澳洲堅(jiān)果莖段組織培養(yǎng)研究

農(nóng)成銀 許光德 劉正魯 岑湘濤 沈 偉 牛俊樂(lè)

（百色學(xué)院農(nóng)業(yè)與食品工程學(xué)院，廣西百色 533000）

澳洲堅(jiān)果（Macadamia integrifolia &Macadamiate Trapbylla）為山龍眼科澳洲堅(jiān)果屬，原產(chǎn)于亞熱帶，1940年被定為夏威夷經(jīng)濟(jì)作物，因此又稱“夏威夷果”[1]。因營(yíng)養(yǎng)成分豐富，香味獨(dú)特、質(zhì)地細(xì)膩，備受?chē)?guó)際市場(chǎng)青睞，有“堅(jiān)果之王”的美譽(yù)。截至2022年，我國(guó)澳洲堅(jiān)果種植面積達(dá)30 萬(wàn)hm2[2]。

生產(chǎn)中澳洲堅(jiān)果的主要繁殖方式分為種子實(shí)生苗繁殖、嫁接、扦插、壓條4 種。種子實(shí)生苗繁殖存在生長(zhǎng)周期長(zhǎng)、易發(fā)生變異、遺傳穩(wěn)定性差等問(wèn)題[3]。目前生產(chǎn)中多采用嫁接繁殖方式，但木本果樹(shù)枝干質(zhì)地硬、皮薄，且單寧含量高，常規(guī)嫁接成活率一般在50%～80%[4]。扦插和壓條方式下根系的形成需較長(zhǎng)時(shí)間，同時(shí)樹(shù)種也需要人工輔助管理，成本較高，生產(chǎn)上未得到廣泛推廣。植物組織培養(yǎng)技術(shù)是根據(jù)植物細(xì)胞的全能性，利用組織、器官、細(xì)胞等培育獲得完整植株，在保持母株優(yōu)良性狀的基礎(chǔ)上，還具有生長(zhǎng)周期短、繁殖率高、管理方便、有利于工廠化生產(chǎn)和自動(dòng)化控制等優(yōu)點(diǎn)。蘋(píng)果、櫻桃、桑葚等果樹(shù)利用組織培養(yǎng)技術(shù)，通過(guò)器官發(fā)生、叢生芽繁殖、體細(xì)胞胚胎發(fā)生等方式均可獲得優(yōu)良穩(wěn)定的組培苗木[5-7]。

本研究以澳洲堅(jiān)果品種‘桂熱1號(hào)’帶芽莖段為外植體，探究適宜莖段外植體腋芽萌動(dòng)的滅菌時(shí)間、腋芽萌發(fā)生長(zhǎng)適宜的培養(yǎng)基種類，以期在短時(shí)間內(nèi)培育出遺傳性狀穩(wěn)定的優(yōu)質(zhì)無(wú)菌芽，為澳洲堅(jiān)果組培快繁提供一定的理論支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為澳洲堅(jiān)果‘桂熱1號(hào)’健壯嫩枝，采摘于農(nóng)業(yè)與食品工程學(xué)院苗圃。采摘活動(dòng)于3～5個(gè)晴天午后進(jìn)行，將采摘的外植體修剪為長(zhǎng)度3 cm左右?guī)?～2個(gè)腋芽的莖段備用。

1.2 培養(yǎng)條件

培養(yǎng)溫度為（26±1）℃，光照度為2 000 lx、12 h/d。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 外植體滅菌 將外植體沖洗干凈后用洗衣粉水浸泡15 min，沖洗干凈后再用0.1%的高錳酸鉀浸泡10 min，自來(lái)水沖洗干凈備用。將外植體放入無(wú)菌瓶用75%乙醇浸泡30 s 后倒出，用無(wú)菌水漂洗2～3 遍，再將外植體放進(jìn)另一個(gè)新的無(wú)菌瓶倒入0.2%氯化汞表面消毒6、7、8、9、10、11、12 min，倒出0.2%氯化汞后用無(wú)菌水漂洗2～3遍，再用無(wú)菌吸水紙吸干水分后接種到以MS為基本培養(yǎng)基添加2.0 mg/L 6-BA和0.1 mg/L NAA的培養(yǎng)基上，7 d統(tǒng)計(jì)污染率，15 d統(tǒng)計(jì)腋芽萌動(dòng)率。污染率和腋芽萌動(dòng)率計(jì)算公式：污染率（%）＝（污染數(shù)/接種數(shù)）×100；腋芽萌動(dòng)率（%）＝（接種未污染腋芽萌動(dòng)數(shù)/接種數(shù)）×100。

1.3.2 腋芽萌發(fā)生長(zhǎng)培養(yǎng) 將在最佳滅菌時(shí)間滅菌后的外植體分別接種在以MS 為基本培養(yǎng)基添加6-BA（1.0、2.0 mg/L）配合NAA（0.1、0.5、1.0 mg/L）或GA3（0.1、0.5、1.0 mg/L）的培養(yǎng)基上進(jìn)行腋芽萌發(fā)生長(zhǎng)培養(yǎng)。45 d統(tǒng)計(jì)腋芽萌發(fā)率及長(zhǎng)勢(shì)。萌芽率計(jì)算公式：萌芽率（%）＝（接種未污腋芽萌發(fā)數(shù)/接種數(shù)）×100。

2 結(jié)果與分析

2.1 外植體滅菌

據(jù)表1 可知，在75%乙醇浸泡30 s 配合0.2%氯化汞溶液進(jìn)行滅菌的條件下，隨著滅菌時(shí)間的增加，污染率從最高的65.00%逐漸降低到最低的8.69%，但腋芽無(wú)膨大萌動(dòng)趨勢(shì)；芽萌動(dòng)率先從30.00%升高到57.70%，隨著滅菌時(shí)間的延長(zhǎng)降低到4.35%。試驗(yàn)結(jié)果表明，75%乙醇配合0.2%氯化汞對(duì)澳洲堅(jiān)果品種‘桂熱1號(hào)’莖段滅菌的最佳時(shí)間是9 min，此時(shí)污染率是26.92%，腋芽萌動(dòng)率是57.7%，腋芽膨大明顯。

表1 0.2%氯化汞不同滅菌時(shí)間對(duì)莖段污染率及腋芽萌動(dòng)率的影響

2.2 腋芽萌發(fā)生長(zhǎng)

據(jù)表2 可知，在培養(yǎng)基為6-BA（1.0、2.0 mg/L）、NAA（0.1、0.5、1.0 mg/L）情況下，各個(gè)培養(yǎng)基的萌芽率都在50%左右，腋芽在培養(yǎng)基為6-BA（2.0 mg/L）配合NAA（0.5 mg/L）時(shí)長(zhǎng)勢(shì)最好。接種10 d左右外植體基部開(kāi)始形成愈傷組織，愈傷組量隨著時(shí)間延長(zhǎng)逐漸增多，其中NAA（1.0 mg/L）培養(yǎng)基愈傷組量最多，基本覆蓋住腋芽，開(kāi)始時(shí)呈顆粒狀乳白色，質(zhì)地緊實(shí)，60 d 部分愈傷組織呈翠綠色。在6-BA（1.0、2.0 mg/L）、GA3（0.1、0.5、1.0 mg/L）培養(yǎng)基下的整體萌芽率稍低于6-BA 和NAA 組合的培養(yǎng)基，隨著GA3濃度增加，芽長(zhǎng)勢(shì)逐漸減弱。形成的愈傷組織呈白色，質(zhì)地相對(duì)松軟，量少。試驗(yàn)結(jié)果表明，MS+6-BA（2.0 mg/L）+NAA（0.5 mg/L）適合澳洲堅(jiān)果品種‘桂熱1號(hào)’無(wú)菌芽萌發(fā)生長(zhǎng)。

表2 培養(yǎng)基種類對(duì)腋芽萌發(fā)生長(zhǎng)的影響

3 結(jié)論與討論

3.1 外植體的滅菌

外植體的雜菌感染是植物組織培養(yǎng)過(guò)程中面臨的主要問(wèn)題之一[8]。因此，外植體材料的滅菌是植物組織培養(yǎng)的一項(xiàng)重要工作。滅菌時(shí)間短會(huì)造成滅菌不徹底、污染嚴(yán)重的問(wèn)題，滅菌時(shí)間過(guò)長(zhǎng)又會(huì)導(dǎo)致外植體死亡、萌發(fā)延遲、分化率低等情況出現(xiàn)[9]。氯化汞是植物組織培養(yǎng)過(guò)程中外植體滅菌的常用滅菌劑，具有滅菌效果好、用量少的優(yōu)點(diǎn)。75%乙醇與氯化汞組合是植物組織培養(yǎng)常用的一種滅菌方法。韓笑等[8]使用不同濃度的堿化乙醇和0.1%的氯化汞對(duì)金銀花莖尖進(jìn)行滅菌處理，結(jié)果表明，用0.1%氯化汞浸泡7 min 滅菌效果最好，污染率降到8.3%。岑湘濤等[10]在杧果帶腋芽莖段滅菌的研究中發(fā)現(xiàn)，75%乙醇浸泡30 s配合0.1%氯化汞滅菌8 min效果最佳。于靜等[11]在單因素預(yù)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用單一變量實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，篩選出先用75%的乙醇消毒20 s，再配合0.1%的氯化汞溶液處理6 min是積雪草外植體最佳滅菌方法及時(shí)間。本試驗(yàn)選用的75%乙醇浸泡30 s配合0.2%氯化汞處理9 min在澳洲堅(jiān)果品種‘桂熱1 號(hào)’莖段滅菌中取得較好滅菌效果，與前人研究結(jié)果一致。

3.2 腋芽萌發(fā)生長(zhǎng)

外植體分化的關(guān)鍵是植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的種類及濃度配比。常用的細(xì)胞分裂素包括6-BA、TDZ、KT等，常用的植物生長(zhǎng)素有IAA、IBA、2，4-D、NAA[12-13]。生長(zhǎng)素能夠促進(jìn)節(jié)間的伸長(zhǎng)和根的形成，而細(xì)胞分裂素可以使側(cè)芽從頂端優(yōu)勢(shì)中解放出來(lái)。細(xì)胞分裂素能抑制生根，在生根培養(yǎng)基中通常除去細(xì)胞分裂素而加入一定濃度的生長(zhǎng)素[14]。高濃度的細(xì)胞分裂素配合低濃度的生長(zhǎng)素具有促進(jìn)腋芽萌發(fā)和叢生芽分化的作用。GA3可以刺激器官生長(zhǎng)，但是會(huì)抑制器官發(fā)生，抑制不定根的形成。肖祖飛等[15]研究表明，誘導(dǎo)1，8-桉葉油素型油樟莖段組織培萌芽最適培養(yǎng)基是MS+6-BA（1.0 mg/L）+IBA（0.05 mg/L），萌芽率73.33%。吳高殷等[16]以山杏莖尖和莖段為外植體，在對(duì)初代培養(yǎng)基激素配比的研究中發(fā)現(xiàn)，莖尖初代培養(yǎng)最佳激素配比為6-BA（0.5 mg/L）+NAA（0.2 mg/L）；莖段初代培養(yǎng)最佳培養(yǎng)基激素配比為6-BA（0.5 mg/L）+NAA（0.1 mg/L）。余志杰[17]研究發(fā)現(xiàn)，6-BA和NAA都是誘導(dǎo)牟平野生玫瑰莖段不定芽萌發(fā)和生長(zhǎng)的主要因素，MS+6-BA（1.5 mg/L）+NAA（0.l mg/L）是誘導(dǎo)牟平野生玫瑰莖段不定芽發(fā)生的最佳培養(yǎng)基。郭麗[18]以單芽莖段為外植體研究鉆石海棠組織培養(yǎng)快繁體系的建立，結(jié)果表明：MS+6-BA（1.0 mg/L）+NAA（0.l mg/L）為叢生芽最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基，誘導(dǎo)率60.7%。本研究篩選出適合澳洲堅(jiān)果品種‘桂熱1號(hào)’腋芽萌發(fā)生長(zhǎng)培養(yǎng)基配方是MS+6-BA（2.0 mg/L）+NAA（0.5 mg/L），與前人研究結(jié)果相符。