G蛋白耦聯受體激酶2在MPTP誘導的PD模型小鼠紋狀體中的作用機制

周暢 王埮 許葉 趙振強 張海英 馬媛媛 陳志斌

(1海南醫學院第一附屬醫院神經內科,海南 海口 570102;2海南醫學院;3海南熱帶腦科學研究與轉化重點實驗室)

帕金森病(PD)是由于中腦黑質區多巴胺能神經元的丟失導致分泌至紋狀體區多巴胺不足所引起的一系列癥狀的中樞神經系統退行性疾病〔1〕。目前主要的治療藥物是外源性補充多巴胺或通過激活多巴胺受體來改善PD癥狀,多巴胺主要通過作用于紋狀體的中棘神經元的多巴胺受體參與運動功能的調控,其中表達多巴胺2受體(D2R)的神經元所介導的間接通路對運動功能調節十分重要〔2〕。D2R下游通路調節存在功能選擇偏向性,其功能和調節機制非常復雜。大多數條件下D2R激動后通過G蛋白介導的信號通路引起下級信號級聯反應,但當G蛋白耦聯受體激酶(GRK)2升高時D2R偏向于通過與β-抑制蛋白結合介導信號傳遞〔3〕。GRK2在多種組織中表達,并參與許多細胞和生理過程。GRK2參與線粒體介導的細胞凋亡和細胞存活機制調節,其上調或下調與多種疾病的發病機制密切相關,如心血管疾病、糖尿病、腫瘤〔4～7〕。但是截至目前,GRK2在PD發病過程中扮演何種角色尚不清楚,本文使用1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶(MPTP)制備慢性PD小鼠模型,探究紋狀體D2R和GRK2蛋白表達情況,為進一步探討GRK2在PD發病中的作用機制奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1實驗小鼠 20只雄性SPF級C57BL/6小鼠,體質量(20.75±0.86)g,約8周齡,由長沙市天勤生物技術有限公司提供。在室溫(22±2)℃和相對濕度為(60±2)%的環境中飼養,12～12 h人工晝夜節律,小鼠自由飲水和取食。

1.2主要材料和儀器 MPTP購自美國Sigma公司;兔抗酪氨酸羥化酶(TH)抗體、兔抗磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)抗體、山羊抗兔抗體購自英國Abcam公司;兔抗D2R抗體購自美國博士德生物公司;兔抗GRK2購自美國GeneTex 公司;苯甲基磺氟(PMSF)、RIPA蛋白裂解液、磷酸酶抑制劑、電化學發光(ECL)底物試劑盒購自中國biosharp公司;Millipore的聚偏氟乙烯(PVDF)膜;全自動凝膠圖像分析系統使用上海tanon科技有限公司;小鼠曠場實驗軌跡分析儀器購自上海欣軟信息科技有限公司;自制小鼠爬桿實驗器材。

1.3分組和模型制備 20只雄性小鼠適應性喂養1 w后隨機分為兩組,每組10只,PD模型組小鼠腹腔注射MPTP 30 mg/kg(MPTP配成3 mg/ml濃度溶液備用),對照組腹腔注射0.2 ml等體積生理鹽水,2次/w,共5 w,共10次。MPTP腹腔注射給藥結束后,對所有小鼠進行行為學檢測,評估運動功能和焦慮行為。

1.4曠場實驗 將小鼠單獨放置在場地中央由白色亞克力板構成的露天場地(45 cm×45 cm×40 cm),正上方放置攝像機使用視頻跟蹤軟件(Smart3.0)分析記錄,分析儀自動分析小鼠行為軌跡,包括活動總距離、穿越中心格次數和距離,每只小鼠觀察5 min。為消除前只小鼠殘留氣味的影響,兩次實驗間用 75%酒精和水清潔。

1.5爬桿實驗 自制長50 cm、直徑1 cm的木桿頂端放置直徑2.5 cm泡沫小球,木桿表面用紗布纏繞。正式實驗開始前對小鼠進行為期3 d的適應性訓練,將小鼠頭朝上放在球頂端,記錄小鼠雙前肢接觸平臺的時間。重復3次,取平均值,每次實驗間隔大于1 min。若本次實驗小鼠中途停頓或調轉方向則此次結果不計。

1.6酶聯免疫吸附試驗(ELISA)和Western印跡檢測 小鼠麻醉后眼球取血,冰上取黑質和紋狀體,液氮速凍后放-80 ℃保存。精確稱取腦組織后按比例放入PMSF、RIPA后勻漿器研磨、超聲裂解,冰上搖床15 min,4 ℃離心15 min,提取上清液,得到總蛋白。二喹啉甲酸(BCA)試劑盒測蛋白濃度(中國碧云天)。取血清和中腦黑質蛋白提取物進行ELISA檢測,具體步驟參照試劑盒(購自英國Abcam公司)。紋狀體提取總蛋白按比例加入上樣蛋白緩沖液,煮沸4 min。每孔加入40 μg蛋白,8%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE),PVDF轉膜90 min,常溫封閉,一抗(抗TH抗體、抗GRK2抗體、抗D2R抗體)孵育過夜,次日Tris鹽酸緩沖液吐溫(TBST)洗膜后室溫孵育二抗90 min后顯影。采用ImageJ進行條帶灰度值分析。

1.7免疫組化 小鼠5 %水合氯醛麻醉后冰生理鹽水和多聚甲醛溶液灌注后取腦,多聚甲醛固定24 h后,石蠟包埋分別制備中腦黑質和紋狀體部位蠟塊。石蠟切片厚度約5 μm,經脫蠟復水、抗原修復、血清封閉等步驟后,一抗(抗TH抗體、抗GRK2抗體、抗D2R抗體)4 ℃孵育過夜,二抗常溫孵育1 h,二氨基聯苯胺(DAB)顯色,蘇木素復染,乙醇梯度脫水,二甲苯透明后封片(期間避免干片)。顯微鏡下觀察染色情況,采用ImageJ進行平均光密度(AOD)值測量分析。

1.8統計學分析 采用SPSS20.0軟件進行獨立樣本t檢驗,GraphPad prism8和Adobe illustrator軟件制圖。

2 結 果

2.1MPTP影響運動功能和焦慮行為 在曠場實驗中,與對照組比較,模型組自發活動總距離、穿越中心格次數和距離明顯減少(P<0.001)。在爬桿實驗中,模型組爬桿時間比對照組明顯延長(P<0.001)。見表1。

表1 兩組曠場實驗、爬桿實驗比較

2.2MPTP降低血清和中腦TH酶含量 ELISA結果顯示,與對照組(166.17±2.50、203.81±3.30)比較,模型組血清及中腦TH值(149.12±2.95、156.38±4.54)顯著降低(均P<0.001)。黑質部位組化圖譜可見,與對照組(0.56±0.20)相比,模型組多巴胺神經元TH染色變淺,通過ImageJ得出AOD值(0.42±0.42)顯著降低(t=5.81,P= 0.003)。見圖1。

圖1 兩組TH、D2R及GRK2免疫組化

2.3MPTP減少小鼠紋狀體D2R表達 Western印跡顯示,模型組紋狀體D2R表達較對照組顯著減少(P<0.05);免疫組化顯示,模型組紋狀體D2R的AOD值較對照組顯著降低(P<0.001)。見圖1、圖2、表2。

圖2 Western印跡檢測兩組D2R及GRK2蛋白表達

表2 兩組D2R及GRK2表達比較

2.4MPTP增加紋狀體GRK2蛋白表達 Western印跡顯示,模型組紋狀體GRK2蛋白表達較對照組明顯增高(P<0.05);免疫組化顯示,模型組紋狀體GRK2的AOD值較對照組明顯增高(P<0.001)。見圖1、圖2、表2。

3 討 論

PD是一種同時累及運動和非運動系統的慢性神經系統退行性疾病,其累及的人口數量隨年齡的增加成倍增長,在 45～54 歲的人群中男性和女性的患病率均不到 1%,而在 85 歲以上的人群中男性和女性的患病率分別為4%和2%〔8〕。多巴胺能神經元的丟失是目前公認的病理標準,導致多巴胺能神經網絡失衡是引起臨床癥狀的重要原因〔9〕。研究表明,多巴胺信號主要通過D1R和D2R傳遞信號,其中在紋狀體表達D1R的中棘神經元參與的信號傳導通路又稱為直接通路,促進恰當的行為、習慣;表達D2R的神經元參與調節的通路又稱為間接通路,主要抑制不恰當的行為、習慣〔10～12〕。在PD狀態下多巴胺對兩種通路的選擇是存在偏倚的〔13〕。PD的發病與多種信號通路相關,其發病機制復雜至今尚未闡明,目前的治療主要是補充腦內多巴胺的不足及針對D2R的激動劑來改善PD患者臨床癥狀〔14〕,因此進一步研究D2R相關通路是今后的重點。

PD多以肌強直、姿勢異常、靜止性震顫、運動遲緩等為主要運動功能障礙伴或不伴焦慮、抑郁、嗅覺減退等非運動癥狀〔15〕。研究表明,MPTP可針對性的損害多巴胺能神經元的線粒體導致出現哺乳動物出現類PD的癥狀,其誘導的慢性PD動物模型除運動癥狀外還伴隨著焦慮等非運動癥狀,與人類PD的運動和非運動癥狀一致〔16,17〕。本研究使用MPTP誘導的慢性PD小鼠模型,能更好地反映PD的臨床癥狀和信號通路的改變。

模型通過行為學和病理學兩種方式來驗證。行為學方面,曠場實驗和爬桿實驗的結果提示,模型小鼠的運動功能受損,慢性PD模型小鼠存在焦慮行為〔18,19〕。本研究發現,慢性PD模型小鼠在曠場實驗中靜止時間較正常組長。以上行為學發現表明,慢性MPTP腹腔注射的臨床表現與PD癥狀相似。從病理學角度觀察,中腦多巴胺能神經元的丟失是目前公認的PD病理標準,其中TH是合成多巴胺的限速酶,TH的水平與多巴胺能神經元功能密切相關內容,TH表達下降是PD模型診斷的標準〔20〕。本研究結果顯示,模型小鼠血清和腦內TH表達明顯減少。從臨床表現和病理學兩方面證實了本實驗成功制備慢性PD小鼠模型。

神經遞質多巴胺是通過D2R發出信號,D2R是Gi/o蛋白耦聯受體,在整個大腦中廣泛表達以控制一系列行為,包括運動、動機、動作選擇和獎懲機制〔21〕。紋狀體D2R對運動輸出非常重要,間接通路中棘神經元D2R的缺失會以特定任務的方式損害運動活動,間接通路中棘神經元D2R調節神經元活動和突觸傳遞,影響自我發起行動的能力及執行這些反應的意愿和(或)活力。D2R的喪失可能導致多巴胺信號傳導受損,從而引起運動功能減退或特定自愿行為的啟動受損〔2〕。以上表明中棘神經元D2R的缺失與人類PD運動癥狀運動功能減退、啟動困難相似。D2R可通過激活G蛋白通路抑制高電壓激活鈣離子電泳(HVA Ca2+,在PD大鼠紋狀體中表達)〔22〕、鈉漏離子通道電流D2R(NALCN)〔21〕、內向整流鉀電流〔23〕降低神經元興奮性,調節運動行為。在中樞神經系統內除G蛋白信號通路外,D2R可通過招募β-抑制蛋白介導受體內化、降解,D2R與β-抑制蛋白結合是運動必需,并且D2R偏向與β-抑制蛋白結合可抑制小鼠依賴多巴胺誘導的運動〔24〕。G 蛋白和 β-抑制蛋白在D2R信號通路傳導中是單獨存在的,且在不同的條件下存在選擇偏倚〔25〕。綜上,D2R與β-抑制蛋白的結合可阻止D2R-G蛋白下游信號通路的傳導進而參與運動功能的調控,而如何調控D2R通路的選擇是治療帕金森病的關鍵。本文通過Western印跡和免疫組化發現模型組小鼠紋狀體D2R存在丟失,與既往文獻〔22〕報道相符。在PD狀態下紋狀體多巴胺含量減少,D2R表達減少,如何更好地使多巴胺與D2R結合,更多的選擇通過G蛋白傳遞信號而不是通過招募β-抑制蛋白傳遞信號傳導是研究的重點。

D2R可直接招募β-抑制蛋白介導受體內化,但這種招募與GRK2水平相關,只有在高水平GRK2的情況下才能促進β-抑制蛋白的招募,而在低水平GRK2的情況下表現為抑制β-抑制蛋白的招募〔26〕。GRK2磷酸化D2R,使其偏向信號β-抑制蛋白〔27〕。在PD小鼠模型中發現紋狀體內GRK2升高,而紋狀體內D2R表達減少,綜上推測GRK2升高使D2R偏向與β-抑制蛋白結合導致D2R表達減少,并影響D2R-G蛋白信號通路傳遞。對于D2R-G蛋白通路和β-抑制蛋白通路如何選擇及其在PD發病機制中發揮何種作用目前尚不清楚。目前所知D2R在正常和PD狀態下其數量和功能的變化至關重要,然而D2R在PD狀態下的功能變化目前尚未完全清楚,針對D2R信號通路的研究是研究PD發病機制的重要,針對性靶向GRK2可能會調節D2R功能變化引起的PD運動功能障礙。