基于MAPK通路探究下調(diào)miR-15b對(duì)心肌細(xì)胞缺血再灌注損傷的保護(hù)作用

譚玉婷 宋業(yè)琳 藺亞東 任華風(fēng)

(1青島大學(xué)附屬青島市海慈醫(yī)院(青島市中醫(yī)醫(yī)院)心血管科,山東 青島 266033;2青島市第五人民醫(yī)院;3青島大學(xué)附屬青島市海慈醫(yī)院(青島市中醫(yī)醫(yī)院)功能檢查科)

心肌細(xì)胞缺血再灌注損傷是指缺血心肌在恢復(fù)血液再灌注后,加重其結(jié)構(gòu)破壞,引起細(xì)胞死亡,致使心肌梗死范圍擴(kuò)大,造成心臟功能的進(jìn)一步損害,并影響心肌梗死患者的預(yù)后〔1,2〕。有多篇報(bào)道指出〔3～5〕,由于活性氧產(chǎn)生的過多或抗氧化酶活性減低,則可引發(fā)鏈?zhǔn)街|(zhì)過氧化反應(yīng),損傷細(xì)胞膜并進(jìn)而使細(xì)胞死亡,從而加重了心肌受損。雖然早期進(jìn)行再灌注治療可恢復(fù)相關(guān)血管的功能,并避免心肌壞死的發(fā)生,但原病灶處已出現(xiàn)相應(yīng)的病變,尤其是心肌收縮功能及血管內(nèi)皮功能等一系列損傷性變化,在行心肌再灌注治療后表現(xiàn)得更為明顯,有發(fā)生心律失常甚至猝死的風(fēng)險(xiǎn)。本研究探究基于MAPK通路探究下調(diào)微小RNA-15b(miR-15b)對(duì)心肌細(xì)胞缺血再灌注損傷的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1材料 研究動(dòng)物:48只大鼠購(gòu)自河南祺祥科技生物有限公司〔SYXK(豫)2021-0001〕,體質(zhì)量250～310 g,平均(266.00±28.50)g,光照12 h/d,喂養(yǎng)大鼠1 w,本研究由醫(yī)院倫理委員會(huì)進(jìn)行批準(zhǔn)通過。主要試劑:miR-15b(試劑盒:艾美捷科技有限公司,abx096787);腫瘤壞死因子(TNF)-α酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒(上海廣銳生物科技有限公司);白細(xì)胞介素(IL)-6 ELISA試劑盒(杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司,70-EK106/2-96);丙二醛(MDA)ELISA試劑盒(北京義翹神州科技股份有限公司,RG80464-ACG)、超氧化物歧化酶(SOD,北京伊塔生物科技有限公司,SY6458);絲裂原活化蛋白激酶(MAPK,上海烜雅生物科技有限公司,P1024);p-p38(上海廣銳生物科技有限公司,ET3469);磷酸化c-Jun氨基末端激酶(p-JNK,上海梵態(tài)生物科技有限公司,FT-D24084)。

1.2慢病毒載體構(gòu)建 miR-15b表達(dá)下調(diào)的慢病毒載體構(gòu)建,重組miR-15b下調(diào)病毒載體(Lentiviral-mediated-Rbfox1)并經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證,病毒滴度為108 TU/ml,制備完成將重組慢病毒載體在-80 ℃保存。

1.3分組及建模 將事先購(gòu)買并喂養(yǎng)1 w的大鼠分為4組,其中12只作為空白組大鼠不做處理,其余3組依據(jù)王玉梅等〔6〕研究實(shí)驗(yàn)大鼠。構(gòu)建方法:確保每只大鼠均禁食超過12 h,注射10%水合氯醛進(jìn)行麻醉處理,麻醉生效后將其固定在夾板上,連接呼吸機(jī)及心電圖進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)生理狀況,在大鼠胸部左側(cè)3～4肋間處剪開其皮膚并分離各層肌肉并露出肋骨,持剪刀剪開第3、4根肋骨,并拉開胸壁,暴露其心臟,用止血鉗將胸腺夾住,將左心耳與肺動(dòng)脈圓錐間穿7-0絲線。缺血再灌注組麻醉后開胸,斷3～4肋,打開心包膜,暴露心臟,于冠狀動(dòng)脈左前降支根部穿線(0號(hào)縫合線),結(jié)扎阻斷血流,根據(jù)心電圖ST段抬高情況判定阻斷成功后30 min解除阻斷,根據(jù)心電圖ST的回落情況判定實(shí)現(xiàn)再灌注,縫合胸壁,大鼠恢復(fù)自主呼吸。

1.4miR-15b表達(dá)量 采集所有大鼠心肌組織,2 000 r/min 4 ℃離心10 min。miRNA采用mirVana PARIS Kit試劑盒提取純化。離心后收集miRNA。miR-15b上游引物:5′-ACGGTCGAGCTTAGA-AG-3′,下游:5′-GCTGTTTGTCTGGCTGCTGCTCCG-3′。U6上游引物:5′-CTGGGTCGAAACGCTCGTCT-3′,下游:5′-CAGTGCGACTAGAGCCACTAG-3′。反應(yīng)條件:95 ℃ 5 min;95 ℃ 10 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 205 s,共進(jìn)行40個(gè)循環(huán),采用2-ΔΔCt方法計(jì)算出miR-15b表達(dá)量。

1.5IL-6、TNF-α、MDA、SOD水平檢測(cè) 抽取大鼠清晨尾部血2 ml,離心處理10 min,分離出的上層血清,在-45 ℃環(huán)境下保存,采用ELISA檢測(cè)IL-6、TNF-α、MDA、SOD;首先在酶標(biāo)板上進(jìn)行標(biāo)記,并配制稀釋標(biāo)準(zhǔn)品。取100 μl血清樣品及標(biāo)準(zhǔn)品放入反應(yīng)孔上,孵育32 min,使用洗滌液清洗3次酶標(biāo)板,加入100 μl酶標(biāo)工作液,避光孵育32 min,使用洗滌液清洗3次酶標(biāo)板,加入100 μl的3,3′,5,′-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)顯色液,避光孵育12 min,顯色后加入終止液,450 nm處測(cè)吸光值,顏色深淺與IL-6、TNF-α、MDA、SOD呈正比,經(jīng)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算IL-6、TNF-α、MDA、SOD。

1.6病理組織學(xué)觀察 各組大鼠腹腔注射80 mg/kg的3.0%戊巴比妥麻醉,迅速取分離心肌組織,將提取的心肌組織制作成標(biāo)本,用4%多聚甲醛固定,室溫下用15%乙二胺四乙酸(EDTA)脫鈣、脫水后用石蠟進(jìn)行包埋,作3 μm的切片,進(jìn)行蘇木素-伊紅(HE)染色處理,使用光學(xué)顯微鏡觀察大鼠病理變化。

1.7MAPK信號(hào)通路 采用Western印跡檢測(cè),取所有心肌細(xì)胞缺血再灌注損傷大鼠心肌組織蛋白。提取50 μg蛋白,把5×蛋白緩沖液注入4∶1的體積中。按1∶5 000加入稀釋山羊抗兔IgG,孵育60 min室溫水平搖床,洗滌5次Westem洗滌液,每10 min 1次。經(jīng)過電化學(xué)發(fā)光(ECL)顯色和曝光后,進(jìn)行BIO-RAD成像,檢測(cè)條帶的灰度值,分析統(tǒng)計(jì)結(jié)果。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS26.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、方差分析。

2 結(jié) 果

2.1病理組織學(xué)觀察 空白組心臟組織結(jié)構(gòu)正常,且心肌細(xì)胞排列整齊,未見心肌細(xì)胞肥大、變性,橫紋清晰。模型組心肌細(xì)胞腫脹,且少數(shù)心肌細(xì)胞溶解壞死,部分心肌細(xì)胞質(zhì)疏松。上調(diào)組部分心肌細(xì)胞核增大,部分血管周圍心肌細(xì)胞溶解壞死,且心肌間質(zhì)可見灶狀炎細(xì)胞浸潤(rùn)。下調(diào)組心肌細(xì)胞橫紋變淺,心肌間質(zhì)未見明顯急性慢性炎細(xì)胞浸潤(rùn)及纖維細(xì)胞增生。見圖1。

圖1 各組心臟組織病理(HE染色,×400)

2.2各組miR-15b表達(dá)量比較 與空白組比較,模型組、上調(diào)組和下調(diào)組miR-15b表達(dá)量明顯升高(P<0.05);與模型組比較,上調(diào)組miR-15b表達(dá)量明顯升高,下調(diào)組miR-15b表達(dá)量明顯降低(P<0.05);與上調(diào)組比較,下調(diào)組miR-15b表達(dá)量明顯降低(P<0.05)。見表1。

表1 各組miR-15b表達(dá)、炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)、心功能指標(biāo)比較

2.3各組炎癥反應(yīng)情況對(duì)比 與空白組比較,模型組、上調(diào)組和下調(diào)組IL-6、TNF-α表達(dá)水平明顯升高(P<0.05);與模型組比較,上調(diào)組IL-6、TNF-α表達(dá)水平明顯升高,下調(diào)組IL-6、TNF-α表達(dá)水平明顯降低(P<0.05);與上調(diào)組比較,下調(diào)組IL-6、TNF-α表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)。見表1。

2.4各組氧化應(yīng)激情況對(duì)比 與空白組比較,模型組、上調(diào)組和下調(diào)組MDA、SOD表達(dá)水平明顯升高(P<0.05);與模型組比較,上調(diào)組MDA、SOD表達(dá)水平明顯升高,下調(diào)組MDA、SOD表達(dá)水平明顯降低(P<0.05);與上調(diào)組比較,下調(diào)組MDA、SOD表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)。見表1。

2.5各組心功能指標(biāo)比較 與空白組比較,模型組、上調(diào)組和下調(diào)組LVEDP表達(dá)水平升高,LVSP表達(dá)水平降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與模型組比較,上調(diào)組LVEDP表達(dá)水平升高,LVSP表達(dá)水平降低;下調(diào)組LVEDP表達(dá)水平降低,LVSP表達(dá)水平升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與上調(diào)組比較,下調(diào)組LVEDP表達(dá)水平降低,LVSP表達(dá)水平升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

2.6各組MAPK信號(hào)通路表達(dá)量比較 與空白組比較,模型組、上調(diào)組和下調(diào)組MAPK、p-p38、p-JNK表達(dá)水平明顯升高(P<0.05);與模型組比較,上調(diào)組MAPK、p-p38、p-JNK表達(dá)水平明顯升高,下調(diào)組MAPK、p-p38、p-JNK表達(dá)水平明顯降低(P<0.05);與上調(diào)組比較,下調(diào)組MAPK、p-p38、p-JNK表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)。見表2、圖2。

表2 各組MAPK信號(hào)通路表達(dá)量比較

圖2 Western印跡檢測(cè)各組MAPK信號(hào)通路蛋白

3 討 論

心肌缺血后再灌注損傷指急性心肌梗死后,冠狀動(dòng)脈出現(xiàn)阻塞,甚至部分阻塞,經(jīng)治療后血管再通,血管損傷呈短暫加重的病理生理現(xiàn)象〔7〕。由于血液再灌注,心肌細(xì)胞在缺血期保持存活,而于再灌注期最終死亡〔8〕。目前認(rèn)為心肌再灌注損傷中再灌注性心律失常,屬于可逆性損傷,但是有潛在的致命性。

miRNAs屬于短小內(nèi)源性單鏈非編碼RNA片段,其片段長(zhǎng)度約為22個(gè)核苷酸,現(xiàn)已被證實(shí)為能夠?qū)?xì)胞起到一定調(diào)控作用的轉(zhuǎn)錄因子〔9〕。有相關(guān)數(shù)據(jù)顯示〔10〕,miRNAs主要通過自身能夠形成miRNA誘導(dǎo)的下調(diào)復(fù)合物的機(jī)制在機(jī)體內(nèi)發(fā)生相關(guān)因子作用。因此,miRNAs在機(jī)體各處細(xì)胞內(nèi)均存在著一定的細(xì)胞生理活動(dòng),如對(duì)各種疾病的生長(zhǎng)凋亡情況起到調(diào)控作用,近些年,miRNAs引起了相關(guān)學(xué)界專家對(duì)其廣泛的關(guān)注〔11〕。本研究發(fā)現(xiàn),miR-15b密切參與了調(diào)節(jié)心臟結(jié)構(gòu)、血管生成、心肌肥大、再灌注損傷等病理生理過程,由此可分析,miR-15b在機(jī)體內(nèi)可能屬于較為關(guān)鍵性且起到調(diào)節(jié)作用的因子之一。近年研究報(bào)道中指出〔12〕,機(jī)體正常狀態(tài)下的心肌組織中存在者兩百余種miRNAs表達(dá),當(dāng)機(jī)體異常狀態(tài),心肌組織異常應(yīng)激狀態(tài)時(shí),miRNAs表達(dá)會(huì)產(chǎn)生相應(yīng)的改變,其中miR-15b被認(rèn)為與心肌組織應(yīng)激狀態(tài)的改變有直接性的關(guān)系,尤其是體現(xiàn)在心肌缺血再灌注狀態(tài)下的機(jī)體中,miR-15b的相對(duì)表達(dá)量的變化更加顯著,提示miR-15b可能存在著一定的調(diào)控及促進(jìn)作用,由此得知,miR-15b可能對(duì)心肌細(xì)胞缺血再灌注損傷進(jìn)行參與調(diào)節(jié)〔13〕。另有研究報(bào)道〔14〕,miR-15b家族在正常大鼠心肌細(xì)胞中呈現(xiàn)高表達(dá),表達(dá)強(qiáng)度極高,當(dāng)大鼠體內(nèi)出現(xiàn)缺血再灌注損傷情況時(shí),會(huì)對(duì)某些miR-15b家族的成員造成影響。本研究結(jié)果提示,miR-15b在心肌再灌注損傷的發(fā)展中起到關(guān)鍵性的作用。另有學(xué)者在文章中認(rèn)為〔15〕,機(jī)體中廣泛存在的miR-15b家族能夠參與細(xì)胞的各種生理活動(dòng)中,并起到一定的調(diào)節(jié)作用,與多種疾病及腫瘤的發(fā)生有關(guān)。經(jīng)本研究結(jié)果推測(cè),miR-15b可能在心肌細(xì)胞缺血再灌注損傷誘導(dǎo)的凋亡的過程中進(jìn)行參與和調(diào)節(jié),該過程信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制有待進(jìn)一步研究,為防止再灌注損傷及細(xì)胞凋亡率的降低,提供一定切實(shí)可行的理論基礎(chǔ)。

心肌細(xì)胞缺血再灌注的形成是一個(gè)極其復(fù)雜的過程,其發(fā)生機(jī)制包括應(yīng)激反應(yīng)及炎癥反應(yīng)發(fā)生改變等造成機(jī)體相關(guān)功能紊亂,對(duì)心膜通透性造成極大的損傷,導(dǎo)致心肌細(xì)胞缺血再灌注的發(fā)生〔16〕。經(jīng)本文研究發(fā)現(xiàn),MDA水平與細(xì)胞損傷程度之間存在一定聯(lián)系,SOD活性程度能夠?qū)C(jī)體內(nèi)內(nèi)源性抗氧化能力進(jìn)行一定程度的反映。MDA、SOD水平的降低能夠改善機(jī)體氧化應(yīng)激狀態(tài),提升機(jī)體自由基清除能力〔17〕。IL-6、TNF-α與炎性反應(yīng)及心肌細(xì)胞缺血再灌注損傷密切相關(guān)。據(jù)相關(guān)研究指出,IL-6、TNF-α是對(duì)心臟術(shù)后所產(chǎn)生的各種并發(fā)癥的嚴(yán)重程度進(jìn)行衡量的重要指標(biāo)〔18〕。本研究發(fā)現(xiàn),在心肌細(xì)胞缺血再灌注損傷后,促炎性細(xì)胞因子水平的升高增加了心肌損傷,使促炎性細(xì)胞因子釋放增多從而形成惡循環(huán)。本研究結(jié)果顯示,通過對(duì)miR-15b表達(dá)水平進(jìn)行下調(diào),能夠及時(shí)終止惡性循環(huán),以此來改善大鼠的LVEDP、LVSP水平,對(duì)心肌功能起到一定保護(hù)作用。

MAPK信號(hào)通路在機(jī)體內(nèi)屬于較為關(guān)鍵重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng),涉及細(xì)胞的生長(zhǎng)及發(fā)育,與炎癥及腫瘤、心血管疾病的發(fā)生密切相關(guān),調(diào)控MAPK信號(hào)通路可降低心肌缺血程度及梗死程度,改善心功能及炎癥反應(yīng)〔19～21〕。本研究說明,在疾病發(fā)病機(jī)制中MAPK信號(hào)通路在其中起到關(guān)鍵性作用,通過下調(diào)miR-15b表達(dá)可減少心肌細(xì)胞損傷、可達(dá)到抗炎效果,不僅對(duì)于損傷有抑制作用,還可起到改善預(yù)后的作用,很可能作為治療心肌細(xì)胞缺血再灌注損傷的治療靶點(diǎn),但關(guān)于MAPK信號(hào)通路在心肌細(xì)胞缺血再灌注損傷中表達(dá)及作用機(jī)制的研究,目前研究尚少。