基于網絡藥理學和分子對接技術探討解痙散瘀湯治療肩袖損傷的作用機制▲

林澤宏 周紅海 魏紀湖 羅 灝 柒萬強 唐 俊

(廣西中醫藥大學1 研究生院,2 骨傷學院,廣西南寧市 530001)

肩袖損傷是常見的肩關節疾病,以肩部疼痛、活動障礙為主要癥狀,其在全部肩關節疾病中的占比為5%～40%,且在臨床上30%～70%的肩關節疼痛與肩袖損傷有關[1]。肩袖損傷的患病風險與年齡呈正相關,60～69 歲人群的患病率可達 31%,而 80 歲以上人群的患病率預計可達 65%[2]。近年來,隨著我國社會人口老齡化加劇,我國的肩袖損傷患病率也在逐年增加,這加大了社會和個人的經濟壓力。目前除手術治療外,中醫藥療法在肩袖損傷的保守治療中占有重要地位[3]。如何緩解肩袖損傷患者的疼痛,改善關節活動度,減少肩袖軟組織變性,防止肌腱進一步撕裂,是肩袖損傷保守治療的臨床和科研熱點。因此,探索一種安全、有效的中藥方劑對于肩袖損傷的保守治療具有重要意義。

中醫中并無“肩袖損傷”的直接記載,但根據綜合臨床表現和病因病機,應將其歸屬于中醫“痹癥”中的“肩痹”范疇。解痙散瘀湯是我國國醫大師韋貴康教授運用“活血通經,解痙散瘀”之法治療頸肩痹痛的良方,臨床研究表明,該方對肩痹有明確的療效[4],但目前其治療肩袖損傷的作用機制還不明確。而中藥復方的作用機制具有多成分、多靶點的特點,故本研究通過網絡藥理學及分子對接技術,探討解痙散瘀湯治療肩袖損傷的潛在機制,以期為肩袖損傷保守治療的臨床用藥及研究提供參考依據。

1 資料與方法

1.1 活性成分及其作用靶點的篩選 (1)通過中藥系統藥理學數據庫和分析平臺(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform,TCMSP;https://old.tcmsp-e.com/index.php)獲取白芍、赤芍、當歸、丹參、甘草、兩面針、牛膝、桃仁、豨薟草的所有活性成分,然后設置口服生物利用度(oral bioavailability,OB)≥30%且類藥性(drug-likeness,DL)≥0.18初步篩選主要活性成分,再通過TCMSP進一步檢索主要活性成分的作用靶點。(2)通過中國知網(https://www.cnki.net/)檢索有關地龍活性成分研究的文獻[5-7],收集地龍的活性成分,通過ChemDraw軟件繪制活性成分的分子結構并保存為.sdf格式。將.sdf格式文件上傳SwissADME平臺(http://www.swissadme.ch/)篩選主要活性成分,篩選條件為“Pharmacokinetics”項的“GI absorption”結果為“High”,且“Druglikeness項”的5種預測(Lipinski、Ghose、Veber、Egan、Muegge)結果中有2個及2個以上為“Yes”。將地龍主要活性成分的.sdf格式文件上傳至SwissTargetPrediction平臺(http://swisstargetprediction.ch/),設置物種為“Homo Sapiens”且probability>0,對主要活性成分的作用靶點進行預測。(3)使用R語言將獲得的所有靶點進行合并去重,然后通過Uniprot數據庫(https://www.uniprot.org/)將靶點名轉換為規范的基因名稱[8]。

1.2 解痙散瘀湯治療肩袖損傷潛在作用靶點的篩選 使用“Rotator Cuff Tears”作為檢索詞,在GeneCards?數據庫[9](www.genecards.org)和OMIM?數據庫(https://www.omim.org)中檢索肩袖損傷的相關靶點,將兩個數據庫的結果進行合并去重。通過VENNY 2.1平臺(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)將解痙散瘀湯主要活性成分的作用靶點與肩袖損傷的相關靶點進行映射取交集,得到解痙散瘀湯治療肩袖損傷的潛在作用靶點。

1.3 構建成分-靶點網絡 使用Cytoscape 3.9.1軟件,對主要活性成分及解痙散瘀湯治療肩袖損傷的潛在作用靶點進行分析并構建成分-靶點網絡。通過Cytoscape 3.9.1軟件的Network Analyzer插件分析成分-靶點網絡的拓撲參數,根據節點連接度由大到小進行排序,將連接度位居前5的主要活性成分作為解痙散瘀湯治療肩袖損傷的關鍵活性成分。

1.4 構建蛋白-蛋白相互作用網絡 將解痙散瘀湯治療肩袖損傷的潛在作用靶點導入STRING 11.5 平臺(https://string-db.org),設定物種為“Homo sapiens”,可信度為0.4,剩余參數均為默認值,最終獲得解痙散瘀湯治療肩袖損傷的蛋白-蛋白相互作用(protein-protein interaction,PPI)網絡,將數據導入Cytoscape 3.9.1軟件的cytoNCA插件,分析中介中心性、接近中心性、度中心性、特征向量中心性、局部平均連接中心性及網絡中心性共6個參數進行2次篩選,最終以度中心性值大于中位值的靶點作為核心靶點。

1.5 功能富集分析和通路富集分析 將解痙散瘀湯治療肩袖損傷的潛在作用靶點導入DAVID數據庫(https://david.ncifcrf.gov/home.jsp),設置物種為“Homo Sapiens”,進行基因本體論(Gene Ontology,GO)功能富集分析及京都基因和基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)通路富集分析,以P<0.05作為篩選標準[10]。將分析結果導入微生信平臺(http://www.bioinformatics.com.cn/)進行可視化處理。

1.6 關鍵活性成分與核心靶點蛋白的分子對接 首先,通過PubChem數據庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)獲取關鍵活性成分的2D結構,采用ChemOffice軟件對其進行優化并制作其3D結構。然后,通過RCSB PDB數據庫(https://www.pdbus.org/)獲取核心靶點蛋白的3D結構,并通過PyMol軟件對其進行去水、去小分子配體等優化。最后,通過AutoDock 1.5.6軟件實現關鍵活性成分與核心靶點蛋白的分子對接,以結合能大小判定分子對接是否成功,結合能≤0 kcal/mol表明配體與受體可以自發結合,一般來說分子間的結合能越低,則發生作用的概率越大,結合越穩定。

2 結 果

2.1 解痙散瘀湯的主要活性成分及其作用靶點 通過TCMSP共獲得主要活性成分273個及其作用靶點270個,其中白芍、赤芍、當歸、丹參、甘草、兩面針、牛膝、桃仁、豨薟草的主要活性成分分別有13個、29個、2個、65個、92個、20個、20個、23個、9個。通過SwissADME平臺獲得地龍的主要活性成分47個及其作用靶點679個。合并去重后,共獲得解痙散瘀湯的主要活性成分291種、作用靶點835個。

2.2 解痙散瘀湯治療肩袖損傷的潛在作用靶點 經合并去重后,從GeneCards?數據庫和OMIM?數據庫共獲得肩袖損傷相關靶點357個。通過VENNY 2.1平臺將肩袖損傷的相關靶點與解痙散瘀湯主要活性成分的作用靶點取交集,共獲得解痙散瘀湯治療肩袖損傷的潛在作用靶點95個。

2.3 成分-靶點網絡及關鍵活性成分篩選結果 將主要活性成分與解痙散瘀湯治療肩袖損傷的潛在作用靶點導入Cytoscape 3.9.1軟件,構建得到的成分-靶點網絡包含節點237個、連線729條,見圖1。在網絡中,連接度位居前5的主要活性成分依次為槲皮素、環(L-脯氨酸-L-苯丙氨酸)二肽、木犀草素、L-脯氨酰-L-亮氨酰-L-亮氨酰甘氨酸、山柰酚,即關鍵活性成分。關鍵活性成分的基本信息見表1。

表1 關鍵活性成分的基本信息

圖1 成分-靶點網絡

2.4 PPI網絡及核心靶點篩選結果 通過STRING 11.5平臺對解痙散瘀湯治療肩袖損傷的95個潛在作用靶點進行分析,剔除獨立靶點,得到PPI網絡數據,然后將數據導入Cytoscape 3.9.1軟件進行拓撲分析和可視化,見圖2。拓撲分析結果顯示,白細胞介素(interleukin,IL)-1B、絲氨酸/蘇氨酸激酶1(serine/threonine kinase 1,AKT1)、血管內皮生長因子 A(vascular endothelial growth factor A,VEGFA)、基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)9、纖維連接蛋白(fibronectin,FN)1為網絡中的核心靶點。

圖2 PPI網絡圖

2.5 GO功能富集分析結果 對解痙散瘀湯治療肩袖損傷的95個潛在作用靶點進行GO功能富集分析,共獲得736個條目,包括566個生物過程,60個細胞組分,110個分子功能。以-lgP值進行由大到小排序選出前10個條目進行可視化,見圖3。

圖3 GO富集分析結果的可視化圖

2.6 KEGG通路富集分析結果 對解痙散瘀湯治療肩袖損傷的95個潛在作用靶點進行KEGG通路富集分析,共獲得142條通路,潛在作用靶點主要涉及晚期糖基化終末產物-晚期糖基化終末產物受體信號通路、缺氧誘導因子1信號通路、腫瘤壞死因子信號通路、IL-17信號通路等信號通路。以-lgP值進行由大到小排序。將前15條通路制作成氣泡圖,見圖4。

圖4 KEGG通路富集分析的可視化圖

2.7 分子對接分析結果 所有關鍵活性成分和核心靶點蛋白對接的結合能均≤0 kcal/mol,表明解痙散瘀湯治療肩袖損傷的關鍵活性成分和核心靶點均具有較好的結合活性,見表2。選取部分分子對接結果進行展示,見圖5。

圖5 部分分子對接結果的可視化圖

3 討 論

肩袖損傷在中醫學中屬于“痹癥”中的“肩痹”范疇,臨床上常以“肩痹”治法治之。解痙散瘀湯為國醫大師韋貴康教授為肩部病痛所創良方,有活血通經、解痙散瘀的功效,可使經脈通、氣血順,損傷之筋脈得以濡養,脈通筋柔,痹痛得消,臨床療效頗佳[4]。方中以丹參為君藥,丹參可調和氣血,行而不破,散中有收;當歸、桃仁、赤芍通行三焦,行血散瘀;白芍、甘草、牛膝、地龍緩急解痙止痛,再配以兩面針、豨薟草消腫止痛,共奏活血散瘀、解痙止痛之功。

本研究通過構建成分-靶點網絡,獲得5個關鍵活性成分,包括槲皮素、木犀草素、環(L-脯氨酸-L-苯丙氨酸)二肽、L-脯氨酰-L-亮氨酰-L-亮氨酰甘氨酸、山柰酚。肩袖組織發生急性損傷或是受到長期反復的機械性損傷時,損傷組織局部存在不同程度的炎癥反應,而持續、過度的炎癥反應會加重患者的疼痛感,以及影響肩袖組織的修復[11]。槲皮素通過提高超氧化物歧化酶和MMP抑制劑的水平,以及降低腫瘤壞死因子α、IL-1B、MMP的水平,來抑制炎癥反應及氧化應激反應,延緩蛋白聚糖的降解,從而促進肩袖損傷后軟組織的修復[12-13]。木犀草素通過核轉錄因子κB通路,減少IL-1B、腫瘤壞死因子α等炎癥因子的分泌,減輕損傷組織的局部炎癥反應[14]。山柰酚能通過核轉錄因子κB信號通路和絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信號通路,降低誘導型一氧化氮合成酶、腫瘤壞死因子α等促炎性細胞因子的表達水平,發揮抗炎、鎮痛的作用[15-16]。環(L-苯丙氨酸-L-脯氨酸)二肽、L-脯氨酰-L-亮氨酰-L-亮氨酰甘氨酸是存在于地龍的生物類小分子多肽,具有良好的消炎、鎮痛效果[17]。上述關鍵活性成分的藥理作用表明解痙散瘀湯可提升人體抗氧化能力,減輕炎癥反應,從而緩解肩袖損傷患者的疼痛。

本研究PPI網絡拓撲分析結果顯示,IL-1B、AKT1、VEGFA、MMP9、FN1為解痙散瘀湯治療肩袖損傷的核心靶點。肩袖組織損傷后,局部釋放大量細胞因子,激活多種生物信號通路,形成復雜的靶點-通路調控網絡,在肩袖損傷的炎癥期、愈合期和重塑期發揮重要作用[18]。在軟組織損傷早期,毛細血管破裂和細胞內液滲透導致局部組織充血腫脹,腫瘤壞死因子、IL-1B等致炎因子被大量釋放,從而激活p38MAPK等炎癥相關信號通路,進而誘發炎癥級聯反應[19]。大量研究表明,IL-1B、AKT1是肩袖損傷炎癥期重要的促炎性細胞因子,通過核轉錄因子κB、MAPK等多條信號通路在損傷組織局部參與炎癥反應的發生[20-22]。VEGFA可促進血管形成,改變血管通透性,參與炎癥反應、細胞凋亡,在肩袖損傷的病理過程中有重要作用[23]。損傷的肩袖組織會在分子層面進行重塑,表現為腱細胞減少、細胞凋亡增加和膠原蛋白排列紊亂,增加后期肩袖再撕裂的概率,影響肩關節功能[24]。MMP家族通過重塑損傷細胞外基質改變組織形態,有研究表明,在肩袖損傷組織中MMP9表達顯著升高,其過度活躍會影響肩袖組織的修復,而抑制其表達可促進肩袖損傷后的腱骨愈合[25-26]。FN1廣泛存在于細胞外基質,是組織修復的重要材料,通過與細胞外基質受體相互作用來促進整合蛋白釋放,從而促進組織修復[27]。

本研究KEGG通路富集分析結果顯示,解痙散瘀湯治療肩袖損傷的潛在作用靶點主要涉及的信號通路有晚期糖基化終末產物-晚期糖基化終末產物受體信號通路、缺氧誘導因子1信號通路、腫瘤壞死因子信號通路、IL-17信號通路。晚期糖基化終末產物-晚期糖基化終末產物受體信號通路可通過調控氧化修飾性蛋白質的生成,促進炎癥發生與發展,同時炎癥因子激活免疫細胞,導致損傷組織局部炎癥反應進一步加劇[28]。缺氧誘導因子1信號通路、腫瘤壞死因子信號通路及IL-17信號通路的表達,促進炎癥因子、促血管形成因子及基質金屬蛋白酶釋放,影響炎癥反應、細胞凋亡與組織重塑[29-31]。GO功能富集分析結果顯示,潛在作用靶點基因主要涉及的生物學過程有脂多糖反應、低氧反應、過氧化氫反應、膠原分解代謝過程、蛋白水解等,這些生物學過程均與炎癥反應和組織重塑有關[32-33]。綜上,解痙散瘀湯主要通過影響與炎癥反應、細胞凋亡及血管生成相關的信號通路,來抑制炎癥反應、調控損傷組織局部細胞凋亡、抑制組織過度重塑,進而減緩肩袖損傷的發展,改善患者預后。

本研究通過網絡藥理學篩選出解痙散瘀湯的主要活性成分,初步探明其以多成分、多靶點、多通路的方式,通過抑制炎癥反應、調控損傷組織重塑等機制,來發揮治療肩袖損傷的作用,這或許可為今后解痙散瘀湯治療肩袖損傷的相關實驗提供理論依據。