基于透明質酸酶活性的感染微環境響應型抗菌涂層的制備

黃義星，鄭鎮譽，徐國潮，鄒盛濤

溫州醫科大學附屬第二醫院 骨科，浙江 溫州 325027

現代骨科學的創立與進步，離不開金屬內植入物的參與。但是骨內植入物引發的相關感染讓廣大臨床醫護人員感到非常棘手。四肢骨折手術后的相關感染發生率為5%～15%，脊柱手術后的相關感染發生率也高達2%～5%[1]。感染一旦發生，處理非常麻煩，局部應用抗生素也成為越來越多臨床醫師的首選方法[2]。骨內植入物表面抗菌涂層設計是在不改變骨內植入物基本結構和力學性能的前提下，賦予其緩釋抗生素的功能[3]。且研究人員目前在響應性藥物緩釋方面取得了一定的進展，包括酶、pH、光、熱和溫度響應等[4-5]。相關研究顯示，骨內植入物相關感染的發生主要與金黃色葡萄球菌相關，而其感染與繁殖會大量釋放透明質酸酶、鏈激酶和血漿凝固酶等[6]。本研究期望用細菌感染后產生的透明質酸酶自動降解抗菌涂層中的透明質酸（hyaluronic acid,HA），從而促成抗生素的釋放，實現涂層的智能響應性緩釋效果。

1 材料和方法

1.1 材料 蒙脫土（montmorillonite,MMT）購自山東優索化工科技有限公司；透明質酸和萬古霉素（vancomycin,VA）購自西安普瑞斯生物工程有限公司；原子力顯微鏡（FM-NanoviewRa-AFM）購自蘇州飛時曼精密儀器有限公司；掃描電鏡（SEM3300）購自北京大束科技有限責任公司；金黃色葡萄球菌購自上海撫生實業有限公司；鬼筆環肽和DAPI購自北京索萊寶科技有限公司；克氏針購自東莞市聯順精密金屬材料有限公司；橢圓偏振光譜儀（UVISEL Plus）購自蘇州上器試驗設備有限公司；共聚焦顯微鏡（LSM900）購自北京普瑞賽司儀器有限公司；核酸蛋白檢測儀（HD-2000）購自深圳三莉科技有限公司；MC3T3細胞購自上海通派生物科技有限公司；TNF-α ELISA試劑盒、堿性磷酸酶試劑盒、鉀離子檢測試劑盒購自上海酶聯生物科技有限公司；硅片購自蘇州晶矽電子科技有限公司；涂菌棒購自北京龍谷天成科技發展有限公司；透明質酸酶購自上海弘順生物科技有限公司；生化培養箱（LRH-250）購自上海瑞穩儀器設備廠；SD大鼠購自南京君科生物工程有限公司[SCXK（滬）2018-0006]。

1.2 方法

1.2.1 聚合物抗菌涂層的制備：0.5 g MMT溶解于200 mL去離子水中，獲得濃度為2.5 mg/mL，放置在磁力攪拌器上（60 r/min）攪拌24 h后，在4 ℃冰箱中靜置1周。同樣方法配置HA溶液，濃度為2 mg/mL。進一步在HA溶液中加入VA，獲得HA-VA（透明質酸-萬古霉素）終濃度為1 mg/mL。按照實驗設計要求準備組裝基材，如克氏針、硅片、對聚二甲基硅氧烷（PDMS）等；并依次在去離子水、無水乙醇、去離子水中超聲處理20 min，烘干，放置在4 ℃冰箱中。在組裝開始之前，將所有預配溶液超聲過夜。依次將組裝基材浸泡在MMT和HA-VA溶液中30 min，每次從溶液中取出后均先在氮氣下吹干，然后再次浸入下一步溶液中，以此記為一組裝雙層。重復上述組裝步驟，獲得最終所需的蒙脫土/透明質酸-萬古霉素5[（MMT/HA-VA）5]多層膜聚合物抗菌涂層。

1.2.2 聚合物抗菌涂層的材料學表征：在聚合物多層膜涂層的組裝過程中，通過原子力顯微鏡跟蹤了涂層表面粗糙度的變化情況，并記錄粗糙度的具體數值。

1.2.3 聚合物抗菌涂層的細菌響應和酶響應性緩釋行為的檢測：以硅片為組裝基材，在硅片表面構建（MMT/HA-VA）5多層膜涂層。在24孔板中分別加入2 mL PBS、104CFU/mL金黃色葡萄球菌溶液、106CFU/mL金黃色葡萄球菌溶液、100 U/mL透明質酸酶溶液（HAS）和160 U/mL HAS。將表面負載（MMT/HA-VA）5多層膜涂層的硅片同時放入上述孔中，保證溶液可以完全浸沒過硅片，并將制備完畢的（MMT/HA-VA）5多層膜涂層作為（MMT/HA-VA）5組，不與細菌或酶接觸。繼續將24 孔板放置在細菌培養箱（37 ℃）中孵育48 h。待達到規定孵育時間后，同時取出所有硅片，使用氮氣進行完全吹干，使用掃描電鏡觀察各組多層膜涂層在共培養后表面形貌的變化情況。抑菌環實驗：制備瓊脂板，對金黃色葡萄球菌進行擴增，用移液槍吸取100 μL濃度為108CFU/mL的金黃色葡萄球菌，采用涂菌棒涂抹均勻，將硅片放置在瓊脂板中央，置于細菌培養箱培養24 h，隔日測量抑菌環直徑。利用橢圓偏振光譜儀，通過光譜橢圓偏振法測量各組多層膜涂層的厚度。

1.2.4 聚合物抗菌涂層的抗菌性能測試：細菌內部存在豐富的堿性磷酸酶、鉀離子、蛋白質和核酸，并且保持穩定狀態以保證細菌的生命支持。當細菌的細胞壁完整性受到破壞后，以上細胞內容物會被釋放到胞外。故可以通過檢測細菌胞外堿性磷酸酶、鉀離子、蛋白質和核酸含量的多少來評價細菌的活性，進一步反映聚合物抗菌涂層的抗菌性能。以體積為1 cm3的PDMS為組裝基材，在其表面構建（MMT/HA-VA）5多層膜聚合物涂層，表面未經任何修飾的空白PDMS作為空白組。將2組PDMS先經紫外滅菌24 h，然后放置入15 mL離心管中。取對數生長期的金黃色葡萄球菌，采用0.9%氯化鈉溶液稀釋至細菌濃度為1×106CFU/mL。在每個離心管中加入5 mL上述濃度金黃色葡萄球菌。將上述混合菌液放置在細菌培養箱中培養（37 ℃，100 r/min）。在第4 h、12 h和24 h提取菌液，5 000 r/min離心15 min，吸取上清液，使用堿性磷酸酶試劑盒按說明書操作步驟測上清液吸光度值（405 nm）。同時使用鉀離子檢測試劑盒，繼續測定吸光度值（450 nm）。實驗通過檢測共培養菌液中蛋白質和核酸的含量變化來評估金黃色葡萄球菌生物膜通透性的改變。金黃色葡萄球菌混合菌液配置參數同上，在4、12和24 h分別提取菌液，離心機5 000 r/min轉速離心15 min，吸取上清液，使用核酸蛋白檢測儀在波長280 nm（蛋白質）處和260 nm（核酸）處檢測吸光度值。

1.2.5 聚合物抗菌涂層的細胞相容性檢測：制備聚合物抗菌涂層的提取液。實驗所需提取液應按照固體表面積與浸提液體積的比例為0.2 g/mL的原則進行提取。按照上述原則，以0.9%氯化鈉溶液為浸提液，獲得（MMT/HA-VA）5多層膜涂層提取液。使用24孔板培養細胞，單孔接種約5.0×104個小鼠前成骨細胞（MC3T3細胞），（MMT/HA-VA）5組加入200 μL上述獲得的提取液，空白組加入等量含血清培養液，培養24 h。去除培養基，PBS清洗3遍，多聚甲醛固定0.5 h，再次使用PBS清洗3次，進行鬼筆環肽（Phalloidin）染色和4’,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色，并采用計算機內置軟件導出兩種染色合成圖。

1.2.6 聚合物抗菌涂層體內實驗：以在SD大鼠脛骨內插入髓內針的模式構建大鼠骨內植入物相關感染模型，本研究已通過溫州醫科大學實驗動物倫理委員會的批準。分為3組：感染組、（MMT/HA-VA）5組和空白組。感染組在大鼠脛骨隧道內注射5 μL金黃色葡萄球菌菌液（104CFU/mL）并植入未經修飾的克氏針。（MMT/HA-VA）5組同樣注射等量等濃度的金黃色葡萄球菌，但植入表面經（MMT/HA-VA）5多層膜聚合物涂層修飾的克氏針?？瞻捉M不注射細菌，但是植入未經修飾的克氏針。動物造模結束后，飼養8周處死；分別在第1、2、4、6、8周從大鼠尾靜脈抽取血液，根據ELISA法跟蹤大鼠體內炎癥因子（TNF-α）的變化趨勢。處死大鼠后，立即從脛骨隧道內取出克氏針放置在瓊脂涂板上培養，并將大鼠骨組織脫鈣進行組織學分析。

1.3 統計學處理方法 采用SPSS21.0軟件進行數據處理分析。計量資料用±s表示，多組間比較用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 聚合物抗菌涂層的材料學表征 原子力顯微鏡檢測見涂層表面具有粗糙結構，起伏有致，凹凸不平。視覺上直觀的感覺就是組裝粒子聚集程度高的區域形成山峰，亮度大，而組裝粒子聚集程度低的區域形成山谷，亮度小，見圖1。隨著組裝過程的進行，復合物材料表面的表面粗糙度呈現出逐漸增加的趨勢。當組裝完畢一雙層之后，涂層表面的粗糙度為（383.67±5.44）nm。組裝獲得（MMT/HA-VA）3多層膜涂層結構，其表面粗糙度為（425.33±10.78）nm。最終獲得目標涂層（MMT/HAVA）5，測試得其表面粗糙度為（576.33±8.96）nm，見圖2。（MMT/HA-VA）5和（MMT/HA-VA）1相比，表面粗糙度有所增加（P＜0.05）。

圖1 組裝過程中多層膜材料表面粗糙度3D圖

圖2 組裝過程中多層膜材料表面粗糙度數值變化

2.2 聚合物抗菌涂層的細菌響應和酶響應性緩釋行為的檢測 掃描電鏡見制備完畢的（MMT/HA-VA）5多層膜結構表面覆蓋均勻，涂層比較致密緊實。經過PBS浸泡之后，其表面未發生明顯變化，顯示出比較優異的穩定性。但在與細菌或者酶接觸后，涂層表面發生不同程度的崩解剝落，但依然有部分結構殘留在涂層表面，而且隨著細菌或酶濃度的增加，涂層表面的崩解程度也在明顯增加，殘留結構進一步減少，見圖3。104CFU/mL金黃色葡萄球菌組、106CFU/mL金黃色葡萄球菌組、100 U/mL HAS組和160 U/mL HAS組與（MMT/HA-VA）5組比，形成的抑菌環的大小和表面涂層的厚度差異均有統計學意義（P＜0.01），見圖4。

圖3 （MMT/HA-VA）5多層膜涂層與各組接觸后涂層表面掃描電鏡圖

圖4 （MMT/HA-VA）5組、PBS組、104 CFU/mL金黃色葡萄球菌組、106 CFU/mL金黃色葡萄球菌組、100 U/mL HAS組、160 U/mL HAS組形成的抑菌環的大小和表面涂層的厚度

2.3 聚合物抗菌涂層的抗菌性能測試 隨著時間的增加，空白組和（MMT/HA-VA）5組的胞外堿性磷酸酶、鉀離子、蛋白質和核酸含量均表現出增加的趨勢；（MMT/HA-VA）5組所檢測的上述細菌內容物含量都高于空白組，差異均有統計學意義（P＜0.05），見圖5-8。

圖5 （MMT/HA-VA）5組和空白組分別與金黃色葡萄球菌共培養4、12、24 h后胞外堿性磷酸酶含量

圖6 （MMT/HA-VA）5組和空白組分別與金黃色葡萄球菌共培養4、12、24 h后胞外鉀離子含量

圖7 （MMT/HA-VA）5組和空白組分別與金黃色葡萄球菌共培養4、12、24 h后胞外蛋白質含量

2.4 聚合物抗菌涂層的細胞相容性檢測 共聚焦顯微鏡可見骨髓間充質干細胞的細胞核被染成藍色，而細胞質內的肌動蛋白絲則被鬼筆環肽染成紅色。2組細胞的伸展狀態均比較充分，沒有明顯差異。2組細胞骨架中的肌動蛋白微絲在數量和分布密度方面對比也比較類似。提示（MMT/HA-VA）5多層膜涂層具有良好的細胞相容性，浸提液安全可靠，對大鼠骨髓間充質干細胞沒有明顯的不良反應和不良干擾，見圖9。

圖9 空白組和（MMT/HA-VA）5組與MC3T3細胞共培養后Phalloidin染色、DAPI染色和兩種染色合成圖（×100）

2.5 聚合物抗菌涂層體內實驗 感染組在最初的6周內，炎癥因子急劇升高，之后一直穩定在較高水平，證明該感染模型設計合理；空白組的TNF-α水平始終維持在正常水平，未發生感染，提示該操作人員的實驗技術、動物管理過關；對于植入表面負載（MMT/HA-VA）5多層膜涂層克氏針的大鼠，在髓腔內注射有較高濃度的菌液，但檢測其炎癥因子依然穩定在正常水平以內；感染組和空白組間TNF-α水平差異有統計學意義（P＜0.05），說明該骨內植入物相關感染模型造模成功；感染組和（MMT/HA-VA）5組間TNF-α水平差異有統計學意義（P＜0.05），說明（MMT/HA-VA）5涂層具有優異的抗感染功能；而（MMT/HA-VA）5組和空白組間TNF-α水平差異無統計學意義（P＞0.05），證明含涂層克氏針植入大鼠體內后未引起額外的炎癥反應。見圖10。在感染組中的克氏針表面檢測出細菌，而（MMT/HA-VA）5組中未能檢測到，見圖11。空白組代表正常骨組織的結構形態，感染組中由于細菌大量繁殖，出現大量炎癥細胞，（MMT/HA-VA）5組中沒有發現炎癥細胞，骨小梁結構清晰，見圖12。

圖10 大鼠模型術后各組TNF-α水平檢測

圖11 感染組、（MMT/HA-VA）5組和空白組克氏針表面細菌培養（光鏡，×4）

圖12 感染組、（MMT/HA-VA）5組和空白組骨組織HE染色結果（×200）

3 討論

在醫學技術飛速發展的今天，骨內植入物材料是骨科最常見和最重要的手術耗材，但是由其引發的相關感染問題卻嚴重困擾著廣大臨床醫師。近年來，據相關文獻報道，骨折內固定手術后骨感染總體發生率為0.4%～16.1%，其中閉合性骨折手術之后感染發生率為0.4%～2.0%，而開放性骨折手術后感染發生率為1.0%～55.0%，并且骨折情況越嚴重，手術后相關感染發生率越高[7]。感染發生后，如果不能有效及時處理，將會導致骨髓炎或者骨壞死的發生[8]。究其主要原因是常見的引起感染的細菌，如金黃色葡萄球菌，對各種骨科內植入物材料具有很強的親和力，非常容易黏附在材料表面上[9]。其次人體受到骨折等創傷后，機體局部免疫系統受損也會促使細菌增殖并進一步形成難以根除的細菌生物膜[10]。現階段臨床醫師對骨內植入物相關感染采取的治療策略主要集中在早期清創和全身應用大劑量抗生素治療這兩個方面[11]。然而從細菌感染的進展過程來看，患者一旦需要清創，說明細菌已經在骨內植入物周圍繁殖增長了一段時間，而全身應用大劑量抗生素會對患者的正常組織和臟器產生不良反應[12]。

針對以上問題，研究人員將目光鎖定在骨內植入物的表面涂層研發上，希望能在第一時間殺滅黏附在骨內植入物表面的細菌，從而在病情發生發展的起點進行有效干預[13]。這樣既可以保證骨內植入物內固定的力學作用，也能預防或者治療內植入物相關感染，并且減少了全身應用抗生素的不良反應。為此，研究人員和臨床醫師做出了巨大的研究和努力，并取得了一定的成果。例如：BRAEM等[14]在鈦金屬表面構建介孔二氧化硅（SiO2）擴散屏障，可以有效實現金屬表面釋放抗生素。MCMANAMON等[15]采用超聲噴涂技術將慶大霉素負載到鈦金屬表面，并繼續涂覆聚乳酸。RADIN等[16]以萬古霉素、硅酸乙酯、乙醇、鹽酸和去離子水為原料，利用浸泡法成功在骨內植入物表面構建水凝膠-萬古霉素涂層。盡管上述骨內植入物表面的抗菌涂層都具備優異的抗感染性能，但是研究人員還是從中發現一部分問題，其中最重要的問題是，上述設計的藥物緩釋行為不可調控，即在內植入物植入生物體內的起始階段基本都存在藥物的“暴釋”現象，難以實現長效的緩釋和按需緩釋[17]。而長效的藥物緩釋和按需緩釋效果恰恰是預防和治療骨內植入物相關感染的最理想要求。研究人員希望骨內植入物表面抗菌涂層的藥物釋放行為能夠實現適量可控，在保證殺滅細菌的同時盡量減少不良反應[18]。HAS是一種線性大分子酸性黏多糖，在人體內廣泛分布，具有調控細胞增殖分化，潤滑關節腔，保護軟骨、促進創傷修復等重要生理作用[19]。MMT別名膠嶺石，由于特殊的結構構造，具有很強的吸附能力，廣泛用作醫用材料的載體[20]。VA主要通過干擾細胞壁中肽聚糖的合成，從而達到抑菌效果，在實際臨床應用中主要用于骨內植入物相關感染的治療[21]。筆者認為，本研究所制備的（MMT/HA-VA）5復合物多層膜涂層具備以下優點。在體外實驗中，該抗菌涂層具備顯著的細菌濃度依賴性特點，可以根據細菌釋放的HAS按需釋放抗生素。這將在臨床上具備實際的應用意義，即在沒有細菌感染發生的情況下，抗生素可以比較穩定的“儲存”在（MMT/HA-VA）5復合物多層膜結構中，一旦發生細菌感染，其釋放的HAS將會觸發抗菌涂層發生崩解，該緩釋特點不僅可以根據細菌感染發生的嚴重程度可調控地釋放抗生素，同時可以延長抗菌涂層的有效作用時間，我們認為該涂層在一定程度上可以實現基本的“智能”化藥物緩釋?；谝陨象w外抗菌特點，本研究經過進一步探索，證實（MMT/HA-VA）5復合物多層膜涂層具有高效的殺菌能力和可靠的生物安全性。在大鼠在體實驗中進一步發現，該抗菌涂層依然表現穩定，抗感染效果顯著。

綜上所述，本研究制備的（MMT/HA-VA）5復合物多層膜涂層具有良好的生物安全性和高效的體內體外殺菌效果。并能夠根據感染的嚴重程度，自動調控抗生素緩釋的劑量，在有效保證殺滅細菌的前提下，盡可能減少不良反應并延長抗菌涂層的有效作用時間，是一種相對理想的骨內植入物表面抗感染涂層，對解決臨床相關問題具有潛在的應用價值。