脂肪間充質干細胞聯合納米銀凝膠敷料對糖尿病大鼠慢性創面愈合的影響

楊麗娜 王恩峰 許卓茂 符景旦 孫軼群

(海南西部中心醫院整復燒傷科,海南 儋州 571700)

糖尿病的患病率和發病率急劇攀升,已成為全球重要公共保健問題之一,糖尿病正嚴重威脅人們的生命健康,預計到2045年糖尿病患者人數將達6.29億,國際糖尿病聯合會最新發布《糖尿病地圖》顯示,我國有1.14億糖尿病患者,居世界首位〔1,2〕。糖尿病患者由于長期的血糖、血脂代謝異常,抗氧化能力下降,合并神經病變及各種不同程度下肢血管病變及局部組織缺血,是導致潰瘍形成的重要原因,臨床主要表現為潰瘍、感染和壞疽。糖尿病足是截肢的首位原因,糖尿病足患者有 14%～24%需要截肢,約 85%截肢由足潰瘍引發,國外相關報道每年因糖尿病足所引起的截肢在(5.7～20.5)人/10 萬人,是糖尿病患者致殘、致死的主要原因〔3,4〕。糖尿病足潰瘍和截肢所帶來的醫療消耗巨大,幾乎相當于糖尿病其他并發癥的總和,所以糖尿病慢性潰瘍治療非常重要。本研究通過動物實驗探討脂肪來源間充質干細胞(ADSCs)聯合納米銀凝膠敷料對大鼠糖尿病慢性創面愈合的影響。

1 資料與方法

1.1實驗儀器 臺式低速離心機(長沙英泰儀器有限公司);倒置顯微鏡〔奧林巴斯(北京)銷售服務有限公司〕;生化培養箱(上海精宏實驗設備有限公司);CO2培養箱(SANYO);電子天平(昆山優科維特電子科技有限公司);血糖儀(三諾生物傳感股份有限公司);小動物麻醉機(英國Mss);數碼相機(蘇州富士膠片映像機器有限公司);全波長酶標分析儀(北京普天新橋);恒溫搖床(BLabotery);脫水機(DIAPATH);包埋機(武漢俊杰電子有限公司);病理切片機(上海徠卡儀器有限公司);凍臺(武漢俊杰電子有限公司);組織攤片機(浙江省金華市科迪儀器設備有限公司),烤箱(天津市萊玻瑞儀器設備有限公司);載玻片(Servicebio);正置光學顯微鏡(日本尼康);成像系統(日本尼康)。

1.2實驗材料 Ⅰ型膠原酶購自Biosharp,DMEM/F12(1∶1)、胎牛血清、GlutaMAX(TM)-I(100X)、0.25%胰酶均購自Gibco,檸檬酸、無水乙醇、二甲苯均購自國藥集團化學試劑有限公司,檸檬酸三鈉購自阿拉丁,鏈脲佐菌素(STZ)購自麥克林,血糖試紙購自三諾生物傳感股份有限公司,0.9%氯化鈉注射液購自四川科倫藥業股份有限公司,異氟烷購自上海雅衍信息科技有限公司,Rat轉化生長因子(TGF)-β酶聯免疫吸附試驗(ELISA)KIT、Rat血管內皮生長因子(VEGF)ELISA KIT、Rat白細胞介素(IL)-6 ELISA KIT、Rat腫瘤壞死因子(TNF)-α ELISA KIT均購自上海酶聯生物科技有限公司,環保型脫蠟透明液購自Servicebio,蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒購自Solarbio。

1.3實驗動物 清潔級2月齡SD雄性大鼠200只,100只用于建模分組,另100只用于提取脂肪制備脂肪干細胞,雄性,體質量200～250 g,飼養環境濕度50%～60%,溫度22～24 ℃,光照/暗循環12 h/12 h,可隨意獲取食物和水。

1.4糖尿病慢性創面大鼠模型建立 實驗用大鼠在實驗前12 h禁食,定量飲水。將1% STZ溶液,以60 mg/kg劑量腹腔內注射2 d。間隔48 h,連續兩次測量,誘導大鼠糖尿病,2 d后動物血糖水平>250 mg/dl、尿糖為(++++)時,表明動物患有糖尿病,即成糖尿病大鼠模型。將糖尿病大鼠用鹽酸氯胺酮(100 mg/kg)腹腔注射麻醉后背部備皮,在脊柱兩側分別作直徑2 cm的圓形標記,面積大約3.14 cm2。在無菌條件下,用外科方法切除標記處全層皮膚,止血后用無菌紗布覆蓋,在背部形成2 cm直徑的全層皮膚缺損,用生物膠固定傷口,防止傷口自行愈合,用納米銀水膠體敷料覆蓋創面,繼續養殖30 d,使其成為糖尿病慢性創面大鼠模型,手術后注射 4 000 U青霉素鈉防止感染。

1.5動物實驗分組 將糖尿病慢性創面模型大鼠隨機分為9個實驗組和1個對照組各10只,將ADSCs按照1×106、5×106、1×107個細胞數與脂肪膠(SVF-gel)混合后外用于慢性創面;同時將ADSCs細胞按照 5×106個細胞的量注射在創面周邊皮下。將 ADSCs的不同劑量及處理方式分成9個治療組:A組(創面皮下注射5×106ADSCs),B組(創面涂抹SVF-gel),C組(創面涂抹SVF-gel+1×106ADSCs),D組(創面涂抹SVF-gel+5×106ADSCs),E組(創面涂抹SVF-gel+1×107ADSCs),F組(創面皮下注射5×106ADSCs+創面涂抹SVF-gel),G組(創面皮下注射5×106ADSCs+創面涂抹SVF-gel+創面涂抹1×106ADSCs),H組(創面皮下注射5×106ADSCs+創面涂抹SVF-gel+創面涂抹5×106ADSCs),I組(創面皮下注射5×106ADSCs+創面涂抹SVF-gel+創面涂抹1×107ADSCs),另設1個對照組J組(納米銀凝膠敷料換藥)。治療后,1、2、3 w觀察各組創面面積、愈合率、愈合速率、血清細胞因子及組織病理分析。 納入標準:(1)大鼠飼養環境相同;(2)符合糖尿病慢性潰瘍;(3)對大鼠處置符合醫學倫理要求。

1.6脂肪源性干細胞分離、培養 (1)SVF-gel制備:麻醉消毒后,切取100只大鼠腹股溝區脂肪層獲取脂肪,將獲取的脂肪組織剔除纖維結締組織,棄掉液體部分備用。將脂肪組織分裝到20 ml注射器中,嚴格無菌操作,置入離心機中,離心機1 200 r/min離心10 min。提取中間層高密度脂肪組織,將裝有高密度脂肪的無菌注射器與另一只全新的20 ml無菌注射器用內徑為2.4 mm柔軟魯爾連接頭密閉連接,兩個互相連接的20 ml注射器形成相對密閉空間,推動注射器活塞(推注速度10 ml/s),將脂肪組織通過切割連接頭在兩個注射器中往返推注20次。使其變成乳糜狀脂肪(Nanofat),剔除結締組織后入離心機中,設置參數為1 600 r/min,離心3 min。用1 600 r/min離心力離心3 min,去除上層油脂及底層紅細胞等得到中間層即為我們實驗所需的 SVF-gel,其中含有高度濃縮的ADSCs,整個實驗過程堅持無菌原則。 (2)ADSCs單細胞懸液制備:取制備的脂肪組織,加入體積相等的0.075%Ⅰ型膠原酶,將標本置入37 ℃氣浴振蕩器中,予以消化約30 min。消化后的組織400 r/min離心5 min,棄掉上層未完全消化的組織及上清液。 然后磷酸鹽緩沖液(PBS)分次清洗多余的Ⅰ型膠原酶,再次400 r/min離心5 min,棄掉上清液,收集底層細胞群,PBS 重懸。懸液通過100、70、40 μm的細胞篩網過濾,去除未完全消化的纖維結締組織,形成富含 ADSCs 單細胞懸液。(3)脂肪來源干細胞ADSCs體外擴增培養:將新鮮分離的細胞群,按照1×104～2×104個細胞數接種在10%胎牛血清、100 U/ml青鏈霉素的DMEM完全培養基中,置于37 ℃、5% CO2培養箱中培養。根據細胞在培養皿中的密度及培養基的顏色,隔天更換培養基。當細胞爬滿(95%左右)培養皿底部,胰酶消化后繼續分皿培養,直至細胞達到1×108個,然后無菌分管-80 ℃凍存,備用。

1.7脂肪源性間充質干細胞與納米銀凝膠敷料生物相容性評估 將納米銀凝膠混入培養基,然后添加脂肪源性間充質干細胞進行培養。通過顯微鏡觀察脂肪源性間充質干細胞貼壁生長的狀態及生長速度,并用流式細胞儀檢測脂肪源性間充質干細胞的分化狀態。

1.8脂肪源性間充質干細胞療效及安全性評估 (1)處置前清除膠水,拍照記錄創面情況,用帶有網格的塑料板,每一個方格面積為1 mm2,用網格板測量創面大小精確計算面積。 (2)創面進行徹底清創,用生理鹽水反復清洗創面,將ADSCs懸浮液轉入1 ml注射器中,各實驗組采用不同劑量脂肪間充質干細胞,均勻涂抹于創面及注射于創面邊緣皮下。 (3)應用干細胞后的創面外用納米銀凝膠敷料包扎。連續觀察各組1、2、3 w傷口愈合情況,觀察、記錄創面愈合面積和時間并計算愈合率及愈合速率。 (4)創面完全愈合后,處死大鼠,取大鼠創面愈后病理標本用10%甲醛溶液固定,常規石蠟包埋,做HE染色并于光學顯微鏡或電子顯微鏡下觀察新生組織的形態、表皮細胞、成纖維細胞、血管密度、炎性細胞、膠原沉積等指標。 (5)各組預留2只大鼠長期飼養,直至自然死亡或時間大于2年,做細胞治療安全性評估。

1.9比較不同濃度脂肪源性間充質干細胞或以不同種植方式對糖尿病慢性創面愈合的影響 研究不同處理方式下創面的愈合速度、愈合質量及愈合組織顯微鏡下的形態學及結構變化。找出最佳愈合給藥濃度或者相同愈合效果最低給藥濃度。

1.10統計學方法 采用SPSS25.0軟件進行單因素方差分析、秩和檢驗。

2 結 果

2.1一般情況比較 注射STZ溶液后,給藥前,各組大鼠毛色光滑,體態、飲食、活動均正常,各組大鼠體重及血糖差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組體質量、創面面積、愈合率、愈合速率

2.2各組殘余創面面積 治療后第7、14天,各組間殘余創面面積差異存在統計學意義(P<0.05),而21 d時差異無統計學意義(P>0.05)。在第7天和第14天,H組殘余創面面積明顯小于其他實驗組及對照組(P<0.05),愈合最佳給藥濃度為:創面皮下注射5×106ADSCs+創面涂抹SVF-gel+創面涂抹5×106ADSCs。見表1。

2.3各組創面愈合率 各組創面愈合率在7 d時差異有統計學意義(P<0.05),14 d與21 d組間差異無統計學意義(P>0.05)。第7天,H組創面愈合率明顯大于其他實驗組及對照組(P<0.05),愈合最佳給藥濃度為創面皮下注射5×106ADSCs+創面涂抹SVF-gel+創面涂抹5×106ADSCs。見表1、圖1。

圖1 H組創面隨時間遷移愈合情況

2.4各組創面愈合速率 各組創面愈合速率在7、14 d時差異有統計學意義(P<0.05),而第21天組間差異無統計學意義(P>0.05)。在第7、14天,H組創面愈合速率明顯高于其他實驗組及對照組(P<0.05)。見表1。

2.5各組創面組織病理學對比 治療后第7、14天,對照組較多炎癥細胞浸潤,同時有少量毛細血管及纖維細胞生長;實驗組有較少炎癥細胞浸潤,有較多毛細血管及纖維細胞生長。H組與其他實驗組相比,炎癥細胞浸潤較少,毛細血管及纖維細胞生長較多。見圖2。

圖2 各組組織病理觀察(HE染色,×400)

3 討 論

糖尿病創面難以愈合的原因與晚期糖基化終產物(AGEs)增加、長期慢性炎癥反應、周圍神經功能障礙等密切相關〔5〕。缺血、神經病變和感染是導致組織壞死和潰瘍形成的 3 個主要因素,局部的高血糖代謝產生的糖脂代謝產物異常的增高,引起血管基底膜的改變,進而形成微血管病〔6〕。血管病變是糖尿病足潰瘍發生的一個機制,改善局部的血供是治療糖尿病潰瘍的策略之一〔7〕。新生血管的形成是一個復雜的過程,不僅需要內皮細胞增殖,還需要多種生長因子的作用。糖尿病患者體內環境異常會影響ADSCs的生物學功能,影響創面愈合〔8〕。再上皮化延遲、炎癥細胞浸潤及肉芽組織形成減少、血管再生能力降低、膠原分泌減少及膠原化紊亂,涉及血管病變、神經病變、感染及局部微環境異常等,創面局部微環境異常包括局部高血糖環境、 氧化應激、生長因子及細胞因子表達異常等〔5,9,10〕。因其發病機制復雜、病程較長,治療難度較大,嚴重影響患者的生活質量,成為目前醫學研究的熱點、重點及難點。糖尿病創面作為慢性難愈合創面的典型,主要特點為:創面大多比較深,合并感染多見;動脈硬化多見、管壁增厚明顯,肉芽組織脆弱生機低下;瘢痕組織增生,有時骨化發生;反復發作,遷延不愈〔11〕。最常用的方法是嚴格控制血糖基礎上,徹底清創、負壓吸引、換藥等治療,創傷大、時間長。患者迫切希望有更加快速安全有效無痛的治療方法,解決糖尿病足慢性潰瘍創面問題,降低截肢概率,提高生活質量。研究發現,來源于脂肪組織中的活性成分-脂肪基質血管成分(SVF),包含 ADSCs、內皮組織細胞、血細胞、T 細胞、抗炎細胞等,能夠分泌多種細胞因子,具有較強的自我更新能力,可分化為各種類型的功能細胞,具有向內皮細胞表型分化并且有在體內參與血管形成的潛能,可以改善局部血液循環,形成有利于組織細胞存活和功能維持的微環境,被認為是組織再生和修復的最理想細胞來源〔12～14〕。ADSCs 在皮膚創傷愈合的干細胞治療中有巨大潛力,與骨髓來源的干細胞相比,ADSCs 具有更強的造血和修復組織能力,其體積小,分化程度低,對創傷和缺氧的耐受力比成熟脂肪細胞好。脂肪來源的干細胞自體移植免疫原性低、不涉及倫理問題,被認為是骨髓間充質干細胞的理想替代物〔15〕。對糖尿病足缺血組織具有重要的應用價值〔16〕。大量研究顯示,ADSCs 在糖尿病潰瘍治療方面具有極大潛力,可通過增加上皮化和肉芽組織形成、抗炎和抗凋亡作用及釋放VEGF及成纖維細胞因子(FGF),通過旁分泌機制激活成纖維細胞和角質形成細胞,從而促進難愈性創面愈合〔17～20〕。其機制可能與代償升高有關,ADSCs 是安全的,能在體外擴增,具有分化為多種細胞譜系的能力。ADSCs 治療糖尿病潰瘍患者可增強潰瘍演化,減少疼痛,降低疼痛評分,改善跛行及行走距離,可以促進慢性潰瘍的愈合,需要更多的研究來確定 ADSCs 在治療糖尿病慢性潰瘍中的確切作用,ADSCs 在糖尿病慢性創面細胞再生治療中具有廣闊的應用前景。在糖尿病足慢性創面的修復上國內外學者采用了多種技術,取得了較好的效果,有專家用脂肪干細胞注射治療大鼠慢性創面,或外用都得到了肯定的療效。但也存在患鼠感染死亡率高,模型不穩定的情況。雖然有明確的數據證實了 ADSCs 對慢性創面的作用,但對使用的量和效果之間的關系沒有進一步闡述。納米銀凝膠敷料含有一定濃度的銀離子,具有抑菌作用,兼具保濕作用,有利于抑制局部感染改善 ADSCs 的存活環境〔21〕。本研究結果提示,經ADSCs聯合納米銀凝膠敷料干預的實驗組病理結果可見更少的炎癥細胞浸潤及更多的纖維細胞和毛細血管生長。其中以H組皮下注射與外用涂抹給藥聯合外涂SVF-gel效果最佳,并得出了最佳給藥濃度。

綜上,利用納米銀凝膠敷料保濕、抗菌的作用,并用SVF-gel混合改善慢性創面局部 ADSCs 生長環境,促進 ADSCs 存活,可提高 ADSCs 對慢性創面的治療效果。