相關系數分別為0.999 6、0.999 8、0.999 0。

2.2 檢出限

取1 μg/mL的混合標準使用液，進樣分析，3倍信噪比即為方法檢出限，計算維生素B1、B2、B3的方法檢出限分別為0.066、0.022、0.059 μg/mL。

2.3 穩定性及重復性實驗

按優化后的色譜條件將維生素混合標準使用液在0、2、4、6、8、10、12、24 h時進樣，根據維生素B1、B2、B3的峰面積計算其相對標準偏差，RSD為0.23%～3.87%；將維生素混合標準使用液重復實驗6次，根據維生素B1、B2、B3的峰面積計算其相對標準偏差，RSD為0.26%～2.54%，方法具有較好的穩定性和重復性。

2.4 色譜條件優化

2.4.1 檢測波長的確定

利用紫外可見分光光度計，將維生素混合標準使用液在190～540 nm波長范圍內進行全波長光譜掃描，最大吸收波長為268 nm。

2.4.2 流動相配比的確定

綜合文獻方法篩選出基礎程序進行實驗，有機相A為甲醇，水相C為0.02 mol/L乙酸銨-乙酸緩沖溶液（pH=3.5）。基礎程序A的洗脫條件為：0～1 min，90 ℃；1～7 min，90～80 ℃；7～13 min，80～40 ℃；13～20 min，40～30 ℃；20～27 min，30～10 ℃；27～33 min，10～90℃；33～35 min，90 ℃。用維生素混合標準溶液進樣，實驗結果如圖1-a所示。由圖1-a可知，程序A在2～15 min內洗脫出特征明顯的幾個組分，同樣儀器條件下進3種維生素單標可知，3.61、5.88、13.77 min分別為維生素B3、B1、B2這3個組分，特征明顯，分離良好，只是B1、B3響應信號較弱。在15～35 min有未知組分干擾，且基線有顯著波動，故需要進一步優化洗脫程序。

圖1 洗脫程序a-c時三種維生素混合標準溶液色譜圖

在程序A基礎上，主要針對維生素B1、B3響應信號弱的問題，不改變程序A的大方向，適當調整流動相比例和洗脫時間。程序B的洗脫條件為：0～5 min，80～60 ℃；5～10 min，60～40 ℃；10～15 min，40～20℃；10～20 min，20～40 ℃；20～25 min，40～60 ℃；25～30 min，60～80 ℃；30～35 min，80℃，實驗結果如圖1-b所示。比較目標組分出峰時間，可將乙酸銨的初始比例從90%降到80%；程序A在15～35 min有未知組分，在80%降到40%之間加一個60%的梯度，同時調整了乙酸銨的最低比例，從40%降到30%再降到10%調整為從40%降到20%，并增加乙酸銨從20%升到80%的梯度。由圖1-b可知，雜峰干擾問題得到改善，基線趨向平穩，維生素B1、B3響應信號強度有所提高，但兩組分保留時間接近。

為改善維生素B1、B3保留時間，再次降低乙酸銨初始比例，從80%降到70%，且放緩乙酸銨洗脫梯度并提高最低比例，調整后程序C的洗脫條件為：0～2 min，70～66 ℃；2～4 min，66～64 ℃；4～6 min，64～66 ℃；6～8 min，66～70 ℃；8～10 min，70 ℃；實驗結果如圖1-c所示。維生素B1、B3響應信號強度大，3個目標組分在10 min內有效分離，B3保留時間為3.22 min、B1保留時間為4.34 min、B2保留時間為6.39 min，峰形良好，基線穩定，洗脫程序E適合維生素B1、B2、B3的分離。

2.4.3 柱溫的確定

按著程序C的洗脫條件，檢測波長為268 nm，流速為1.0 mL/min，進樣體積為10 μL條件下考察不同流速對B1、B2、B3分離的影響，實驗結果見圖2。分析可知，柱溫分別為25、30、35 ℃時，柱溫的變化對基線、峰形影響不大，只是柱溫高保留時間稍有提前。綜合考慮分離效果，最終選擇30 ℃作為分離柱溫。

2.4.4 流速的確定

按著程序C的洗脫條件，柱溫30 ℃，檢測波長為268 nm，進樣體積為10 μL條件下考察不同流速對B1、B2、B3分離的影響，實驗結果如圖3所示。分析可知，流速分別為0.8、1.0、1.2、1.4 mL/min時，3組分峰形良好且有效分離，差別僅在于保留時間提前，但同時柱壓也會增大。流速為1.4 mL/min較0.8 mL/min比，保留時間提前約1 min，考慮分析時間和經濟成本，選擇1.0 mL/min作為最佳流速。

圖3 不同流速時的標品色譜圖

2.5 加標回收率實驗

為考察方法的準確度及精密度，進行了加標回收實驗，設置了低、中、高三個水平，6平行實驗結果見表1。薏米中維生素B1提取率平均值為0.41 mg/100 g，RSD為2.62%；加標回收率平均值為88.3%～94.2%，RSD為3.97%～5.32%；維生素B3提取率為0.24 mg/100 g，RSD為2.84%；加標回收率平均值為91.1%～101.9%，RSD為4.24%～6.75%。分析可知，此方法具有較好的回收率，符合分析要求。

3 結論

本實驗建立了超聲輔助提取-高效液相色譜法測定薏米中3種B族維生素的分析方法，實現了單一液相條件下薏米中維生素B1、B2、B3的同時測定。通過考察檢測波長、洗脫程序、柱溫、流速等因素，篩選出最佳色譜分離條件，3種目標組分均在10 min內實現有效分離。其中，維生素B3保留時間為3.22 min、B1保留時間為4.34 min、B2保留時間為6.39 min。由此可見，該方法分析時間短、操作便捷、可同時測定多種維生素B含量，為雜糧維生素檢測奠定基礎。