電針神庭、百會穴對腦缺血再灌注后學習記憶障礙大鼠皮質區內LC3Ⅱ和Beclin-1的影響

黃金 王欣雨 高玲莉 馮曉東,2

(1河南中醫藥大學,河南 鄭州 450000;2河南中醫藥大學第一附屬醫院)

腦卒中是中樞神經系統(CNS)中對人類健康嚴重威脅的疾病之一,具有發病率高、致殘率高、死亡率高等特點〔1〕。認知障礙是腦卒中最常見的并發癥之一,嚴重影響了腦卒中患者的生活質量。經過大數據統計發現約64%的腦卒中后遺癥患者存在認知功能障礙〔2〕,約24%的腦卒中患者可能會發展為嚴重的認知功能障礙〔3〕。認知功能是高等動物腦功能在定向力、計算力、記憶力和學習能力等方面的綜合性表達,腦卒中后認知功能障礙(PSCI)在臨床常表現為患者具有不同程度和類型的計算、學習記憶能力等障礙,其歸屬于血管性認知功能障礙范疇。認知功能障礙在腦缺血再灌注大鼠群體中主要體現在學習記憶功能的障礙。近年來有關自噬在腦缺血再灌注損傷的作用機制中的研究成果顯著,有研究發現,當器官發生缺血再灌注損傷時,機體會上調自噬水平,從而達到保護機體的目的。 因此,本研究擬通過觀察電針神庭、百會穴后腦缺血再灌注大鼠皮質區自噬體及溶酶體的形成及自噬微管相關蛋白輕鏈3抗體(LC3)Ⅱ和酵母Atg6基因在哺乳動物中的同源類似物(Beclin)-1的水平〔4〕來拓展自噬在腦缺血再灌注損傷中的研究。

1 材料和方法

1.1實驗動物 45只清潔級健康成年SD大鼠,雄性,體質量(260±20)g,由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供,實驗動物許可證號:SCXK(京)2016-0011,于2018年7月20日至8月2日由河南省中醫藥大學第一附屬醫院中心實驗室飼養,實驗單位許可證編號:SYXK(豫)2015-0005。喂養條件為無菌環境,室溫恒定、控制為25 ℃,SD大鼠自由進食和飲水。造模前適應性喂養1 w后進行取材。

1.2實驗儀器 7300 型實時熒光定量PCR 儀(美國ABI 公司);Mini PROTEAN 型電泳儀及轉膜儀Powerpac Universal型電泳系統、YCYCLER 型梯度PCR 儀(美國BIO-RAD 公司);高速離心機LUMACCP100WX(江蘇海門市其林貝爾儀器制造有限公司);全自動超薄切片機LEICA EM UC(孚光精儀有限公司);組織處理機EM TP(徠卡顯微系統上海貿易有限公司);日本透射電子顯微鏡JEM-1400(上海鑄金分析儀器有限公司)。

1.3實驗試劑 Gluta固定液(電鏡專用,2.5%)(北京索萊寶科技有限公司,批號:P1126);鋨酸、環氧樹脂(Sigma-Aldrich上海貿易有限公司,批號:419494、45347);兔IgG抗辣根過氧化物酶(HRP)二抗、LC3Ⅱ(美國GeneTex公司,批號:CTX213110-0、GTX127375);十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)試劑盒、5×Tris-甘氨酸電泳緩沖液、10×電泳轉移緩沖液、10×TBST緩沖液、彩虹245廣譜Marker 2×250 μl、二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測定試劑盒 500孔 solarbio、高效cDNA第一鏈合成試劑盒反轉錄、SYBR GREEN Master Mix熒光定量PCR試劑盒、PAGE預制膠、超純RNA提取試劑盒(北京索萊寶科技有限公司,批號:P1200-50、T1070-500、D1060-500、T1081-500 ml、PR1930-100、PC0020-500、R211-01、Q111-02、G00002、SN-0301)。

1.4動物分組和模型制備 將45只大鼠按照隨機數字表法分為電針組、模型組和假手術組各15只。對直徑為0.24 mm的線栓頭部進行加熱,制成光滑圓鈍的圓頭狀,在距離頭端18～20 mm處作一標記,隨后放置在避光的肝素中備用。造模前所有大鼠禁食12 h,自由飲水。大鼠稱重后,用10%水合氯醛以3 ml/kg劑量行腹腔注射進行麻醉。將大鼠以仰臥位固定于鼠板,備皮,碘伏消毒,于頸部正中線作一縱向切口,鈍性分離皮下組織和腺體,暴露并分離出頸總動脈(CCA)、頸外動脈(ECA)和頸內動脈(ICA),注意保護CCA旁的迷走神經。用羊腸線分別結扎CCA和ECA近心端,用動脈夾夾閉ICA遠心端。用顯微剪刀在CCA近分叉處作一小切口,將制備好的線栓經切口處插入,經CCA分叉處進入ICA,進入18～20 mm處稍感阻力時停止插栓。此時用提前備好在ICA近心端的羊腸線結扎ICA近心端,以防出血。頸部傷口用4-0縫合線行常規縫合。2 h后行再灌注,將線栓輕柔回抽至CCA分叉處。術中和術后將室溫控制在25 ℃左右。術后造模大鼠進行單籠飼養。假手術組僅切開頸部皮膚,暴露并游離出CCA、ECA和ICA,然后消毒切口,并用4-0縫合線進行縫合。造模后腹腔注射慶大霉素2 U/只,連續注射3 d,以預防術后感染。按照0.1 mg/kg劑量注射呋塞米,防止術后出現腦水腫。

1.5干預措施 電針組造模后回籠飼養,自由進食和飲水。參考《實驗針灸學》〔5〕中的定位的方法去選取“神庭”及“百會”穴,應用GM101電針儀,電壓峰值6 V,以針體輕輕抖動為度,疏密波,頻率1～20 Hz,每次30 min,每日1次,術后2 h開始進行,直至大鼠被處死。模型組造模成功后回籠飼養,自由進食和飲水。只給予同等條件抓取,不進行電針治療。假手術組造模后回籠飼養,自由進食和飲水。只給予同等條件抓取,不給予任何治療。

1.6神經功能學評分 采用Longa等〔6〕評分法在腦缺血再灌注損傷后2 h,對蘇醒大鼠進行神經功能缺損癥狀進行評分,0分無神經損傷癥狀,1分不能完全伸展對側前爪,2分向偏癱側轉圈,3分行走時向偏癱側傾倒,4分不能自發行走,意識喪失。0分和4分均認為造模不成功。將1～3分造模成功的大鼠納入實驗。造模成功大鼠分別于造模后第3、7天進行神經功能學評分。評分工作由對實驗分組不知情的工作人員進行。

1.7透射電鏡觀察超微結構 大鼠經10%水合氯醛行腹腔麻醉后,打開胸腔并暴露心臟,剪開右心耳,從左心室依次灌注0.9%生理鹽水,直至流出液變清澈,后用4 ℃多聚甲醛500 ml進行固定,待大鼠四肢逐漸出現抽搐或者四肢僵硬時,說明灌注成功。于冰塊上斷頭取腦,迅速剝離腦組織,找到皮質部,并將皮質部組織切成1 mm3大小的正方體(取材要求快、準、穩),迅速用牙簽將樣品移至盛有2.5%戊二醛溶液的1.5 ml離心管中,固定4 h。后將樣品用0.1 mol/L pH7.0磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗4次,每次10 min。1%鋨酸固定2 h吸出固定液后,再用0.1 mol/L pH7.0的PBS漂洗4次,每次10 min。用梯度濃度(50%、70%、80%、95%)乙醇溶液中進行脫水處理,每個濃度處理10 min,再用100%乙醇溶液處理20 min,最后用100%丙酮處理20 min。用環氧樹脂812進行包埋并在常溫條件下過夜。 后用牙簽取出經滲透處理的樣品至預先盛有300 μl包埋劑的0.5 ml干燥離心管中,分別于37 ℃和45 ℃條件下各聚合12 h,再于60 ℃條件下聚合24 h。后用徠卡EM UC 7超薄切片儀進行修塊、切片,再用飽和醋酸雙氧釉水溶液染色20 min。雙蒸水沖洗、烘干后再用檸檬酸鉛溶液染色10 min。再用雙蒸水沖洗和烘干,最后用日本透射電子顯微鏡JEM-1400拍照觀察。

1.8Western印跡檢測大鼠皮質區LC3Ⅱ和Beclin-1的蛋白表達 大鼠經10%水合氯醛腹腔麻醉后,用生理鹽水進行心臟灌注后于冰上斷頭取腦,迅速剝離腦組織并分離出皮質區,后放入盛有液氮的容器中,然后轉存至-80 ℃冰箱以備用。①組織蛋白的提取:取大鼠腦組織200 mg,加入含苯甲基磺酰氟(PMSF)的裂解緩沖液2 ml,于1 500 r/min、4 ℃條件下離心5 min,吸取上清液置于離心管中,后取少量上清液用于BCA法測蛋白濃度,其余上清液按每100 μl加入33.3 μl 4×上樣緩沖液混勻,于沸水浴中放置10 min,分裝后-80 ℃存放。②制備SDS-PAGE:將電泳所需的試劑和儀器恢復至室溫;并清洗和干燥電泳所需的玻璃板,后將其進行固定;配制10 ml 12%分離膠〔ddH2O 3.3 ml、30%丙烯酰妥(4 ℃避光)4.0 ml、1.5 mol/L Tris-HCl溶液(pH8.8)2.5 ml、10%SDS 0.06 ml、10%過硫酸銨(后加) 0.12 ml、四甲基乙二胺(后加)0.006 ml〕和4 ml 5%濃縮膠〔ddH2O 2.8 ml、30%丙烯酰胺(4 ℃避光) 0.66 ml、0.5 mol/L Tris-HCl溶液(pH6.8) 0.50 ml、10%SDS 0.06 ml、10%過硫酸銨(后加) 0.06 ml、四甲基乙二胺(后加) 0.005 ml〕;倒掉去離子水覆蓋液,并用吸水紙把殘留液體吸去,垂直放置凝膠板,加入5%濃縮膠,插入樣品梳,室溫下凝膠約40 min,后拔去梳子將玻璃板凹面緊貼電泳槽,兩側用夾子固定;③樣品變形及電泳:從-80 ℃冰箱取出適量的樣本組織,插入冰中待其融化,根據蛋白定量結果,加入相應體積的5×蛋白質凝膠電泳上樣緩沖液,輕輕混勻后,在95 ℃下變性10 min,后立即插入冰中待用,后將蛋白樣品加入凝膠孔中,電泳儀設置為穩壓狀態,接通電源,將蛋白樣品加入混有電泳液的電泳槽中,垂直緩慢加入,添加適量的電泳液后,蓋上電泳蓋子;打開電泳儀開關進行電泳。④凝膠轉膜及檢測:上述操作結束后,把電泳得到的蛋白條帶轉印到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上,繼而分別通過一抗和二抗進行孵育檢測;遵循膠在負極,膜在正極的原則(60 V,130 mA,1 h)按照濕轉法進行轉印。⑤封閉:將膜用PBS沖洗10 min后用5%脫脂奶粉搖動封閉1 h;⑥一抗反應:將一抗按照1∶10 000稀釋后,于封閉液中將膜取出,濾紙吸去殘留液,將膜于雜交袋中4 ℃孵育過夜;⑦洗膜:用1×TBST在室溫下搖床上洗3次,時間分別為10 min×3次;⑧二抗反應:將洗滌后的一抗反應膜放入二抗工作液(1∶10 000)中,室溫、避光下緩慢搖動60 min;⑨洗膜:步驟同⑦,洗去游離的二抗;⑩曝光洗片,用ImageJ軟件分析其灰度值。

1.9實時熒光定量-聚合酶鏈反應(RT-PCR)檢測大鼠皮質區LC3Ⅱ和Beclin-1 mRNA水平 樣本處理:SD大鼠常規麻醉后,于冰上迅速取出大腦并剝離出海馬組織,將其放入盛有適量液氮的容器內,再轉存至-80 ℃的冰箱內備用。取20～50 mg的海馬組織放入1.5 ml EP管內,在其中加入1 ml Trizol迅速研磨,震蕩30 s,后再向EP管內加入三氯甲烷40 μl,在振蕩器上振蕩15 s以實現充分混勻,將離心機調至4 ℃、12 000 r/min的參數下離心3 min,后用移液槍吸取上清液200 μl放入新的EP管內,加入等量預冷的無水乙醇,再在振蕩器上充分混勻,在25 ℃條件下將離心管靜置10 min,繼續在4 ℃、12 000 r/min參數設定的離心機內離心10 min,丟棄濾液后,可見離心管底部有少量沉淀物質析出,后在離心管內加入600 μl的洗滌緩沖液溶液,在上述離心機的參數條件下繼續離心1 min,棄濾液,再用600 μl的洗滌緩沖液溶液在同等條件下進行離心,棄濾液,為了徹底去除廢液,需把核酸純化柱空管放在12 000 r/min的離心機內離心1 min,取出核酸純化柱空管,將其放入1.5 ml新的無RNA酶的EP管內,后向EP管內加入無核糖核酸水50 μl,25 ℃下靜止1～2 min后,在4 ℃、12 000 r/min條件下繼續離心1 min,收集濾液獲取總的RNA量。配制第一鏈cDNA合成反應液,反應體系為20 μl,取計算得到的 RNA樣本于EP管內,后向管內加入相對應的無核糖核酸水,將溶液補足到12 μl。按照以下條件完成第一鏈cDNA的合成反應:25 ℃,5 min;50 ℃,15 min;85 ℃,5 min。qPCR體系配制實驗所需的液體〔AceQ qPCR SYBR Green Master Mix 10.0 μl、引物1(10 μmol/L)0.4 μl、引物2(10 μmol/L)0.4 μl、參比染料10.4 μl、模板DNA 2.0 μl、滅菌蒸餾水補足至20.0 μl〕,將所有液體加入EP管內后放在振蕩器上充分混勻后置于離心機內進行離心,最后放置于PCR儀上。PCR擴增體系總量為20 μl,其中cDNA模板 2.0 μl,正向引物0.4 μl,反向引物0.4 μl,反應混合物10 μl,無菌蒸餾水6.8 μl。設定擴增程序:預變性:95 ℃,5 min;95 ℃,10 s。循環反應參數:退火/延伸溫度60 ℃,30 s;95 ℃,15 s,共40個循環。融解曲線參數:100 ℃,60 s;95 ℃,15 s。記錄每個管內腦組織樣本所產生的Ct值,計算出每個樣本相應的Ct值,得出每個蛋白相應的mRNA量。

1.10統計學分析 采用SPSS22.0軟件進行單因素方差分析、LSD-t檢驗、秩和檢驗。

2 結 果

2.1神經功能學評分 假手術組模型制備后,無神經功缺損癥狀,神經功能學評分為0分;電針組腦缺血再灌注損傷后經電針神庭和百會穴后,于第7天神經功能學評分明顯降低,差異具有統計學意義(P<0.05)。假手術組造模前后均無死亡,電針組在造模后死亡1只,模型組造模后死亡3只。見表1。

表1 各組神經功能學評分比較(n)

2.2透射電鏡觀察超微結構 電針組病灶周圍的神經細胞內有大量溶酶體及自噬體或二者的結合物形成,線粒體腫脹或呈球形,且線粒體嵴的結構排列錯亂甚至消失。粗面內質網分布散亂無規則,且多呈囊性變,其周圍存在大量游離核糖體。高爾基體腫脹、結構排列紊亂,且其弓形結構大部或者完全消失。同時,皮質區可觀察到含有大量吞噬物的膜性結構(即自噬體)存在。與模型組相比較,電針組皮質區自噬體及溶酶體數量明顯增加;模型組大腦皮質區溶酶體數量高于假手術組。見圖1。

紅色圓圈內的結構為自噬體或者自噬體與溶酶體的結合物圖1 3組皮質區顯微結構比較(×30 000)

2.3各組皮質區LC3Ⅱ及Beclin-1蛋白及mRNA表達 與模型組相比,電針組腦缺血再灌注后損傷后皮質區LC3Ⅱ及Beclin-1蛋白和mRNA水平均明顯升高(P<0.05);模型組腦缺血再灌注后損傷后皮質區LC3Ⅱ及Beclin-1蛋白和mRNA水平均顯著高于假手術組(P<0.05)。見表2、圖2。

圖2 3組皮質區LC3Ⅱ和Beclin-1蛋白水平

表2 各組LC3Ⅱ和Beclin-1蛋白及mRNA表達水平

3 討 論

腦卒中在祖國醫學中屬“中風”范疇,身居“風、癆、臌、膈”四大疑難雜癥之首。中醫古籍對腦卒中后認知障礙并無明確記載,但是,認知障礙在中醫學古代文獻中多散見于“健忘”“善忘”“呆病”“遺忘”等證中〔7〕。腦卒中后認知障礙基本病機以腎虛為本,血瘀痰濁為標,病位在腦。治療應以活血化瘀,開竅醒神,補腎為先,精氣為重。

電針治療是一種將毫針刺激與電生理效應結合的治療方法,與普通針刺相比,行針時間長,刺激量強,針感持久,方便靈活調整刺激量。本研究所選取的“神庭”“百會”二穴均歸屬督脈。督脈是奇經八脈之一,陽脈及全身經脈之海。神庭穴:作為督脈、足太陽、陽明之會,定位在頭部,發際直上1.667 cm(0.5寸)處,具有凝神醒腦、平喘降逆的作用;百會穴:頭部發際線正中直上16.667 cm(5.0寸),或頭頂正中與兩耳尖連線的交點處,為督脈、足太陽之會,能夠平衡人體陰陽。神庭穴,又名天庭穴,古人云“神者,智之淵也”,認為神庭“神處其中則靈,靈則應,應則保身。”特別在治療神志方面的疾病,神庭穴療效尤佳。百會穴,別名三陽五會,位于人體頭部正中,與大腦功能關系密切;百脈之會,貫達全身;頭為諸陽之會,百脈之宗,而百會穴則為各經脈之氣會聚之處;穴性屬陽,又于陽中寓陰,故能通達陰陽脈絡。針刺百會可增強記憶功能,醒腦開竅;針刺神庭具有寧神、開竅之用。本課題組通過前期大量基礎實驗研究〔8～12〕及臨床觀察〔13,14〕發現電針神庭、百會二穴對PSCI的改善情況密切相關。

自噬是廣泛存在于真核細胞內的一種溶酶體依賴性的降解途徑,以應激和損傷時更為顯著;也是機體清除過量、老化蛋白質及受損細胞器的重要途徑。適度的自噬是細胞完成自身代謝和細胞器更新的重要方式,對維持機體內環境穩定及調控細胞損傷和老化具有重要意義〔15〕。Beclin-1是自噬基因,作為自噬的執行者,Beclin-1蛋白除了接受自噬信號,還可接受其他信號對自噬進行調節,用Beclin-1作為自噬標記物,也是檢測自噬的常用指標〔16〕。LC3Ⅱ含量反映細胞內自噬水平〔17〕。透射電鏡下自噬全過程尤其是雙層膜結構,是檢測自噬體的金指標〔18〕。Lu等〔19〕通過建立腦缺血再灌注模型后通過Western印跡法研究發現自噬標志物Beclin-1和LC3表達均顯著升高,從而證明了在大腦皮質損傷的過程中自噬所發揮的重要作用。孔瑩等〔20〕發現,針刺百會穴可以提高AD大鼠Beclin-1和LC3Ⅱ的表達,從而改善AD大鼠的學習記憶能力。

本研究結果說明,大鼠經過氧化應激反應后體內會產生一種自我保護性機制,進而達到機體自我保護與修復的作用,電針神庭、百會穴對機體在氧化應激刺激后能產生一種較機體本身更高的保護性機制,從而達到腦保護和神經保護作用。電針治療后,大鼠皮質區溶酶體增多,能夠清除一些對機體有害的物質進而產生保護作用。

綜上,自噬在腦缺血損傷后所發揮的保護性作用,適度的自噬對機體是一種保護性機制,但過度自噬卻對機體造成進一步的損害。那么如何控制把握自噬的程度仍是目前基礎研究中亟待解決的問題。