異甘草素通過調節自噬作用減輕動脈粥樣硬化大鼠斑塊形成

王花 姚元濱 何伍健

(青海省人民醫院急診內科,青海 西寧 810007)

動脈粥樣硬化(AS)作為腦血管部位疾病,已成為威脅人類健康的危險疾病之一,頸動脈狹窄是AS的危險因素〔1〕,但目前其病理機制尚不完全明確,新的治療方法和標志物都需進一步探究。自噬作為細胞內普遍存在現象,具有高度保守性,且自噬的發生受一系列自噬相關基因和信號通路的調控〔2,3〕。隨著研究深入,發現在高脂飲食誘導的AS小鼠中可通過促進自噬改善AS,實現對疾病的緩解〔4〕。異甘草素(ISL)為甘草中的一類黃酮類化合物,在多種水果、蔬菜和藥用植物中均廣泛存在,已有研究表明,其具有感感染、抗脂質過氧化、抗腫瘤等多種功效〔5～7〕,在自噬中ISL能夠激活自噬促進人表皮角質形成細胞中黑色素降解,從而抑制黑色素形成〔8〕,但尚未發現ISL在AS中的相關研究。本研究探討ISL對AS斑塊形成的影響,并探討其機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物、試劑與儀器 動物:53只雄性SD大鼠〔北京維通利華實驗動物技術有限公司,生產許可證號:SCXK(京)2016-0011〕,體質量(200±10)g。大鼠均在溫度(24.0±0.5)℃、濕度(50±5)%、12 h黑暗12 h光照條件下自由飲水攝食。主要試劑與儀器:維生素D3(上海麥克林生化科技有限公司,貨號:C804669-1g);ISL(南京春秋生物技術有限公司,CAS號:961-29-5,規格:HPLC 20%～98%);自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(MA,美國Sigma公司,貨號:M9281,規格:100 mg);自噬激活劑西羅莫司(北京索萊寶科技有限公司,貨號:IA0500);蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒(北京索萊寶科技有限公司,貨號:G1120);一抗兔源微管相關蛋白1輕鏈3Ⅱ型(LC3Ⅱ)、自噬相關蛋白(Beclin1),二抗羊抗兔(英國abcam公司,貨號分別為:ab192890、ab207612、ab205718)。頸動脈超聲儀(深圳市德力凱醫療設備股份有限公司,型號:MVU-6300);透射電鏡(美國FEI公司,型號:Talos);蛋白凝膠成像儀(北京中西遠大科技有限公司,型號:JY02G)。本研究經醫院倫理委員會審核并通過。

1.2分組及處理 43只大鼠參考文獻〔9〕應用維生素D3聯合高脂飲食法建立AS模型,高脂飼料:81.3%基礎飼料、10%豬油、5%白糖、3%膽固醇、0.5%膽酸鈉、0.2%丙基硫氧嘧啶。一次性腹腔注射600 000 U/kg維生素D3后每日喂高脂飼料20 g,連續45 d。隨機取3只,主動脈組織光鏡觀察粥樣斑塊形成,則造模成功。剩余40只隨機數字法分為模型組、ISL組、ISL+自噬抑制劑組、自噬激活劑組各10只。ISL組灌胃50 mg/kg ISL,ISL+自噬抑制劑組在ISL基礎上腹腔注射100 mg/kg自噬抑制劑3-MA,自噬激活劑組腹腔注射1 mg/kg自噬激活劑西羅莫司。正常組喂基礎飼料相同天數,連續4 w。

1.3超聲儀檢測各組動脈情況 頸動脈超聲觀察各組頸動脈內膜光滑度、增生、斑塊情況,斑塊大小和回聲點。沿血管長軸測量管腔動脈后壁內膜-中層厚度(IMT);探頭中點采樣,控制血流和聲速<60度,測量血流動力學參數指標斑塊面積(S)。

1.4樣本收集 股動脈采血,室溫靜置2 h,3 000 r/min離心20 min,上清備用,全自動生化分析儀檢測血清中總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)含量;解剖大鼠,頸總動脈離體后,生理鹽水反復沖洗,洗掉血細胞至頸總動脈半透明狀,刀片小心切斷硅膠管的固定絲線,取下硅膠管,剔除多余粘連組織,部分置于10%中性甲醛中固定,部分置于2.5%戊二醛中,部分置于-80 ℃冰箱保存。

1.5HE染色檢測頸動脈病理情況 10%中性甲醛中取出組織,固定后依次經梯度酒精(75%酒精浸泡30 min→85%酒精浸泡30 min→95%酒精浸泡30 min→95%酒精浸泡30 min→100%酒精浸泡60 min→100%酒精浸泡60 min)脫水處理,脫水后二甲苯透明,放于石蠟中,切片機石蠟切片(厚度5 μm)。石蠟切片后染色,依次進入二甲苯中,梯度酒精(100%酒精浸泡5 min→100%酒精浸泡5 min→95%酒精浸泡5 min→85%酒精浸泡5 min→75%酒精浸泡5 min)脫蠟,切片浸泡入蘇木素染液中,蒸餾水沖洗、1%鹽酸乙醇分化、伊紅染色,蒸餾水沖洗,梯度酒精(75%酒精浸泡2 min→85%酒精浸泡2 min→100%酒精浸泡5 min→100%酒精浸泡5 min)脫蠟,二甲苯中透明、中性樹膠蓋片,顯微鏡下觀察血管壁、管腔情況。

1.6透射電鏡觀察頸動脈超微結構 2.5%戊二醛中取出組織,經磷酸緩沖液清洗后,放入2%四氧化鋨中固定,取出血管,磷酸緩沖液清洗后梯度丙酮(70%～100%)脫水,丙酮:包埋劑2∶1浸泡血管,包埋劑處理后超薄切片機制成半薄切片(10 μm),甲苯胺藍染色,光學顯微鏡觀察并定位;超薄切片機切片(60 nm),碳酸鉛染色,透射電鏡觀察超薄切片脂滴和自噬體情況。

1.7Western印跡檢測頸動脈中LC3Ⅱ、Beclin1蛋白情況 -80 ℃冰箱中取20 mg頸總動脈,添加200 μl蛋白裂解液用眼科剪剪碎組織、研磨棒研磨充分,組織在冰上靜置10 min,移液槍小心吸取上層清液,12 000 r/min、4 ℃離心20 min,吸上清液至新的1.5 ml EP管中,二喹啉甲酸(BCA)法檢測蛋白濃度,十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)膠凝膠電泳,聚偏氟乙烯(PVDF)300 mA轉膜,5%脫脂奶粉室溫封閉2 h;對應加入一抗LC3Ⅱ、Beclin1、GAPDH;對應加入二抗,室溫孵育2 h。發光液避光顯色,蛋白凝膠成像儀曝光拍照和定量分析。

1.8統計學分析 采用GraphPad Prism7.0軟件進行單因素方差分析、SNK-q法。

2 結 果

2.1ISL對頸動脈IMT、斑塊S的影響 與正常組相比,模型組、ISL組、ISL+自噬抑制劑組、自噬激活劑組頸動脈IMT、斑塊S水平明顯升高(P<0.05);與模型組相比,ISL組、自噬激活劑組頸動脈IMT、斑塊S水平、ISL+自噬抑制劑組斑塊S水平明顯降低(P<0.05);與ISL組相比,ISL+自噬抑制劑組頸動脈IMT、斑塊S水平明顯升高(P<0.05);與ISL+自噬抑制劑相比,自噬激活劑組頸動脈IMT、斑塊S水平明顯降低(P<0.05)。見表1。

表1 各組頸動脈IMT、斑塊S水平、血清中TC、TG、LDL-C含量、頸動脈中LC3Ⅱ、Beclin1蛋白表達比較

2.2ISL對血清中TC、TG、LDL-C含量的影響 與正常組相比,模型組、ISL+自噬抑制劑組血清中TC、TG、LDL-C含量明顯升高(P<0.05);與模型組相比,ISL組、自噬激活劑組血清中TC、TG、LDL-C含量、ISL+自噬抑制劑組血清中LDL-C含量明顯降低(P<0.05);與ISL組相比,ISL+自噬抑制劑組血清中TC、TG、LDL-C含量明顯升高(P<0.05);與ISL+自噬抑制劑組相比,自噬激活劑組血清中TC、TG、LDL-C含量明顯降低(P<0.05)。見表1。

2.3ISL對頸動脈病理情況的影響 正常組動脈結構完整,胞核形狀規則,內膜、外膜及外膜界限清晰;模型組出現動脈管壁明顯增厚現象,管腔中可見明顯的粥樣或纖維斑塊、內膜中可見白色條紋或黃白色斑塊;ISL組和自噬激活劑組動脈壁彈性明顯恢復,管腔內脂斑沉淀明顯減少,較模型組有明顯減少;ISL+自噬抑制劑組與模型組類似,出現明顯的粥樣或纖維斑塊。見圖1。

圖1 各組頸動脈病理學觀察(HE染色,×100)

2.4ISL對頸動脈自噬體情況的影響 正常組無粥樣硬化斑塊,無自噬體空泡聚集、可見少量脂滴;模型組較正常組斑塊中自噬體、脂滴有所增多;ISI組和自噬激活劑組斑塊內可見明顯的自噬體,可見大量自噬溶酶體;ISL+自噬抑制劑組中自噬小體數量減少、出現大量脂滴。見圖2。

圖2 各組頸動脈自噬體情況(碳酸鉛染色,×5 000)

2.5ISL對頸動脈中LC3Ⅱ、Beclin1蛋白表達的影響 與正常組相比,ISL組、ISL+自噬抑制劑組、自噬激活劑組頸動脈中LC3Ⅱ、Beclin1蛋白水平、模型組頸動脈中LC3Ⅱ蛋白水平明顯升高(P<0.05);與模型組相比,ISL組、自噬激活劑組頸動脈中LC3Ⅱ、Beclin1蛋白水平明顯升高(P<0.05);與ISL組相比,ISL+自噬抑制劑組頸動脈中LC3Ⅱ、Beclin1蛋白水平明顯降低(P<0.05);與ISL+自噬抑制劑組相比,自噬激活劑組頸動脈中LC3Ⅱ、Beclin1蛋白水平明顯升高(P<0.05)。見表1、圖3。

1～5:正常組、模型組、ISL組、ISL+自噬抑制劑組、自噬激活劑組圖3 各組頸動脈中LC3Ⅱ、Beclin1蛋白表達

3 討 論

AS屬慢性炎癥性疾病,由AS引起的腦卒中和冠心病已成為影響人類健康的主要原因,AS中斑塊形成、破裂與炎癥反應、血管內皮因子失衡、細胞自噬等關系密切,但目前自噬在AS中認識尚不夠全面,一般認為適度自噬對AS具有保護作用〔10,11〕。本研究結果提示,AS出現脂質代謝異常現象,脂滴積累在病變部位形成富含脂質的壞死中心,隨著病變加深,斑塊形成,導致動脈管壁變厚,易造成血栓,嚴重時危害生命。ISL有著多靶點、途徑好、效應廣等優點,能夠調控多種途徑影響疾病進程,在糖尿病視網膜病變中,ISL能下調miR-195表達從而減輕鏈脲佐菌素誘導的視網膜損傷中的氧化應激和炎癥〔12〕;在抗癌作用中通過抑制活性氧激活的c-Jun氨基末端激酶(JNK)通路和細胞色素c從線粒體中釋放至結直腸癌細胞中,從而發揮抗癌作用〔13〕;ISL能夠抑制磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B/哺乳動物雷帕博霉素蛋白信號通路進而抑制786-0細胞的增殖、遷移、侵襲并誘導細胞自噬發生,從而成為一種有效的腎透明細胞癌抑制劑〔14〕。ISL可調控氧化應激、炎癥、活性氧、細胞增殖、侵襲、遷移、自噬等過程,發揮作用。經ISL治療后,頸動脈IMT降低、管腔和內膜中斑塊消失,動脈管壁變薄,血清中TC、TG、LDL-C含量降低,ISL能夠減少AS中脂滴、斑塊形成,從而緩解AS,但ISL效應廣,具體影響機制途徑尚需進一步研究。

自噬現象在細胞內普遍存在,可通過降解細胞內損傷細胞器、錯誤折疊蛋白及侵入細胞內細菌、病毒等,從而維持細胞正常功能,是一種自我保護、調控機制。自噬與AS關系密切,為保護巨噬細胞免受氧化損傷,通過自噬過程降解過量的蛋白和受損細胞器〔15,16〕,自噬參與膽固醇轉運和脂肪進入溶酶體過程、參與脂滴的分解過程,自噬介導的細胞膽固醇外流在維持膽固醇平衡中發揮重要作用,進而阻止AS的發生發展〔17〕。LC3Ⅱ能夠結合在脂滴表面,在原位形成受限膜,使脂滴的一部分被分離,并在Beclin1等因子協助下形成自噬體〔18〕。本研究結果提示,在頸動脈斑塊中自噬加強,可促進脂滴分解等過程,從而維持細胞正常功能。添加ISL后與添加自噬激活劑作用類似,均可促進自噬進一步加強,降低脂滴數量;在ISL基礎上添加自噬抑制劑,自噬減弱,出現大量脂滴,斑塊明顯;提示ISL能夠加強自噬作用實現對斑塊形成的緩解。

綜上,ISL能夠激活自噬并緩解ISL斑塊形成,進而實現對ISL疾病的保護。但自噬途徑較多,可能受單一途徑或多途徑影響,探究ISL具體影響途徑將是下一步探究重點。