羥基酪醇柔性納米脂質體的制備及其貯藏穩定性研究

李文君, 王成章, 雷建都, 陳虹霞

(1.中國林業科學研究院 林產化學工業研究所;江蘇省生物質能源與材料重點實驗室;國家林業和草原局林產化學工程重點實驗室;林木生物質低碳高效利用國家工程研究中心;江蘇省林業資源高效加工利用協同創新中心,江蘇 南京 210042; 2.北京林業大學 材料科學與技術學院,北京 100083; 3.南京林業大學江蘇省林業資源高效加工利用協同創新中心,江蘇 南京 210037)

羥基酪醇(HT),是油橄欖中的主要酚類化合物,可以從橄欖葉和橄欖油中提取,也可以由橄欖苦苷水解生成[1]。HT具有抗氧化、抗炎、抗動脈粥樣硬化、抗血栓形成、改善內皮功能障礙、脂質和止血功能等[2]。此外,HT還具有抗腫瘤活性,可作為神經保護劑[3]、心臟保護劑[4]和化學預防劑[5],用于潛在安全的藥物、天然食品添加劑和化妝品成分中。但是,HT因含有3個羥基,對空氣和光非常敏感,具有很強的不穩定性和親水性,從而影響了其生物活性,使其易于快速釋放并在體內降解,導致了其較低的生物利用度[6]。而脂質體作為藥物遞送載體,具有靶向性、緩釋性和保護性等許多提高藥物有效性的優良特性[7-11],如抗肌氨酸的抗體葉酸靶向脂質體,表現出競爭性抑制作用[12];與游離藥物相比,藥物從脂質體中釋放慢,作用時間延長[13],且在心臟和腎臟中的蓄積顯著降低[14],并由于脂質體的保護,其穩定性增加[15]。氫化卵磷脂和膽固醇具有良好的生物相容性和生物降解性,用作脂質體壁材料,能夠通過提高藥物溶解度、生物利用度和體內外穩定性以及防止干擾來增強生物活性。柔性脂質體由磷脂和能促使磷脂的雙分子層動搖和變形的邊緣活化劑(如膽酸鈉)組成[16],邊緣活化劑的存在擾亂了脂質體的磷脂雙分子層結構,增加了膜的流動性和柔性,使得柔性脂質體(甚至是較大尺寸)在角質層細胞間擠壓以及體內經皮滲透壓梯度作用下發生變形而透過完整的皮膚[17-18]。近年來,已有報道柔性脂質體作為載體促進胰島素、疫苗、非類固醇類(布洛芬)等藥物的輸運[19],其不僅能促進藥物透過皮膚,也能運載這些藥物直接到達皮膚下的深部軟組織[20]。因此,本研究通過薄膜分散法對HT脂質體包封,研究影響脂質體形成和乳化的參數,并通過響應面優化處理,確定較佳工藝條件,同時考察其在不同溫度下貯藏不同時間的穩定性,為HT柔性納米脂質體的進一步應用奠定基礎。

1 實 驗

1.1 原料、試劑與儀器

羥基酪醇(HT)標準品(純度≥98%)、氫化卵磷脂、卵磷脂、膽固醇、膽酸鈉、葉酸(FA),N,N′-羰基二咪唑(CDI),上海阿拉丁生化科技股份有限公司;聚醚F127,上海麥克林生化科技有限公司;葉酸-聚醚(FA-F127),實驗室自制[21];氯仿、甲酸、乙醇,均為分析純;甲醇、乙腈、水,均為HPLC級。

LC-20T高效液相色譜儀,日本島津公司;Nano ZS激光粒度分析儀,英國馬爾文公司;JY92-IIN超聲波細胞破碎儀,上海精其儀器有限公司;TGL-16M臺式高速冷凍離心機,上海盧湘儀離心機儀器有限公司;RE-3000A旋蒸蒸發器,上海亞榮生化儀器廠;NICOLET IS50傅里葉變換紅外光譜儀,美國賽默飛公司;TG209F1熱重分析儀,德國Netzsch公司;DSC8000差示掃描量熱儀,美國PerkinElmer公司;H-7650透射電子顯微鏡,日本日立公司。

1.2 羥基酪醇分析方法建立

1.2.1HPLC色譜條件 色譜柱為SUPELCOSILTMLC-18(25 cm× 21.2 mm, 5 μm),流動相A為1%甲酸溶液,流動相B為5%甲醇和1%甲酸的乙腈溶液,流速0.8 mL/min,進樣量5 μL,梯度洗脫,以80%A開始洗脫,7 min內流動相B調整為30%并保持18 min,之后10 min內增加流動相B到95%,并保持5 min,最后調節流動相B至20%并保持5 min,總運行時間45 min。

1.2.2HPLC標準曲線的繪制 精密稱取HT標準品,分別配制成質量濃度為2、 1、 0.5、 0.1、 0.05、 0.02、 0.01和0.005 g/L的標準溶液,甲醇溶解定容、搖勻,經0.45 μm的濾膜過濾后,依次進樣5 μL檢測(進樣3次),以峰面積積分值的平均值為縱坐標(y),標準溶液質量濃度為橫坐標(x),繪制標準曲線并擬合回歸方程。得到HT標準曲線回歸方程為:y=5 366 853x-41 226,R2=0.993 0。

1.3 羥基酪醇柔性納米脂質體制備及其制備工藝優化

1.3.1單因素試驗 采用薄膜分散法制備羥基酪醇柔性納米脂質體,首先準確稱取一定比例(質量比)的氫化卵磷脂與膽固醇于100 mL圓底燒瓶中混合,加入適量氯仿充分溶解后,加入一定質量的HT,利用旋轉蒸發儀在42 ℃下濃縮去除溶劑氯仿,待圓底燒瓶內部形成白色均勻的涂層即可;然后量取3 mL膽酸鈉水溶液及適量FA-F127在60 ℃下水化1 h(20 r/min);再將所得乳液通過超聲波破碎處理,形成均勻的脂質體納米乳液。

實驗中分別考察HT用量(0.6、 0.9、 1.2、 1.5和3.0 mg)、氫化卵磷脂與膽固醇質量比(1∶1、 2∶1、 3∶1、 4∶1和5∶1)、FA-F127用量(0.1、 0.5、 1、 1.5和2 mg)、膽酸鈉用量(5、 10、 15、 20和25 mg)、超聲波功率(5%、 10%、 20%、 30%和40%,總功率為650 W)、超聲波作用時間(5、 10、 15、 20和25 min,均為超聲波作用2 s,中間間隔1 s)等單因素對HT柔性納米脂質體包封率的影響。

1.3.2Plackett-Burman試驗 根據單因素試驗的結果,利用Design-Expert 13軟件中Plackett-Burman試驗設計方法,考察上述6個因素(n=12)對HT柔性納米脂質體包封率的影響,并篩選出具有顯著影響的因素。

1.3.3響應面優化試驗 在Plackett-Burman試驗的基礎上,依據Design-Expert 13軟件中Box-Behnken中心組合設計方法,以HT納米脂質體的包封率為響應值,選擇合適的因素與水平設計響應面優化試驗,確定較佳制備工藝。

1.4 羥基酪醇柔性納米脂質體結構表征

1.4.1紅外光譜分析 利用傅里葉變換紅外光譜(FT-IR)儀分析,波數范圍為400～4 000 cm-1,每個樣品循環掃描16次,分辨率為4 cm-1。

1.4.2熱重分析 熱重分析在氮氣保護下,從40 ℃起以10 K/min的升溫速率加熱到800 ℃。

1.4.3差示掃描量熱法 利用差示掃描量熱儀(DSC)分析,在-70 ℃下保持0.5 min,然后以20 ℃/min的升溫速率升溫至70 ℃,保持0.5 min,以20 ℃/min的降溫速率降溫至-70 ℃,保持3 min后,以20 ℃/min的升溫速率再次升溫至70 ℃。

1.4.4透射電鏡TEM分析 透射電子顯微鏡(TEM)用于測定HT柔性納米脂質體的微觀結構。首先取一滴樣品懸浮液滴在干燥的載玻片上,再把帶有支持膜的銅網放在懸浮液的液珠上漂浮以蘸取樣品,然后用濾紙吸干銅網上多余懸液,再將銅網在磷鎢酸染液滴珠上漂浮,時間約1.5 min,最后再用濾紙將染液吸干即可在80 kV的加速電壓下觀察脂質體樣品的微觀形態。

1.5 羥基酪醇柔性納米脂質體穩定性研究

1.5.1包封率測定 脂質體制劑的包封率是一個重要的定性評估特征,由添加的藥物總量與脂質體中包埋的藥物量計算得出。取0.5 mL的脂質體納米乳液加入1 mL 10% Triton X-100甲醇溶液(破乳劑),超聲波作用2 min(破乳,釋放脂質體包埋的藥物),然后以12 000 r/min離心10 min。移取上清液用甲醇定容至5 mL,利用1.2節方法測定溶液中HT含量。包封率根據式(1)計算。

(1)

式中:YE—HT納米脂質體乳液的包封率,%;co—溶液中HT的總質量濃度,g/L;c—游離HT的質量濃度, g/L;Vo—溶液中HT的總體積,mL;V—游離HT體積,mL。

1.5.2粒徑、多分散系數(PDI)及Zeta電位的測定 按優化工藝條件制備HT納米脂質體乳液,稀釋一定倍數后,在25 ℃、散射角90°條件下,采用激光粒度分析儀測定HT柔性納米脂質體的粒徑、PDI及Zeta電位值。

1.5.3貯藏穩定性 按優化工藝條件制備HT納米脂質體乳液,分別在4、 25和60 ℃下貯藏0、 7、 14、 21和28 d后按照1.5.1和1.5.2節方法測其包封率、粒徑、PDI及Zeta電位。

2 結果與討論

2.1 HT柔性納米脂質體制備工藝優化

2.1.1單因素試驗 選擇HT用量、氫化卵磷脂與膽固醇質量比、FA-F127用量、膽酸鈉用量、超聲波功率、超聲波作用時間為考察因素,探討各因素對HT柔性納米脂質體包封率的影響,結果見圖1。

a.HT用量HT dosage;b.m(氫化卵磷脂)/m(膽固醇) m(hydrogenated lecithin)/m(cholesterol);c.FA-F127用量dosage of FA-F127;d.膽酸鈉用量dosage sodium cholate;e.超聲波功率ultrasonic power;f.超聲波作用時間ultrasonic time

由圖1可知,HT用量過高過低都會引起HT柔性納米脂質體包封率的下降,當HT用量為1.5 mg,即HT在脂質體溶液中質量濃度為0.5 g/L時包封率最佳。同樣,其他5個因素對HT柔性納米脂質體包封率的影響也出現了先增加后下降的趨勢,分別在m(氫化卵磷脂)∶m(膽固醇)=3∶1、FA-F127用量1 mg、膽酸鈉用量20 mg、超聲波功率30%、超聲波作用時間10 min達到最大包封率。由于Plackett-Burman試驗設計需要盡量涵蓋每個因素允許取值的最大空間,但又不需過大,因此,試驗時可選取的HT用量范圍為1.2～3 mg,m(氫化卵磷脂)∶m(膽固醇)、FA-F127質量、膽酸鈉質量、超聲波功率、超聲波作用時間可選范圍分別為2∶1～4∶1、 0.5～1.5 mg、 15～25 mg、 20%～40%、 5～15 min。

2.1.2Plackett-Burman試驗設計關鍵因素的篩選 利用Plackett-Burman試驗設計方法,考察6個因素對HT柔性納米脂質體包封率的影響,并篩選出對其影響較為顯著的因素,每個因素取最低和最高兩個水平,結果如表1所示。

表1 Plackett-Burman試驗設計及結果

根據表1試驗設計結果,進行多元回歸方程擬合和方差分析,得一次回歸方程:Y=42.43+0.467 5X1+1.14X2+0.454 2X3+1.29X4+0.654 2X5+1.67X6,同時對該方程進行方差分析和顯著性檢驗,結果如表2所示。

表2 Plackett-Burman試驗方差分析

2.1.3Box-Behnken響應面優化 綜合單因素試驗和Plackett-Burman試驗結果,選取超聲波作用時間(X6)、膽酸鈉用量(X4)和m(氫化卵磷脂)∶m(膽固醇)(X2)這3個因素為響應面模型的自變量,進行三因素三水平的Box-Behnken試驗設計,以HT柔性納米脂質體的包封率為響應值進行響應面分析。各因素水平和結果如表3所示。

表3 Box-Behnken設計與結果

表4 回歸方程方差分析

根據表4數據可知,一次項X2,二次項X22、X42、X62對HT柔性納米脂質體包封率的影響極顯著(P<0.01),X6的影響顯著(P<0.05),根據F值大小可知影響包封率的因素排序為:m(氫化卵磷脂)∶m(膽固醇)(X2)>超聲波作用時間(X6)>膽酸鈉用量(X4)。根據模型回歸方程可知,HT柔性納米脂質體制備工藝的優化條件為m(氫化卵磷脂)∶m(膽固醇)為3.313 21∶1,膽酸鈉用量為20.578 2 mg,超聲波作用時間為10.944 7 min,此時HT柔性納米脂質體包封率為46.907 6%。

為了驗證上述響應面結果的可靠性,進行3次平行驗證試驗,考慮到實際操作,對各優化條件進行簡化處理,取m(氫化卵磷脂)∶m(膽固醇)為3.3∶1,膽酸鈉用量為20.6 mg,超聲波作用時間為11 min,仍然選擇超聲波功率、HT用量和FA-F127用量分別為10%、 1.5 mg和1 mg,制備的HT柔性納米脂質體平均包封率為46.78%,與理論值的相對誤差為0.27%,說明該模型是可靠的。

2.2 HT柔性納米脂質體結構表征

2.2.1紅外光譜分析 紅外光譜可通過官能團的主要波數用于確定可能的活性物質。烴鏈的最具特征的官能團酯基團特征峰位于1 740～1 700和1 250～1 050 cm-1之間,磷脂基團特征峰處于1 250～1 040 cm-1之間[22]。986 cm-1應該是氫化卵磷脂膽堿頭的(CH3)3-N+伸縮的特征。然而,在圖2(a)中,HT柔性納米脂質體與空白脂質體(不含HT),在3 300和3 280 cm-1,986和1 008 cm-1,以及HT柔性納米脂質體與HT在1 420和1 440 cm-1,1 000和1 100 cm-1等處的不同吸收而顯示出一些變化,但是可能由于HT與脂質基質產生相容,導致載藥納米脂質體光譜中觀察到載體的所有特征峰并且現有峰沒有主要移動或產生出現了新的高峰[23]。

a.FT-IR;b.TG;c.DTG;d.DSC

2.2.2熱重分析 樣品的熱重分析如圖2(b)和圖2(c)所示。空白脂質體和HT柔性納米脂質體均在第一階段表現出輕微的質量損失,這一過程主要損失的是樣品中吸附的水分或者未完全除去的溶劑;在216.3 ℃后發生第二階段主要的質量損失過程,這一過程發生了一系列復雜的C—C、C—O、酚羥基和苯環斷裂等反應,由DTG曲線可知,空白脂質體和HT柔性納米脂質體的失重率在226 ℃下分別達到-17.33 %/min和-15.028%/min,且2種脂質體最終質量損失分別為80.492%和77.78%,可能是負載了HT的脂質體增強了其熱力學穩定性,這一點也可以從DTG曲線中空白脂質體有更高的失重率得到佐證。

2.2.3差示掃描量熱法 HT柔性納米脂質體的DSC分析如圖2(d)所示。

由圖可知,第一次升溫曲線在48.52 ℃處出現一個明顯的吸熱峰峰值,只有一個峰值可能是因為化合物的均質化及其結晶狀態轉化為分散無定形狀態[23],且其玻璃化轉變溫度Tg為-35.11 ℃。第二次升溫曲線的Tg在-36.54 ℃處,2次升溫曲線的Tg值相差不大,重復現象較好。此外,HT柔性納米脂質體具有淺而寬的吸熱峰,寬的熔區和較低的熔點表明它們具有有序性較低的晶體結構,有利于載藥和包埋效率[23]。

2.2.4微觀結構分析 利用透射電鏡觀察HT柔性納米脂質體的微觀結構,結果如圖3所示。由圖可知,整體上,HT柔性納米脂質體的粒子具有不同形狀,多呈圓形或者橢圓形,分布基本均勻,分散性較好。圖3(c)中可明顯看到HT納米脂質體內部具有層狀囊泡即同心圓的指紋狀結構,其原因可能是膽酸鈉的作用,使得脂質體雙分子的變形性提高。

a.2 μm;b.500 nm;c.100 nm

基于已有研究[24]及本研究工藝優化及性能分析結果可知:HT柔性納米脂質體將是一種有前途的、更高效的、更安全的遞送系統,可用于保護生物活性羥基的損失,從而實現人體內的靶向遞送,其可以在改善羥基酪醇的低化學穩定性、吸收性和生物利用度的前提下,更大程度地利用自身優勢,透皮給藥到所需的特定部位,避免肝臟首過效應,減少毒性。

2.3 貯藏穩定性結果分析

為了評價HT柔性納米脂質體的貯藏穩定性,測定HT柔性納米脂質體在不同溫度和不同時間的包封率、粒徑、PDI和Zeta電位,結果如圖4所示。

a.包封率encapsulation efficiency; b.粒徑grain size; c.PDI; d.Zeta電位Zeta potential圖4 HT柔性納米脂質體的貯藏穩定性

由圖4(a)可知,隨著貯藏時間的增加,包封率整體呈現下降趨勢,且溫度越高,HT柔性納米脂質體包封率下降越快;在4 ℃條件下,貯藏28 d時包封率由46.78%下降到37.56%,下降趨勢相對于25和60 ℃較為緩慢,原因可能是溫度的升高,加速了脂質體膜材的分子熱運動,使得脂質雙分子層的酰基側鏈從有序排列到無序,導致脂膜由凝膠狀態變成液晶態,膜的橫切面增加,雙分子層的厚度減小,膜流動性增加,導致包埋的HT發生泄露[25]。

在圖4(b)可知,隨著貯藏時間的增加,粒徑整體上呈現上升趨勢,但溫度越高粒徑增加越快速;4 ℃下,貯藏28 d后,粒徑從104.7 nm增加到152.7 nm,而60 ℃下的粒徑則增加到了1 084.5 nm。原因可能是貯藏時脂質體體系受溫度影響,導致磷脂膜之間發生了融合、聚集等現象,使其在用激光粒度儀檢測時檢測的是融合后的聚集體,顯示粒徑變大[26]。

PDI是聚合物分散性指數,用于描述聚合物相對分子質量分布,值越大,相對分子質量分布越寬,值越小,相對分子質量分布越均勻。由圖4(c)可知,隨著貯藏時間的增加,PDI整體上呈現增加趨勢,溫度越高,增加越明顯,值越大,說明體系中脂質體分布越不均勻,原因可能也是貯藏時脂質體體系受溫度影響,導致磷脂膜之間發生了融合、聚集等現象[26]。

Zeta電位是表征膠體分散系穩定性的重要指標,能夠度量顆粒之間相互排斥或吸引的力的強度,粒子越小,Zeta電位的絕對值(正或負)越高,體系越穩定,即溶解或分散可以抵抗聚集的能力越強。一般情況,當Zeta電位的絕對值大于40 mV時,說明體系具有較好的穩定性,由圖4(d)可知,隨著貯藏時間的增加,Zeta電位絕對值整體上呈現下降趨勢,溫度越高,其絕對值越低,說明較高的溫度極大破壞了體系的穩定性,原因可能也是貯藏時脂質體體系受溫度影響,導致磷脂膜流動性增強,由凝膠狀態變成液晶態,粒子表面電位發生改變,導致Zeta電位絕對值減小。

根據脂質體在4、 25和60 ℃貯藏28 d后的貯藏穩定性結果可知,該脂質體在4 ℃下貯藏各項指標均優于25和60 ℃,說明HT柔性納米脂質體是一個熱不穩定體系,低溫比較有利于HT柔性納米脂質體的穩定貯藏。

3 結 論

3.1利用薄膜分散法制備羥基酪醇(HT)柔性納米脂質體,以其包封率為響應值,通過單因素試驗、Plackett-Burman試驗和Box-Behnken響應面優化試驗,得到制備HT柔性納米脂質體的較佳工藝條件為:HT用量1.5 mg、氫化卵磷脂與膽固醇質量比為3.3∶1、FA-F127用量為1 mg、膽酸鈉用量為20.6 mg、超聲波功率為10%(總功率650 W)、超聲波作用時間為11 min,此時制備的HT柔性納米脂質體平均包封率為46.78%。

3.2HT柔性納米脂質體的結構表征結果顯示:HT柔性納米脂質體是有利于載藥和包埋的,HT負載增強了空白脂質體的熱穩定性,其粒子的微觀結構多呈圓形或者橢圓形,分散性良好,且可見同心圓的指紋結構,將是一種有前途的更高效更安全的遞送系統。

3.3較優工藝條件下制備的HT柔性納米脂質體平均粒徑為104.7 nm、PDI為0.231、Zeta電位為-42.5 mV。在4、 25和60 ℃分別貯藏28 d后發現:4 ℃比較有利于HT柔性納米脂質體的穩定貯藏。