肝癌標志物受體酪氨酸激酶AXL、軟骨寡聚基質蛋白和骨橋蛋白多重檢測試劑開發與驗證

李思萍，韓金育，胡迪，王雅杰，于曉波

1.溫州醫科大學 第一臨床醫學院（信息與工程學院），浙江 溫州 325035；2.國家蛋白質科學中心-北京（鳳凰中心）北京蛋白質組研究中心，北京 102206；3.首都醫科大學附屬北京地壇醫院 檢驗科，北京 100015；4.旦生（北京）醫學科技有限責任公司，北京 102206

肝癌是高度致命的惡性腫瘤之一[1]，肝細胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）是最常見的原發性肝癌。當前，常用于肝癌診斷的血清學標志物甲胎蛋白（alpha-fetoprotein,AFP）雖被廣泛應用，但應用存在局限性[2-3]。肝癌相關指南建議對AFP陰性人群可以增加檢測異常凝血酶原（desγ-carboxy-prothrombin,DCP）、甲胎蛋白異質體3（alpha-fetoprotein lens culinaris agglutinin 3,AFP-L3）、miRNA（microRNA）檢測試劑盒和GALAD模型等，從而提高肝癌檢出率，但可能由于靈敏度或特異度有限、檢測成本高等原因，仍未廣泛應用于臨床，迫切需要探索新型有效標志物來提供肝癌相關腫瘤信息。受體酪氨酸激酶AXL、軟骨寡聚基質蛋白（cartilage oligomeric matrix protein,COMP）、骨橋蛋白（osteopontin,OPN）是近年來分別被發現，并經臨床樣本驗證的新型肝癌標志物，聯合AFP檢測可以提高肝癌診斷性能[4-6]。但多數研究只是針對其中一種標志物與AFP聯合檢測，以上三項標志物與AFP結合對肝癌的診斷價值鮮見報道。以往這幾種標志物的檢測多采用酶聯免疫吸附試驗（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）[7-9]，但ELISA樣本用量大、操作繁瑣且不能實現多重檢測。流式熒光技術利用不同熒光編碼微球實現單次實驗多項標志物同時檢測，其檢測靈敏度高、特異性強、分析速度快、標志物組合靈活等優勢[10-11]，可以節約試劑用量和人力成本。本研究基于流式熒光技術建立多重肝癌標志物檢測方法，并進行檢測性能分析，篩選肝癌血清樣本進行臨床驗證并初步探討四項標志物對肝癌的診斷價值。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 標本：標本取自2019年6月至2022年1月在首都醫科大學附屬北京地壇醫院被診斷為HCC的患者及同期體檢的健康對照者。訓練隊列有30例健康對照者（男/女：21/9，年齡21～83歲）和30例HCC患者（男/女：23/7，年齡35～75歲）。驗證隊列有20例健康對照者（男/女：13/7，年齡25～84歲）和20例HCC患者（男/女：15/5，年齡32～66歲）。

HCC組納入標準：患者均為新診斷且未接受過治療。HCC組排除標準：血清采集前接受過抗癌治療的患者和有其他腫瘤病史的患者。健康對照組納入標準：①肝臟生化指標正常且肝炎病毒血清學陰性；②無肝臟和胃腸道疾病及惡性腫瘤病史。所有血清樣品在冰上解凍，渦旋5～10 s，在4 ℃條件下1 500×g離心10 min，將上清液分裝后用于檢測，剩余樣本-80 ℃保存。本研究經首都醫科大學附屬北京地壇醫院倫理委員會審核批準（編號：DTECKT2022-006-01），同時簽署了免知情同意書。

1.1.2 主要試劑及儀器：人AXL、COMP、OPN標準品及抗體對購自美國R&D systems公司，人AFP標準品及抗體對購自杭州博岳生物技術有限公司，2-（N-嗎啉）乙磺酸（MES）水合物購自美國Sigma-Aldrich公司，1-乙基-3（3-二甲基氨基丙基）碳二亞胺鹽酸鹽（EDC）購自北京索萊寶科技有限公司，N-羥基硫代琥珀酰亞胺（Sulfo-NHS）、鏈霉親和素-藻紅蛋白（SA-PE）購自美國Thermo Scientific公司，EasyMagPlex磁性熒光編碼微球、流式細胞儀、磁力板均購自深圳唯公科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 血清樣本檢測：磁性熒光微球成功連接捕獲抗體后，向反應板每孔內分別加入50 μL微球懸液和50 μL血清稀釋液（AFP以1:20稀釋，AXL、COMP、OPN以1:30稀釋）或標準品或空白對照，室溫振蕩孵育2 h，洗滌液清洗2次；每孔加入50 μL生物素標記的檢測抗體而形成雙抗體夾心形式，室溫振蕩孵育1 h，洗滌液清洗2次；每孔加入50 μL稀釋后的SA-PE，室溫振蕩孵育0.5 h，洗滌液清洗2次；200 μL檢測緩沖液重懸微球，用EasyCell流式細胞儀的不同激光同時對羧基微球上的分類熒光和檢測抗體上的標記熒光進行檢測，對待測靶標分子進行分類和定量，實現多項肝癌標志物同時檢測[12]。

1.2.2 方法學建立：根據唯公羧基編碼微球使用說明書，取四種不同熒光比例的微球各100 μL（8×106beads/mL），洗滌后加入Sulfo-NHS、EDC活化30 min；以MES為反應緩沖液，分別向每種微球懸液中加入5.6 μg對應的捕獲抗體孵育2 h；用Tris緩沖液反應10 min，直接加入封閉緩沖液搖床混勻封閉14 h；于次日用種屬與微球結合的捕獲抗體種屬來源匹配的生物素化抗鼠IgG以及SA-PE來驗證微球偶聯效率；利用四項標志物進行預實驗，根據中值熒光強度（median fluorescence intensity,MFI）優化檢測抗體和SA-PE的工作濃度以及依次加入蛋白、檢測抗體和SA-PE的孵育時間等實驗條件，建立定量檢測肝癌血清標志物的流式熒光免疫法。

1.2.3 方法學性能分析：①交叉反應：使用3 個測試評估交叉反應性[13]，多重偶聯微球、單個抗原和單個檢測抗體，用于確定蛋白是否與非靶標偶聯微球結合；多重偶聯微球、單個抗原和多重檢測抗體，用于確定檢測抗體是否與非靶標蛋白發生交叉反應；多重偶聯微球、多重抗原和多重檢測抗體，用于確認多重測定中不存在交叉反應。②檢測范圍：結合靈敏度和最高檢測限得到檢測范圍。③靈敏度：以樣本稀釋液為空白對照，測定3個空白對照的MFI值，計算其均值（）和標準偏差（s），以空白檢測限（limit of blank,LoB）=+2s[13]和最低檢測限（limit of detection,LoD）=+2s[14]分別代入標準曲線中計算對應濃度值。④精密度：檢測高、低兩個濃度的樣本，每個濃度11個重復，進行3 次獨立實驗。根據變異系數（coefficient of variation,CV）公式：CV（%）=s/×100%，計算精密度。⑤回收率與線性度：以人混合血清樣本為未摻入組，向人混合血清樣本加入已知濃度的標準品作為摻入組，向稀釋液中加入已知濃度的標準品作為對照組。根據樣本測定濃度值計算相應的回收率和線性度，回收率（%）=（摻入組－未摻入組）/對照組×100%，以摻入組的樣本計算線性度，線性度（%）=稀釋樣本×稀釋倍數/未稀釋樣本×100%。

1.2.4 方法學初步應用：本研究以訓練隊列和驗證隊列作為研究對象，流式熒光免疫法測定同一批血清樣本中四項蛋白濃度，比較HCC組與健康對照組的組間差異，分析流式熒光免疫法與化學發光免疫法檢測AFP水平的一致性，受試者工作特征（receiver operating characteristic,ROC）曲線用于評估標志物在HCC中的診斷性能，二元Logistic回歸分析用于構建標志物聯合檢測模型，以探討流式免疫熒光法檢測四項肝癌標志物在診斷中的初步應用。

1.3 統計學處理方法 使用SPSS25.0、GraphPad Prism8.0 軟件進行統計分析。兩種方法的一致性分析采用Pearson相關；標志物檢測結果以M（P25，P75）表示，兩組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗；標志物診斷性能評估采用ROC曲線分析；標志物聯合檢測模型構建采用二元Logistic回歸分析；標志物間的交叉反應圖采用Excel繪制。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 微球偶聯驗證 在分析開發之前進行微球偶聯效率評估，以MFI為縱坐標，抗鼠IgG濃度值為橫坐標，采用四參數Logistic回歸模型分別繪制AFP、AXL、COMP和OPN的曲線。隨著生物素標記的抗鼠IgG濃度不斷增加，相應的MFI信號值也會增加（見圖1）。四項標志物的最高MFI信號均在170 000以上[在設置的光電倍增管（photomultiplier tube,PMT）下，飽和狀態最高MFI信號值在200 000左右]，說明四項標志物的捕獲抗體已經成功連接在微球上。

圖1 微球偶聯驗證結果

2.2 檢測性能

2.2.1 交叉反應：分析肝癌標志物AXL、COMP和OPN之間的交叉反應性，顯示三個靶標蛋白之間不存在交叉反應（見圖2），可以實現三項標志物同時檢測。

圖2 交叉反應結果圖

2.2.2 標準曲線：標準曲線對定量測量至關重要，以MFI為縱坐標，標準品濃度值為橫坐標，采用四參數Logistic回歸模型繪制AFP、AXL、COMP和OPN的標準曲線（見圖3）。四項標志物標準曲線相關的檢測范圍、LoB和LoD分析結果見表1。結果表明四項標志物的標準曲線可以準確定量檢測人血清中AFP、AXL、COMP和OPN的蛋白濃度（R2=0.999）。

表1 四項標志物性能分析結果

圖3 標準曲線圖

2.2.3 性能分析：四項標志物對應精密度和準確度結果見表1，檢測高、低兩個濃度的樣本，每個濃度11個重復，得到四項標志物的批內CV均＜8%；3次獨立檢測得到四項標志物的批間CV均＜5%；測定每個蛋白梯度稀釋的四個濃度，計算四項標志物的平均回收率在84%～101%范圍內，平均線性度在95%～102%之間。

2.3 肝癌標志物臨床應用評價

2.3.1 方法學比對：為了驗證流式熒光免疫法檢測結果的準確性，將其與臨床化學發光免疫法檢測HCC患者的AFP結果進行相關性分析，訓練隊列（n=30）和驗證隊列（n=20）的結果均顯示兩種方法具有很高的相關性（r=0.994，P＜0.001），見圖4。

圖4 AFP結果的相關性分析

2.3.2 差異表達分析：血清樣本中AFP、AXL、COMP及OPN在HCC組與健康對照組存在顯著差異（見圖5），在訓練隊列（n=60）中，HCC組四項標志物表達水平均高于健康對照組，差異均有統計學意義（均P＜0.01）；獨立驗證隊列（n=40）證實了訓練隊列的發現，相比于健康對照，四項標志物在HCC中均過度分泌（均P＜0.01）。在訓練隊列和驗證隊列中，血清四項蛋白水平表現出相似的分布（見圖5和表2）。

表2 各項標志物檢測結果[ M（P25，P75），ng/mL]

圖5 四項標志物在健康對照組與HCC組的差異表達

2.3.3 臨床應用價值探討：繪制HCC與健康對照的ROC曲線，以約登指數確定最佳臨界值，在最佳臨界值條件下對比各項標志物的診斷性能。在訓練隊列中，單項標志物中，OPN對HCC的診斷性能最佳，AUC達到0.891，表現出比AFP（AUC為0.859）更好的診斷價值；AXL、OPN和AFP組合的AUC為0.953，P4的AUC為0.951，二者具有相似的診斷性能；評估各項標志物對HCC的識別能力，在30例HCC中，21例（70.0%）為AXL陽性，15例（50%）為COMP陽性，24例（80.0%）為OPN陽性，23例（76.7%）為AFP陽性，共有30例（100%）為AXL、COMP、OPN、AFP或四者陽性。為了進一步挖掘AXL、COMP、OPN對AFP陰性HCC患者的識別能力，訓練隊列中，有9例AFP陰性HCC患者，其中6例（66.7%）為AXL陽性，5例（55.6%）為COMP陽性，7例（77.8%）為OPN陽性，共有9例（100%）為AXL、COMP、OPN或三者陽性。見圖6A。

圖6 血清四項標志物診斷性能的評估

使用訓練隊列中相同的臨界值，分析了驗證隊列中的40 例參與者，得到與訓練隊列相似的診斷性能（見圖6B和表3），AXL、OPN和AFP組合的AUC為0.955，P4的AUC為0.965。在兩個隊列的所有參與者（n=100）中，ROC曲線分析產生了與訓練隊列相似的診斷性能（見圖6C）。

表3 四項標志物的診斷性能

用Logistic回歸模型評估兩個隊列中四項標志物聯合檢測HCC的性能，發現回歸模型中COMP與AXL自變量之間存在中度共線性，方差膨脹因子（variance inflation factor,VIF）：COMP=3.986，AXL=4.688（VIF為3～10時被認為有中等程度的共線性），可能會影響回歸方程的預測結果，最終將AXL、OPN和AFP納入預測模型中，通過二元Logistic回歸獲得的方程創建了HCC的新變量預測概率（p）：Log（p/(1-p)）=-4.563+0.009×AFP+0.017×OPN+0.09×AXL，（AFP，P=0.023；OPN，P=0.004；AXL，P=0.108）。

3 討論

隨著新型標志物和新技術的不斷更新，檢測肝癌相關標志物的新方法不斷涌現，它們的創新之處可能在于分析方法，充分地將成熟標志物AFP與新型標志物應用于各種創新型統計模型中[15-16]。盡管臨床血清學標志物AFP仍然飽受爭議，但所有新方法一經提出都得與AFP進行比較[6，15，17]。

本研究對流式熒光技術檢測四項標志物的方法進行性能分析，四項標志物表現出較好的檢測范圍、靈敏度、重復性和準確度，揭示本項目開發的檢測方法可以準確定量血清中AFP、AXL、COMP和OPN水平。AXL、COMP和OPN之間沒有觀察到交叉反應，基于流式熒光技術可以實現三項標志物同步檢測，可顯著節省樣本用量和檢測時間，進而降低標志物檢測成本。因AFP與這個組合的AXL檢測抗體存在交叉反應且AFP與這個組合的樣本稀釋倍數相差懸殊而進行單項檢測。

本研究篩選兩個隊列的血清樣本進行臨床驗證并探討新型肝癌標志物的初步應用價值，發現HCC組的血清AXL、COMP、OPN和AFP均顯著高表達，證實這四項標志物在HCC患者中具有較高的表達水平，與以往研究[4-6]報道結果一致。ROC曲線分析顯示，單項標志物中，OPN對肝癌的診斷效果最佳，表現出比AFP更優的診斷性能[6]。利用四項標志物構建HCC預測模型時，發現Logistic回歸模型中COMP與AXL自變量之間存在中度共線性，可能會影響Logistic回歸方程的預測結果，最后僅用AXL、OPN和AFP構建HCC預測模型。與以往報道的AFP、AFP-L3、DCP組合[18]（AUC為0.910），GALAD模型[15]（AUC為0.930），7個miRNAs組合[17]（AUC為0.888）等對HCC的診斷性能相比，AXL、OPN和AFP組合能達到相當的檢測性能，且AXL、COMP、OPN對AFP陰性HCC患者具有一定的識別能力，表明AXL、COMP、OPN是診斷HCC的潛在血清學標志物，需要在更大臨床隊列中進行驗證。

流式熒光技術具有通量高、速度快、易自動化、按需組合等優勢受到臨床廣泛關注和積極推動[11]。本研究的流式熒光免疫法與臨床化學發光免疫法檢測AFP結果具有顯著相關性（r=0.995，P＜0.001），這說明此方法可以滿足臨床檢測性能。AXL、COMP、OPN還沒應用于臨床，因此沒有臨床相關的檢測數據可以進行比對，在我們未來的研究計劃中，利用ELISA檢測AXL、COMP、OPN與流式免疫法檢測結果進行比對，進一步證實流式熒光技術檢測三項標志物的可靠性。

最后，本研究不足在于樣本量較小，研究結果需要在更大臨床隊列中得到驗證；同時考慮到肝臟相關疾病對于檢測結果的影響，例如肝炎、肝硬化等，我們還需要加入相關疾病隊列以得到對肝癌更加特異的標志物。總之，我們建立了一種同時檢測血清AXL、COMP和OPN的多重檢測方法，在兩個臨床隊列中平行驗證了以上標志物在肝癌中的檢測能力。