UC001kfo通過靶向α-SMA對HeLa細胞增殖、遷移與侵襲的促進作用

任美穎 金燕 樊思軒 舒麗莎

(河北北方學院 1第一臨床醫學院,河北 張家口 075000;2附屬第一醫院婦科)

目前宮頸癌的被關注度越來越高,已成為全球女性惡性腫瘤第4位。根據癌癥報告指示,在2020年全球新發宮頸癌病例超過60萬,其中死亡病例超過30萬,嚴重威脅女性健康〔1〕。近年來,隨著人乳頭瘤病毒(HPV)疫苗的預防性接種、HPV感染篩查的逐漸普及、宮頸癌早期診治方面的極大改善,盡管在發達地區其發病率和病死率有所下降,但是在經濟落后地區仍呈上升趨勢〔2〕。高危型HPV持續感染是宮頸病變發生的主要病因,此外,癌基因的激活或抑癌基因的缺失對宮頸病變發展成癌的過程亦起關鍵作用〔3〕。因此,闡明宮頸癌發生發展的分子機制,研發宮頸癌靶向治療的新型標記分子至關重要。

長鏈非編碼RNA是非編碼RNA的子集,在轉錄和轉錄后水平均發揮作用,調控腫瘤細胞的分子生物學功能,獲得增殖、轉移及侵襲的能力。UC001kfo是一種長鏈非編碼RNA,可通過調控細胞增殖、分化等多種途徑參與肝癌、乳腺癌、肺癌等惡性腫瘤的進展〔4,5〕。目前關于UC001kfo在宮頸癌中的作用機制仍不明確,為此本實驗檢測UC001kfo在宮頸癌細胞系HeLa中的表達水平,研究UC001kfo對宮頸癌HeLa細胞生物學行為的影響,為宮頸癌分子靶向治療提供方向。

1 材料與方法

1.1細胞株 人宮頸上皮永生化細胞株H8購于中國協和醫科大學;人宮頸癌細胞株HeLa由河北北方學院生命科學研究中心細胞實驗室贈予。

1.2主要試劑 RPMI1640培養基、杜爾伯科改良伊格爾培養基(DMEM)、青鏈霉素合劑、0.25%胰蛋白酶乙二胺四乙酸(EDTA)購于美國Gibco公司;胎牛血清(FBS)購于上海ExCellBio公司;LipofectamineTM3000購于美國ThermoFisher公司;質粒、siRNA由蘇州吉瑪公司構建;引物均由生工生物工程公司合成;Trnzol、聚合酶鏈反應(PCR)試劑盒均購自北京天根生化公司;CCK-8試劑購自日本同仁公司;Transwell小室購自美國康寧公司;α-平滑肌肌動蛋白(SMA)抗體、波形蛋白(Vimentin)抗體、E-鈣黏蛋白(cadherin)抗體均購自北京博奧森公司。

1.3細胞培養 用RPMI1640完全培養基培養H8細胞,DMEM完全培養基培養HeLa細胞,在37 ℃、5%CO2飽和溫度條件下常規培養,待細胞生長狀態良好且融合至85%左右,用胰蛋白酶消化細胞,傳代后進行后續實驗。

1.4RT-PCR檢測UC001kfo在H8和HeLa細胞中表達水平 所有操作佩戴手套、口罩和帽子,在消毒滅菌后的超凈臺內進行,使用RNase-free的槍頭和EP管以防RNA快速降解。提前選取生長狀態良好的2種細胞種板,置于37 ℃恒溫培養箱孵育,待細胞密度達85%左右,TRNzol裂解細胞后提取總RNA,用超微量分光光度計檢測RNA濃度、純度。參照PCR試劑說明書將RNA反轉錄為cDNA,再以cDNA為模板,在95 ℃預變性3 min×1,95 ℃變性5 s,60 ℃退火/延伸31 s×40的條件下行PCR擴增,引物序列:UC001kfo正向引物:5′-GCCAACGCAAGAAGTTACCA-3′,反向:5′-CCAAATCATTCCTAGCCAAAG-3′;α-SMA正向引物:5′-CTGTCCACCTTCCAGCAGATGT-3′,反向:5′-GATTCGTCGTCCTGAGAAGTCG-3′;磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)正向引物:5′-TCGGAGTCAACGGATTTGGT-3′,反向:5′-TTCCCGTTCTCAGCCTTGAC-3′。采用 2-ΔΔCt方法分析相對表達量。

1.5細胞轉染 選取對數生長期的HeLa細胞,參照LipofectamineTM3000說明書分別將siUC001kfo.1、siUC001kfo.2、siUC001kfo.3、siRNA-NC、pCDNA3.1(+)-Vector及3種不同劑量LipofectamineTM3000的質粒轉染至HeLa細胞中,構建空白對照組、pCDNA3.1(+)-UC001kfo、pCDNA3.1(+)-Vector、siRNA-UC001kfo和siRNA-NC組。TRNzol裂解細胞并提取總RNA,RT-PCR分析UC001kfo的轉染效率,擇上調效果及干擾效果最佳轉染效率進行后續實驗。

1.6CCK-8檢測HeLa細胞增殖力 選取生長狀態良好的5組HeLa細胞轉染48 h后,用胰蛋白酶消化細胞,計數并接種于96孔板,各組均設5個復孔,待細胞融合至80%左右,分別待細胞培養至12、24、36、48、72 h后于每孔各加10 μl CCK-8溶液,混勻后再孵育2 h,用Fisherbrand測各孔細胞450 nm處光密度(OD)值。

1.7劃痕實驗檢測HeLa細胞遷移率 選取對數生長期的5組HeLa細胞轉染48 h后,用胰蛋白酶消化細胞,計數后接種于6孔板中,待細胞融合至95%左右,用10 μl槍頭在每孔各劃3條豎線,線段貫穿培養板整個孔,盡量保持各孔線段寬度一致。用磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗懸浮細胞和細胞碎片,每孔各加2 ml完全培養基,在倒置顯微鏡下拍照記錄并將其作為0 h細胞遷移狀況圖予以保存。分別孵育至24、48、72 h后測量劃痕寬度并記錄。

1.8Transwell檢測HeLa細胞侵襲 將Matrigel膠置于4 ℃冰箱中液化,用DMEM維持液按1∶3稀釋,每孔各加60 μl Matrigel膠稀釋液迅速鋪至預冷的Transwell小室內,覆蓋聚碳酯膜,于37 ℃孵育1 h,使Matrigel膠凝固。5組細胞用DMEM維持液饑餓12 h后,胰酶消化并離心,細胞計數為(1～5)×107個/L,每孔200 μl細胞懸液接種于Transwell上室;Transwell下室吸800 μl完全培養基。37 ℃恒溫培養24 h后,吸棄小室內培養基,用棉簽輕輕擦拭Matrigel膠,4%多聚甲醛固定20 min,0.1%結晶紫染色液染色15 min?；赥ranswell上下室的營養成分不同,通過趨化作用,待風干后,在倒置顯微鏡下觀察細胞侵襲能力后拍照記錄。

1.9RT-PCR檢測UC001kfo與α-SMA的表達相關性 提前將對數生長期的5組HeLa細胞接種于6孔板,于37 ℃培養箱中孵育,待細胞融合至50%進行轉染,48 h后提總RNA,檢測RNA濃度和純度。PCR步驟同前,引物序列見1.4,采用 2-ΔΔCt方法分析α-SMA相對表達量。

1.10Weatern印跡分析蛋白表達 收集生長狀態良好的6組〔pCDNA3.1(+)-UC001kfo、pCDNA3.1(+)-Vector、siRNA-UC001kfo、siRNA-NC、pCDNA3.1(+)-UC001kfo.3+siα-SMA及空白對照組〕HeLa細胞,并提取蛋白。以GAPDH為內參,十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)后轉膜;5%脫脂奶粉室溫封閉2 h;一抗4 ℃孵育過夜;二抗室溫孵育2 h;二氨基聯苯胺(DAB)顯色液顯色,AI600上機檢測條帶并保存圖像,ImageJ分析并計算灰度值。

1.11統計學方法 采用SPSS26.0軟件分析數據;GraphPad Prism5軟件繪圖。組間比較采用單因素方差分析和重復測量方差分析,組間多重比較用LSD-t檢驗。

2 結 果

2.1UC001kfo在宮頸癌HeLa細胞中顯著高表達 RT-PCR結果顯示,與H8細胞(1.001 7±0.072)相比,HeLa細胞中LncRNA UC001kfo表達水平(2.2219±0.153)顯著升高(t=12.466,P<0.01)。

2.2確定轉染效率 與siRNA-NC組(0.998±0.499)和空白對照組LncRNA UC001kfo表達水平(0.995±0.035)相比,siUC001kfo.1組(0.009±0.000 6)、siUC001kfo.2組(0.005±0.000 3)、siUC001kfo.3組中UC001kfo表達水平(0.007±0.000 3)明顯降低,以siUC001kfo.2組降低更顯著(F=1 187.404,P<0.05)。因此后續實驗選取siUC001kfo.2轉染至HeLa細胞沉默UC001kfo表達。與pCDNA3.1(+)-Vector組(1.036±0.132)和空白對照組(1.018±0.033)LncRNA UC001kfo表達水平相比,pCDNA3.1(+)-UC001kfo.1組(8.366±0.062)、pCDNA3.1(+)-UC001kfo.2組(11.051±0.083)、pCDNA3.1(+)-UC001kfo.3組中UC001kfo表達水平(24.091±0.262)明顯升高,以pCDNA3.1(+)-UC001kfo.3組升高最顯著(F=13 972.672,P<0.05)。因此后續實驗選取pCDNA3.1(+)-UC001kfo.3轉染至HeLa細胞來上調UC001kfo的表達。

2.3上調UC001kfo表達增強宮頸癌HeLa細胞增殖能力 CCK-8實驗結果顯示,不同時間pCDNA3.1(+)-Vector組、空白對照組和siRNA-NC組增殖活力大致相同;與pCDNA3.1(+)-Vector組相比,pCDNA3.1(+)-UC001kfo.3組OD值在各時間段均顯著增高(P<0.05),說明上調UC001kfo的表達可促進Hela細胞增殖力,且在72 h促進效果更顯著;相反,siRNA-UC001kfo.2組在各時間段的OD值均顯著低于siRNA-NC組(P<0.05),說明沉默UC001kfo的表達抑制其增殖力,且在72 h抑制效果較佳。見表1。

表1 不同時間UC001kfo對HeLa細胞增殖活力的影響

2.4上調UC001kfo表達增強宮頸癌Hela細胞遷移能力 劃痕實驗結果顯示,上調UC001kfo表達促進了Hela細胞的遷移能力;相反,沉默UC001kfo表達對Hela細胞的遷移能力具有抑制作用。與pCDNA3.1(+)-Vector組和空白對照組相比,pCDNA3.1(+)-UC001kfo.3組在細胞孵育24、48和96 h時劃痕面積愈合百分比明顯增高,且96 h較48 h促進效果更明顯(P<0.05);相反,與siRNA-NC組和空白對照組相比,siRNA-UC001kfo.2組細胞劃痕寬度顯著減小,且96 h較48 h抑制效果更顯著(P<0.05)。見表2、圖1。

表2 各組劃痕24、48和96 h遷移率及EMT相關蛋白表達比較

2.5上調UC001kfo表達增強宮頸癌Hela細胞侵襲能力 Transwell實驗結果顯示,上調UC001kfo表達促進了宮頸癌Hela細胞的侵襲;相反,沉默UC001kfo表達抑制了宮頸癌Hela細胞侵襲。與空白對照組單位面積侵襲細胞數目〔(341.333±27.301)個/視野〕相比,pCDNA3.1(+)-Vector組〔(477.333±52.814)個/視野〕和siRNA-NC組〔(337.000±30.806)個/視野〕從上室穿過多孔膜至下室的細胞數無顯著改變(P>0.05);與pCDNA3.1(+)-Vector組相比,pCDNA3.1(+)-UC001kfo.3組〔(1 814.333±143.040)個/視野〕單位面積侵襲細胞數目明顯增多;相反,與siRNA-NC組相比,siUC001kfo.2組〔(189.000±11.000)個/視野〕單位面積侵襲細胞數目顯著降低(F=267.743,P<0.05)。見圖2。

2.6UC001kfo與α-SMA mRNA在HeLa細胞中呈正相關 RT-PCR結果顯示,pCDNA3.1(+)-Vector組(1.089±0.167)、空白對照組(1.008±0.150)和siRNA-NC組中α-SMA mRNA(1.002±0.164)無顯著差異(P>0.05)。與pCDNA3.1(+)-Vector組和空白對照組相比,pCDNA3.1(+)-UC001kfo.3組α-SMA mRNA表達(2.682±0.020)顯著升高;與siRNA-NC組和空白對照組相比,siUC001kfo.2組α-SMA mRNA表達(0.304±0.052)顯著降低(F=143.533,P<0.05)。

2.7UC001kfo影響HeLa細胞EMT Western印跡顯示,與空白對照組及pCDNA3.1(+)-Vector組比較,pCDNA3.1(+)-UC001kfo.3組Vimentin和α-SMA蛋白表達顯著升高, E-cadherin蛋白表達顯著降低(P<0.05)。與空白對照組及siRNA-NC組比較, siUC001kfo.2組Vimentin和α-SMA蛋白表達顯著降低,E-cadherin蛋白表達顯著升高(P<0.05)。pCDNA3.1(+)-Vector組、siRNA-NC組和空白對照組Vimentin、α-SMA和E-cadherin蛋白表達無顯著性差異(P>0.05)。說明UC001kfo對宮頸癌HeLa細胞EMT過程具有促進作用。見表2、圖3。

1～5:pCDNA3.1(+)-UC001kfo.3組、pCDNA3.1(+)-Vector組、空白對照組、siRNA-NC組、siUC001kfo.2組圖3 UC001kfo影響Hela細胞EMT相關蛋白表達

3 討 論

宮頸癌是生殖系統好發的惡性腫瘤,高發人群越來越趨于年輕化〔6〕,有近99.7%已確診宮頸癌患者患有HPV感染〔7〕,在輔助因素中,低社會經濟地位、高生育率、多個性伴侶等均與宮頸癌的危險因素有顯著相關性〔8,9〕,此外,基因表達紊亂也起關鍵調控作用〔3〕。早期宮頸癌臨床治療效果較好,晚期宮頸癌預后較差,轉移和復發是病死的重要原因〔10〕,故以基因水平為出發點,研發新型用于宮頸癌診治的臨床生物標志物,使分子靶向治療在臨床上得到進一步完善。

長鏈非編碼RNA(lncRNA)是非編碼RNA的子集,缺乏保守的開放閱讀框架,不能編碼蛋白質〔11〕,研究顯示,lncRNA參與許多生物學和病理過程并發揮關鍵調控角色〔12〕。惡性腫瘤細胞的形成伴有大量基因紊亂,除了蛋白質編碼基因外,lncRNA也通過抑癌或促癌途徑參與眾多惡性腫瘤的進展〔13〕。UC001kfo是Pan等〔14〕從肝癌組織中篩選出來的一種lncRNA,該基因位于染色體Chr10(q3.31),共2 043 bp,通過體內外實驗發現UC001kfo在肝癌中顯著高表達,促進肝癌細胞的增殖與轉移。與之相反,UC001kfo在乳腺癌中起抑癌作用,其原因可能與不同腫瘤細胞所處微環境不同有關〔4〕。因此本研究推測,UC001kfo也可能通過抑癌或致癌途徑參與宮頸癌進展。本實驗推測UC001kfo可能在宮頸癌進展中起促癌作用,可能促進HeLa細胞的增殖與轉移。

α-SMA是一種參與細胞運動和維護的肌動蛋白,也是參與細胞骨架的主要成分之一。α-SMA表達陽性的肌纖維母細胞能分泌基質蛋白和尿凝血酶原激活物、胰島素樣生長因子-Ⅱ等細胞因子,促進腫瘤細胞的增殖和轉移。有研究發現〔15〕,UC001kfo和α-SMA在染色體上存在部分重疊位點。本研究也通過RT-PCR驗證這一結論,在轉染48 h后的各組HeLa細胞中,UC001kfo與α-SMA的表達量呈正相關。α-SMA參與EMT過程,腫瘤細胞能穿透基底膜到達間質,完成EMT過程,經淋巴轉移和血行轉移至其他臟器,對惡性腫瘤的轉移及進展起關鍵作用〔16〕。在此過程中,上皮細胞極性喪失,遷移和運動能力增強,同時上皮表型丟失而逐漸獲得間質表型。伴隨表型變化,許多基因的表達發生了改變,上皮表型相關蛋白如E-cadherin下降,間質表型相關蛋白如Vimentin、α-SMA等含量上升,同時一系列轉錄因子表達也發生變化。本研究提示,UC001kfo對宮頸癌HeLa細胞的EMT過程具有促進作用。

綜上所述,UC001kfo在宮頸癌HeLa細胞中顯著高表達,能促進HeLa細胞的EMT過程,從而參與腫瘤細胞的侵襲與轉移。因此UC001kfo可能在宮頸癌的進展中發揮促癌的調控角色,可能是新型用于宮頸癌診治的臨床生物標志物,為進一步完善分子靶向治療提供一定實驗依據。此外,關于UCOO1kfo與α-SMA的協同關系及調控途徑仍需進一步驗證和研究,今后我們將繼續以此展開實驗研究,提供治療宮頸癌更有效的憑據。