被動運動對KOA大鼠關節軟骨IL-1β、MMP-13表達的影響

陸永莉 李輝 王文彪,

(1新鄉醫學院,河南 新鄉 453000; 2新鄉醫學院第一附屬醫院)

膝關節骨性關節炎(KOA)是一種多種因素引起的、以關節軟骨變性破壞為主要特征的慢性、進展性關節疾病,其發病率、致殘率高,是導致老年人殘疾和生活質量下降的主要原因〔1～3〕。目前,KOA病因及發病機制尚不完全清楚,多認為與力學因素和生物學因素的相互作用導致關節軟骨細胞、細胞外基質和軟骨下骨的合成與降解失衡〔4～7〕,使膝關節周圍肌力下降、關節失穩和疼痛三者之間形成惡性循環有關〔8〕。運動療法作為物理治療中應用最廣泛的方法,不僅有助于阻斷這種惡性循環,減緩關節軟骨損害,還能提高關節穩定性,改善關節功能,減輕疼痛程度和活動受限〔9～11〕,提高患者膝關節活動能力和生活質量〔12,13〕,在臨床應用中效果顯著。手術誘導骨關節炎(OA)動物模型的證據也表明中度運動可以延遲軟骨退化的進展〔1〕。但目前研究多傾向于主動運動,忽略了被動運動對KOA的影響,關于被動運動的基礎實驗研究更是少見。

因此,本研究旨在從大鼠KOA模型角度驗證被動運動治療KOA的有效性,觀察被動運動對KOA大鼠關節軟骨白細胞介素(IL)-1β、基質金屬蛋白酶(MMP)-13表達的影響,探討被動運動治療KOA的機制,以期更好服務于臨床,為臨床康復治療KOA提供新的治療思路和治療方法。

1 材料和方法

1.1實驗動物 2～3月齡的健康雌性SD大鼠30只,體質量(300±30)g。適應性喂養1 w后,隨機選取10只作為空白組,其余20只采用關節腔內注射木瓜蛋白酶法制備KOA大鼠模型,并于造模完成后隨機選取10只造模大鼠作為被動運動組,給予被動運動干預,剩余10只為模型組。實驗動物質量合格證號:1107261911005590,實驗動物使用許可證號:SCXK(魯)20190003。本實驗于新鄉醫學院第一附屬醫院生命科學研究中心進行,實驗操作均符合新鄉醫學院動物實驗倫理委員會的要求。

1.2模型制備 采用關節腔內注射木瓜蛋白酶法造模〔14～18〕:在無菌條件下用0.9%氯化鈉溶液配制6%(W/V)木瓜蛋白酶溶液和 0.03 mol/L的L-半胱氨酸溶液,儲存于4 ℃冰箱,于實驗前4 h取出室溫放置,注射前30 min將6%的木瓜蛋白酶溶液和0.03 mol/L的 L-半胱氨酸溶液按2∶1的比例混勻。將模型組和被動運動組腹腔注射3%戊巴比妥鈉麻醉,麻醉成功后雙膝關節備皮、消毒、屈曲約45 °,從髕骨下緣前內側膝眼向髁間窩方向進針,明顯有落空感后,針尖抵達股骨內側髁再回撤2 mm,注入6%木瓜蛋白酶與L-半胱氨酸的混合溶液0.30 ml至右側膝關節腔。左側膝關節腔用同樣方法注射0.30 ml 生理鹽水作為對照。實驗開始后的第4、7天分別再注射1次。在注射完成后標準飼養大鼠28 d,模型造模完成。在造模完成后1 w,隨機抽取每組大鼠各2只處死,以檢驗造模成功與否。

1.3被動運動干預 戴上皮質捕鼠手套,用大拇指和食指固定大鼠頸部,食指和中指固定大鼠腹部,小指固定大鼠尾巴,剛好暴露大鼠四肢,且不影響其活動。然后另一手拉出大鼠右后肢,抓住大鼠趾部,使其與脊柱呈45 °并向后外方牽拉,直至大鼠右后肢完全伸直(膝關節、踝關節完全伸直),然后再向與牽拉方向相反的方向,將大鼠右后肢推向身體使之完全屈曲緊貼身體(膝關節完全屈曲,踝關節完全背曲),如此一個往復為一個周期。大鼠右后肢被動運動施加頻率為一天2次,每次不少于3 min,大鼠每側后肢每天共活動600個周期。整個過程中要動作輕柔,速度適中,全關節幅度活動,運動持續時間4 w〔19～21〕。

1.4標本獲取 將大鼠過量麻醉處死,仰位固定并打開右膝關節腔,分離前后交叉韌帶和內側副韌帶,截取大鼠膝關節股骨端附帶少量軟骨下骨作為標本,去除周圍軟組織,4%中性甲醛固定24 h,脫鈣完成后進行石蠟包埋,制成組織切片備用。

1.5主要觀察指標

1.5.1造模后一般情況觀察 肉眼觀察造模完成后每組大鼠的飲食、飲水、精神狀態、毛色的光澤度、自由活動情況等。

1.5.2大體觀察 解剖各組處死大鼠,充分暴露大鼠右側膝關節,觀察各組關節軟骨表面是否光滑、有無糜爛及潰瘍、色澤和透明度變化、有無纖維性增生及邊緣是否有骨贅形成等〔22〕。

1.5.3關節液的采集及IL-1β含量檢測 吸取0.2 ml生理鹽水于注射器中,沿關節間隙注射入關節腔,再回抽出生理鹽水與滑膜液的混合液,如此反復抽吸3次,收集抽取的液體,-80 ℃冰箱保存〔23〕。采用雙抗夾心酶聯免疫吸附試驗(ELISA)按照試劑盒嚴格操作檢測IL-1β含量。

1.5.4軟骨組織形態學觀察及Mankin評分 組織連續切片4～6 μm,分別行蘇木素-伊紅(HE)染色、甲苯胺藍染色及番紅O-固綠染色,熒光顯微鏡下觀察軟骨組織形態、細胞簇集及排列是否整齊、基質染色、軟骨表面裂隙及纖維化等情況。每個樣本分別于內、外側各取3張切片,測量軟骨表面至潮線表面厚度并對病理學切片進行Mankin評分〔24〕。

1.5.5軟骨細胞中MMP-13表達 采用免疫組織化學法,將連續切片置于烤片機上烤片1 h,脫蠟及水化后抗原修復30 min,滅活組織切片中的內源性過氧化物酶和生物素,牛血清白蛋白封閉1 h,加一抗4 ℃孵育過夜,回收一抗,加二抗室溫孵育30 min,二氨基聯苯胺(DAB)顯色液顯色,蘇木素復染細胞核,晾干封片后光鏡下觀察,用ImageG軟件進行細胞計數。

1.6統計學方法 采用SPSS25.0軟件進行t檢驗、單因素方差分析。

2 結 果

2.1造模后一般情況 造模后大鼠較之前精神萎靡,飲食、飲水及活動量減少,毛色暗淡,注射側膝關節腫脹,活動時注射側肢體著地減少。

2.2大體觀察 正常組關節軟骨透明度好,呈灰白色,軟骨表面光滑;模型組關節軟骨透明度差,顏色變暗,軟骨層變薄,軟骨表面不光滑,關節滑液明顯增多;被動運動組軟骨色澤較模型組明顯改善,軟骨層增厚,關節滑液減少。 見圖1。

圖1 各組關節軟骨大體觀察

2.3軟骨組織形態學觀察 光鏡下觀察軟骨組織標本,HE染色見正常組軟骨細胞排列整齊,層次分明;模型組軟骨細胞明顯減少,排列紊亂,出現裂隙;被動運動組軟骨細胞較模型組增多,排列稍整齊,層次較清楚。甲苯胺藍染色和番紅O固綠染色見正常組軟骨基質染色深且均勻,軟骨各層清楚可辨,潮線連續完整;模型組軟骨基質染色弱且不均,軟骨層變薄,潮線不清;被動運動組較模型組明顯改善,軟骨基質染色加深,軟骨層增厚,潮線較清楚。見圖2。

圖2 各組軟骨組織形態學及軟骨細胞中MMP-13表達(DAB,×400)

2.4各組Mankin評分比較 模型組Mankin評分〔(7.7±0.948 68)分〕最高,被動運動組〔(4.3±0.948 68)分〕明顯低于模型組、明顯高于正常組〔(0.2±0.421 64)分〕,各組間比較差異顯著(P<0.05)。

2.5各組IL-1β含量和MMP-13表達比較 與正常組比較,模型組及被動運動組IL-1β含量明顯升高(P<0.05);與模型組比較,被動運動組IL-1β含量明顯降低(P<0.05)。免疫組織化學染色可見陽性細胞胞質和胞核均著棕黃色。與正常組比較,模型組及被動運動組MMP-13表達水平顯著升高(P<0.05);與模型組比較,被動運動組MMP-13表達水平顯著降低(P<0.05)。見圖2、表1。

表1 各組IL-1β含量和MMP-13表達比較

3 討 論

KOA主要病理學改變是關節軟骨變性、破壞、軟骨下骨反應性增生和骨贅形成〔25〕。KOA的一個顯著特征是關節軟骨的進行性退化,研究表明,軟骨細胞賴以生存的細胞外基質的合成與降解失衡是導致軟骨退變的重要原因之一,軟骨基質的降解和炎性細胞因子的產生對KOA的病理進展至關重要〔26〕。運動療法是目前KOA治療中公認的有效方法,有研究表明,運動療法能在提高KOA患者關節活動度的同時,減輕疼痛并改善膝關節功能,使76%的患者免于關節置換手術〔27〕。國外也早在2001年就提出將運動療法作為治療膝骨性關節炎的首選〔28〕。但目前有關被動運動的基礎研究甚少,其作用機制也不明確。

本研究采用關節腔內注射木瓜蛋白酶法制備KOA大鼠模型,木瓜蛋白酶誘導KOA成功率高、時間短、重復性好〔29〕,對膠原蛋白和軟骨細胞沒有直接影響,只通過對細胞外基質中的蛋白多糖影響來破壞膠原蛋白的整合〔14〕,因此可以形成與人類KOA相似的病變。本實驗中,注射木瓜蛋白酶4 w后,即可見軟骨細胞的減少和排列紊亂,與人類早期KOA一致。本實驗結果表明,被動運動對KOA大鼠具有一定的治療作用,可以改善關節軟骨的退變與破壞,能夠在一定程度上促進關節軟骨損傷的修復。

MMPs是軟骨基質降解中最重要的酶之一〔30〕。MMP-13是靶向軟骨降解的主要酶,與其他 MMP 相比,MMP-13 的表達更局限于結締組織,在骨關節炎關節軟骨和Ⅱ型膠原蛋白降解中發揮重要作用〔31〕。本實驗表明,被動運動可以抑制關節軟骨組織中MMP-13表達,使關節軟骨的降解減少,對關節軟骨具有一定的保護作用。

炎性因子在KOA的發生和發展過程中也起著重要作用,它們參與了膝關節的新陳代謝,對于維持膝關節內環境的穩態具有重大影響,其中IL-1β被認為是導致KOA產生的關鍵因素,其可以獨立誘導炎癥反應和軟骨分解,也可以和其他介質一同發揮致炎作用〔32〕。有研究表明,IL-1β能通過抑制軟骨細胞合成蛋白聚糖及細胞增殖影響關節軟骨的退變〔31〕。本實驗表明,被動運動可以通過降低關節滑膜液中IL-1β含量來減輕炎癥,改善KOA大鼠癥狀。

綜上,被動運動可通過降低KOA大鼠關節液中IL-1β含量減輕炎癥反應;抑制軟骨細胞中MMP-13表達,可減少軟骨基質降解,促進關節軟骨的損傷修復。關于具體的治療機制,有待進一步研究。