氮肥后移對中、弱筋小麥籽粒淀粉合成及其糊化特性的影響

吳東明,韓雅楠,馬宏亮,祁鵬飛,魏育明,樊高瓊,劉 瓊,鄭 亭

(四川農業大學農學院,四川 成都 611130)

西南冬麥區是我國繼黃淮海和長江中下游地區以外的第三大小麥優勢產區,主要以四川為主,屬于中、弱筋型小麥優勢產區[1-3]。施氮是小麥生產中重要的栽培措施,直接影響小麥的品質[4-6]。適當增施氮肥可顯著提升小麥籽粒加工品質,而合理安排追施氮肥需結合品種筋型特征才能最大限度地發揮品種品質優勢,真正做到產、質協同。分次追施氮肥不僅能滿足小麥不同時期生長發育需求,有效地降低氮肥損失[7-8],更能精準調控籽粒內含物積累,改善其加工品質。

小麥籽粒主要由淀粉和蛋白質組成,其中淀粉和蛋白質分別占成熟籽粒干質量的60%～65%和8%～15%[9-11]。目前,大多數有關施氮時期對小麥籽粒加工品質的研究集中于蛋白質,而對淀粉的相關研究較少,并且結論并未統一。盛靖等[12]研究認為,施氮量180 kg·hm-2條件下,隨氮肥后移,皖麥直鏈淀粉、支鏈淀粉、總淀粉含量及直/支比均下降,但淀粉峰值粘度升高,從而加工品質得到改善。郭天財等[13]認為隨施氮肥時期的后移,小麥籽粒直鏈淀粉含量下降,而支鏈淀粉、總淀粉含量及淀粉糊化特性則以拔節期追氮處理最高。李春燕等[14]研究表明,增加后期氮肥追入量后,小麥灌漿期籽粒SSS、ADPGase、GBSS活性增加,總淀粉和直、支鏈淀粉積累速率增加,最終淀粉積累量提高。由此可見,合理追施氮肥對淀粉理化特性起著至關重要的作用。

基于此,試驗以大面積推廣的四川中、弱筋小麥品種為研究對象,運用現代分子生物學及生理生化技術,研究施氮時期對小麥籽粒淀粉的理化特性、淀粉合成相關酶活性以及關鍵酶基因表達的影響,解析小麥淀粉及其組分變化的調控機理,以期進一步探討四川地區中、弱筋專用小麥品質形成相關理論,并為當地優質專用型中、弱筋小麥生產提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況與試驗設計

試驗于2014年10月—2015年5月與2015年10月—2016年5月連續兩年在崇州市四川農業大學現代化農業研發基地(川西平原地區:30°58′N,103°53′E)和眉山市仁壽縣珠嘉鄉踏水村(盆中丘陵地區:30°04′N,104°13′E)進行。兩地均屬于亞熱帶濕潤氣候,兩個播種點的土壤基礎理化特性如表1所示,小麥生育期氣象條件見圖1。

圖1 崇州和仁壽2014—2015年和2015—2016年氣象數據圖Fig.1 Chongzhou and Renshou meteorological data during 2014-2015 and 2015-2016 wheat growing seasons

表1 兩個地點試驗田的土壤基礎理化性質(2014年)Table 1 Physical and chemical properties of the soil in two trial sites in 2014

采用二因素裂區試驗設計,主區為品種,供試品種為中筋小麥‘蜀麥482’(SM482)和‘蜀麥969’(SM969)、弱筋小麥‘川農16’(CN16)和‘綿麥51’(MM51)。其中‘綿麥51’由四川省綿陽市農業科學院提供,其余3個品種由四川農業大學小麥研究所提供;副區為施氮時期,施氮時期分別為底肥一次性施用(T1)、底肥+拔節期追肥(T2)、底肥+孕穗期追肥(T3)。全生育期總施氮量為純氮150 kg·hm-2,除底肥一次性施用外,其余處理按底肥∶追肥=60%∶40%(簡記為6∶4)施用;每公頃施用P2O5和K2O 各75 kg,全作底肥一次施入;供試肥料種類為尿素(N 46.2%)、過磷酸鈣(P2O512.5%)和氯化鉀(K2O 60%),購于當地農資市場。其他栽培措施與一般大田生產相同。于2014年10月28日和2015年10月26日播種。行窩距為20 cm×10 cm,播種量為1.8×106kg·hm-2,小區面積為4 m×3 m,試驗重復3次。

1.2 測定項目與方法

1.2.1 田間標記與取樣方法 在小麥開花期對同一天開花、長勢一致的穗進行掛牌標記。從花后10 d起開始取樣,每隔5 d取樣1次直至成熟。每次取18穗,在液氮中剝取籽粒,一部分鮮樣迅速放入液氮中,然后冷藏于-80℃超低溫冰箱,用于測定酶活性、提取RNA;其余籽粒樣品在105℃下殺青30 min,70℃烘至恒重后用于測定淀粉含量。

1.2.2 淀粉含量的測定 淀粉含量采用Megazyme公司的總淀粉測定試劑盒測定,按照說明書進行操作。

1.2.3 關鍵酶活性的測定 粗酶液的提取:取20 粒種子稱重,研磨成粉,邊加液氮邊磨,防止酶失活。然后加4 mL提取液(含100 mmol·L-1HEPES-NaOH (pH=7.5)、8 mmol·L-1MgCl2、2 mmol·L-1EDTA、12.5% (V/V) 甘油、1% (W/V) PVP-40、50 mmol·L-12-巰基乙醇),研磨成勻漿,10 000 r·min-1下離心30 min,然后收集上清液置于冰浴,用于酶活性的測定。

AGPase活性的測定參照程方民等[15]的方法,略有改動;SSS活性和GBSS活性測定參照梁建生等[16]的方法。

1.2.4 糊化特性(RVA參數)的測定 根據AACC76-21方法,利用澳大利亞NewPort快速粘度分析儀測定糊化特性。

1.2.5 提取總RNA 取10～15粒大小一致的籽粒放入預冷的研缽中邊加液氮邊進行研磨,將籽粒磨成粉末,然后利用植物RNA提取試劑盒(百菲特公司)提取總RNA,按照說明書進行操作。提取后進行瓊脂糖凝膠電泳,檢測RNA質量,完整的小麥籽粒RNA在18 S和28 S會有兩條清晰的條帶。最后在紫外分光光度計上測定 260 nm/280 nm 吸光值確定RNA 濃度和純度。

1.2.6 cDNA的生成 取RNA 1 μl按照PrimeScriptTM RT Reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time) 試劑盒(TaKaRa)的說明書進行操作。

1.2.7 淀粉合成關鍵酶基因引物的設計 利用Primer premier 5.0 引物設計軟件,根據美國國立生物技術信息中心(NCBI)公布的AGP-L、Wx-DI、Sbe1D基因序列設計引物,由生工生物(Sangon Biotech)公司負責合成。具體引物序列如表2。

表2 qPCR引物序列Table 2 Primer pairs used for qPCR analysis

1.2.8 熒光定量RT-PCR 將上一步所獲得的cDNA用dd H2O稀釋10倍,用于接下來的qPCR 反應中。

qPCR分析使用上海BioRad公司的熒光儀器IQ 5(96孔)和大連寶生物公司熒光試劑SYBR Premix EX TaqII,按照說明書進行操作。具體體系配置以及擴增程序如表3所示。

表3 反應體系Table 3 Reaction system

在qPCR反應中,小麥樣品的3個內參基因分別是甘油醛-3-磷酸脫氫酶(w-GAPDH, NCBI unigen Ta.66461), Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein Q (w-HnRNPQ, Ta.10105) 和Scaffold-associated regions DNA binding protein (Ta.14126)。采用ΔΔCT法利用CT值和擴增效率(E值)計算相對豐度。

1.3 數據處理

試驗數據通過Microsoft office excel匯總整理后,采用DPS 15.05進行統計分析處理。

2 結果與分析

2.1 施氮時期對淀粉及其組分含量的影響

兩試驗點結果均表明,施氮時期顯著影響總淀粉和直鏈淀粉含量及直/支比,但基因型和兩者的交互作用對其影響較小(表4)。而支鏈淀粉含量變化較小,支鏈淀粉主要取決于基因型。施氮時期分別可解釋總淀粉含量、直鏈淀粉含量和直/支比23.9%～39.0%、37.7%～45.1%、24.3%～29.0%的變異。隨著氮肥后移(T1～T3),4個品種的單粒淀粉積累量均增加,但淀粉含量在2個試驗點均表現出顯著下降規律,總淀粉、直鏈淀粉含量分別顯著下降0.20～1.75個百分點、0.10～1.85個百分點,直/支比下降了4.88%～10.42%。相比仁壽點,崇州點總淀粉含量、直鏈淀粉含量、直/支比較低。氮肥后移后,2個試驗點支鏈淀粉表現相反,崇州點略微下降,仁壽點略微上升,由此說明氮肥后移對支鏈淀粉的影響效力大小可能受環境控制。

2.2 施氮時期對淀粉糊化特性的影響

由表5、表6得出,2015年和2016年2個試驗點試驗結果基本一致,施氮時期對淀粉糊化特性的影響較小,相比崇州點,仁壽點各糊化特性指標數值較高。兩年2個試驗點施氮時期可解釋糊化特性0.01%～13.5%的變異,遠低于基因型解釋4.21%～94.98%的變異,略低于交互作用解釋的0.50%～15.76%的變異。‘CN16’和‘MM51’的峰值粘度、低谷粘度和最終粘度在T1、T3之間差異顯著(P<0.05)。整體上,4個品種在不同追氮時期下表現出相同的變化趨勢,即隨追肥時間的推遲,糊化特性指標基本均有所提升。特別是峰值粘度(P1)、低谷粘度(T1)、最終粘度(FV) 和回復值(SB),隨施氮時期后移,兩年2個試驗點分別提升3.3%～11.9%、3.8%～26.1%、3.0%～20.5% 和1.6%～15.0%。綜上可知,推遲追肥時間顯著提升淀粉的糊化特性數值。

表5 不同追氮時期下成熟期小麥籽粒淀粉糊化特性(2015年)Table 5 Starch pasting characteristics of mature wheat grain at different nitrogen topdressing stages in 2015

表6 不同追氮時期成熟期小麥籽粒淀粉糊化特性(2016年)Table 6 Starch pasting characteristics of wheat grain during maturity under different nitrogen topdressing stages in 2016

2.3 糊化特性與淀粉含量及其組成比例間的相關分析

由表7得出,總淀粉、支鏈淀粉基本與糊化特性呈較強的正相關關系,直鏈淀粉和直/支比與糊化指標大多呈負相關關系,但直鏈淀粉和直/支比與PT在兩生態點均呈較強的正相關關系。FV、SB、Pt與支鏈淀粉的相關系數較大,其中支鏈淀粉與SB的相關性在2個試驗點均達顯著水平。淀粉相關指標中,支鏈淀粉與糊化指標的相關性最大。

表7 淀粉含量與糊化參數相關性分析(2015年)Table 7 Correlation analysis of starch content and viscosity characteristics (harvest in 2015)

2.4 施氮時期對淀粉合成關鍵酶活性的影響

通過對崇州點2016年淀粉合成關鍵酶活性的測定(圖2～圖4)發現,AGPase、SSS以及GBSS活性在灌漿期總體上呈先上升后下降的單峰曲線,在花后25 d或30 d達到峰值。‘SM482’和‘MM51’追肥后移AGPase、SSS、GBSS活性在花后15 d內無顯著差異,在灌漿中后期(花后25 d后)酶活性的提高幅度更大,差異更明顯。但‘SM482’和‘MM51’的SSS、GBSS活性隨施氮后移的響應略有差異。施氮后移,蜀麥482的SSS酶活性灌漿中后期(花后25 d)基本表現為T3> T2>T1,‘MM51’的SSS活性在灌漿中前期(花后20 d)受到抑制,表現為T1>T2、T3,灌漿后期(花后35 d)為T3>T2>T1。兩品種GBSS活性在T2處理下灌漿中期(花后25 d)即顯著大于T1,在T3處理下灌漿后期(花后35 d)顯著大于T1。‘SM482’在氮肥后移后,相比‘MM51’的GBSS酶活性提高的幅度更大。

注:誤差線表示3次重復的標準誤, 其上所標不同字母表示同一天處理間差異顯著(P<0.05)。下同。Note: Error bars represent standard errors of three replicates. Different letters above error bars indicate significant differences among treatments (P<0.05). The same as blew.圖2 花后籽粒AGPase活性變化Fig.2 Changes of AGPase activity in grains after anthesis

圖3 花后籽粒SSS活性變化Fig.3 Changes of SSS activity in grains after anthesis

圖4 花后籽粒GBSS活性變化Fig.4 Changes of GBSS activity in grains after anthesis

2.5 施氮時期對淀粉合成關鍵酶基因表達量的影響

通過對崇州點‘SM482’進行RNA-seq(T1 vs T3)分析發現了AGP-L、Sbe1D和Wx-DI這3個分別負責編碼AGPase、SSS和GBSS的DEGs,隨即進行了qRT-PCR驗證(圖5)。結果表明,AGP-L和Wx-DI表達量在花后20 d 最高,AGP-L在T3處理下整個灌漿期均受到抑制。Wx-DI在T3處理下花后10～20 d表達量上升,花后15 d顯著上調了0.66倍;花后20～35 d表達量受到抑制,花后25、30、35 d分別顯著下調0.18倍、0.15倍、0.32倍。Sbe1D的表達量在花后25 d達到最大,25～35 d表達量受到抑制,花后30、35 d顯著下調了0.19倍和0.22倍。

圖5 AGP-L、BE1D、Wx-DI基因的相對表達量Fig.5 Relative expression of AGP-L、BE1D、Wx-DI gene in developing grain

3 討 論

3.1 直/支比下降是造成氮肥后移糊化特性變化的主要原因

面條加工品質和食用品質與小麥淀粉的糊化特性有很大聯系。研究發現小麥淀粉的糊化溫度、峰值粘度和崩解值越大,面條的質量越好[17-18],淀粉峰值粘度和面條硬度呈負相關關系[19],淀粉的回復值與面條的硬度呈正相關關系[20]。同時,糊化特性又與淀粉含量及其組成高度相關,高崩解值和低回復值表明直鏈淀粉含量偏低,高峰值粘度表明支鏈淀粉含量和直/支比較高[21-22]。研究發現,直鏈淀粉含量較低的品種在面條軟度、黏性、光滑性、口感和綜合評分等品質參數上有較好的表現;支鏈淀粉的含量與面條評分的各項指標和總分成正相關關系[23]。 所以淀粉組成及糊化特性是評價面粉是否適宜制作面條的重要參考標準[24-26]。

目前,氮肥后移對淀粉組成及糊化特性的影響尚無定論。郭天財等[13]、趙慶玲等[27]認為隨施氮時期的后移,中強筋小麥籽粒直鏈淀粉含量下降,總淀粉和支鏈淀粉含量均為拔節期追氮處理最高。胡宏、吳進東等[28-29]認為弱筋小麥在高氮和低氮處理下,隨氮肥后移總淀粉和支鏈淀粉含量均增加,但直鏈淀粉含量在高氮處理下呈下降趨勢。但陸增根等[30]認為增加后期的施氮比例可顯著提高直鏈淀粉的含量以及直/支比。郭天財等[13]認為在拔節期追氮時小麥籽粒的支鏈淀粉、總淀粉含量最高,淀粉糊化特性最優。但也有研究發現增加后期施氮比例使支鏈淀粉的含量呈降低趨勢[22]。閻俊、張學林等[31-32]發現,追施拔節肥有利于提高強筋、中筋、弱筋小麥的糊化特性,尤其是提高了峰值粘度、最終粘度和稀懈值,從而提高了淀粉的糊化特性、改良了面條的品質。本試驗結果表明隨追肥時期推遲,總淀粉含量、直鏈淀粉含量和直/支比下降,淀粉糊化特性提升,尤其是峰值黏度、低谷黏度、最終黏度和回復值顯著上升。由此可見,追肥時期推遲有利于改善淀粉糊化特性,與張學林和閻俊等[31-32]結論相符,淀粉組分的變化同郭天財[13]和胡宏[28]等人的部分結論相符。前人的研究認為,直鏈淀粉含量與峰值粘度、稀懈值等參數呈顯著負相關關系[33-34],這與本文的結論基本吻合。本研究中峰值黏度、低谷黏度、最終黏度和回復值與直鏈淀粉以及直/支比呈負相關,與支鏈淀粉呈顯著正相關關系。由此推測,追氮時期后移糊化特性提升是直鏈淀粉含量和直/支比下降的結果,從而有利于中、弱筋小麥蒸煮品質的提升[35]。同時,弱筋既要求淀粉含量較高,又要求蛋白含量較低,但追肥后移會顯著提高籽粒蛋白含量,所以弱筋小麥追肥不宜太遲。

張銘等[36]研究發現提高土壤肥力可以降低直/支比,由表1可知仁壽的土壤肥力低于崇州,這是崇州點各處理小麥直/支比低于仁壽的部分原因。同時張學林等[37]研究了不同生態點不同筋型對淀粉糊化特性的影響,發現日照較多有利于糊化特性的提高,而降雨過多則作用相反;漬水條件下,支鏈淀粉含量顯著下降[38]。由圖1可以看出,仁壽的降雨量低于崇州,這可能是崇州點和仁壽點2015年淀粉糊化特性高于2016年,以及仁壽點糊化特性高于崇州點的部分原因。兩年兩試驗點間淀粉糊化特性的結果不完全一致,說明環境的差異對糊化特性及淀粉組分均有較大影響,并且氮肥后移對淀粉合成的影響效力大小受如溫度、土壤肥力和水分等環境影響[39]。

3.2 灌漿中后期關鍵淀粉酶合成相關基因的表達可直接響應氮肥后移對淀粉的調控

研究認為[40-42]AGPase可以催化ADPG的生成,從而控制淀粉的合成與積累,SSS和SBE基因在支鏈淀粉的生物合成中起著不可或缺的作用,當它們發生突變,相關酶的活性和支鏈淀粉的含量會相應降低,胚乳中直鏈淀粉的含量直接由GBSSI基因的轉錄水平決定,而直鏈淀粉的生物合成受GBSSII基因控制[43-44]。灌漿期小麥籽粒淀粉的合成與AGPase、SSS、GBSS以及SEB的活性成正相關關系,影響著淀粉的積累動態[45-47]。淀粉合成通路中AGP-L、Sbe1D、Wx-DI基因分別負責編碼AGPase、SSS、GBSS,任何一個編碼淀粉酶的基因亞型的變化都可能導致淀粉特性發生變化[48-50]。譚彩霞等[50]認為這3個基因的相對表達量在灌漿期峰值與相對應的酶活性值呈現極顯著正相關關系。

目前,有關氮素對淀粉合成關鍵酶基因表達量的研究多集中在施氮量上[51],而對氮肥后移的研究較少[48],對淀粉合成關鍵酶基因表達量、淀粉合成關鍵酶及總淀粉、直鏈淀粉、支鏈淀粉的影響尚無定論。譚彩霞等[50]認為在小麥籽粒灌漿后期適當增加追施氮肥比例可以提高淀粉合成關鍵酶基因表達量,直、支鏈及總淀粉積累量均呈現上升趨勢。本文中灌漿期淀粉合成相關基因峰值表達時期與Morell、Ran等[52-53]的研究結果一致,AGP-L和Wx-DI基因在灌漿中期高效表達,Sbe1D在中后期高效表達,花后20 d達到最大表達水平。同時,氮肥后移后,籽粒灌漿中后期AGPase、SSS、GBSS的活性顯著提高,與底肥一次施用處理差異更明顯,這與譚彩霞等[50]的研究結果基本吻合。但基因表達量除了Wx-DI在中前期表達量明顯提高外,中后期淀粉合成相關基因都受到抑制,與酶活性的趨勢相反。這可能與AGPase、SSS、GBSS均由多個亞基控制有關[54]。與此同時,總淀粉、直鏈淀粉含量和直/支比下降,這與中后期淀粉合成相關基因的表達量變化趨勢一致。此外,氮肥后移后AGPase酶活性變化趨勢與總淀粉含量變化不一致,可能是氮肥后移延緩了葉片衰老,同時增強籽粒中蛋白質的合成與積累,提高千粒重,淀粉積累總量增加,但籽粒淀粉的含量相對降低[14,55]。因此,推測灌漿中后期關鍵淀粉合成相關基因的表達可直接響應氮肥后移對成熟籽粒淀粉積累量的調控,而酶活性的變化則比較滯后。

4 結 論

隨施氮后移,AGP-L、Sbe1D和Wx-DI基因表達量在小麥灌漿中后期受到抑制,總淀粉含量、直鏈淀粉含量和直/支比下降,淀粉糊化特性有顯著變化,均有利于中、弱筋小麥蒸煮品質的提升。小麥淀粉品質是地點、品種共同作用的結果,應根據不同品種、地點和最終用途采取適宜追肥方式調節小麥淀粉品質。綜合來看,四川盆地弱筋品種追肥不宜太遲,適宜底肥一次性施用或者拔節前追肥;中筋品種可考慮追施拔節肥或孕穗肥。