深綠木霉TraT2A對5種作物的促生作用研究

張國印,梁巧蘭,魏列新

(甘肅農業大學植物保護學院,甘肅省農作物病蟲害生物防治工程實驗室,甘肅 蘭州 730070)

木霉菌(Trichoderma)是一類重要的植物病害生防菌,根據GAMS和BISSETT分類系統,其屬于半知菌亞門(Deuteromycotina)、絲孢綱(Hyphomycetes)、絲孢目(Hyphomycetales)、粘孢菌(Gloiosporae)類[1-2],普遍存在并廣泛分布于植物根際土壤、腐爛植被和其他基質中[3]。木霉菌具有多種生防機制,包括競爭作用、重寄生作用、抗生作用、誘導抗病作用[4];此外,木霉菌含部分促進植物生長的基因,定殖在植物根際時,能夠改善土壤微生態環境、影響植物激素的合成與運輸、降低土壤pH值和提高養分利用率,因此木霉菌可以促進植物生長[4-7]。據報道,哈茨木霉(Trichodermaharzianum)處理過的黃瓜和砂糖橘與對照相比,根長和葉綠素b含量均顯著增加[8-9]。魯海菊等[10]研究表明,把內生木霉菌(EndophyticTrichoderma) P3.9菌株接種于枇杷主干韌皮部第30天,處理組的葉綠素質量分數比對照大0.01 mg·g-1,株高每株比對照大5 mm。王禹佳等發現[11],綠色木霉(Trichodermavirid)處理后莖粗和葉綠素含量分別提高了42.8%和60.6%,相比對照差異顯著。Rao等[12]發現T.atrovirideLZ42處理后,番茄幼苗地上部分和根的干質量明顯增加,并且其釋放的揮發性有機化合物VOCs影響番茄幼苗主根的生長方向,促進番茄幼苗主根的生長。深綠木霉(T.atroviride) T1處理后的番茄根長、鮮質量和干質量相比對照分別提高了34.91%、30.27%和15.04%[13];深綠木霉(T.atroviride) D16菌肥(15 g)與丹參苗共培養后,在盆栽和大田環境下干質量分別是同期對照組的5.61倍和1.42倍[14];106個·mL-1的深綠木霉(T.atroviride) H18-1-1孢子懸浮液處理小白菜后,可使其鮮質量增加88%[15];深綠木霉(T.atroviride) HB20111對西洋參的種子包衣處理后,其第一年的出苗率為87%,明顯高于對照組56.5%[16]。

TraT2A作為深綠木霉(T.atroviride)T2菌株發酵液的蛋白提取物[17],高濃度對百合灰霉病菌(Botrytiscinereal)和百合葉斑病菌(Alternariaalternate)具有較高的抑制作用,抑制率分別為47.44%和72.12%,低濃度對百合灰霉病菌(B.cinerea)具有較高的誘導抗病作用,誘導效果可達55.89%[18-21];而且,200倍液TraT2A處理百合鱗片后有明顯的促生效果,發芽率和每鱗片發芽數分別為100%、5.85個[22]。但是,TraT2A對其他作物的促生作用研究尚未進行。為此,本試驗以TraT2A蛋白為研究對象,測定了TraT2A蛋白處理后對小麥、玉米、豇豆、辣椒和黃瓜5種作物種子的發芽率、幼苗生長、葉綠素含量等生理指標的影響,旨在明確其對以上5種作物生長的促生作用。研究結果可為TraT2A生物菌肥的開發和利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試藥劑:深綠木霉T2菌株發酵液蛋白提取物(TraT2A)由甘肅農業大學植物保護學院農藥學實驗室發酵提取(TraT2A在595 nm處的OD值為3.26,產量為200 mL·L-1)[20];80%丙酮、石英砂、連二亞硫酸鈉(Na2S2O4)、1%TTC溶液、磷酸緩沖液、1 mol·L-1硫酸、0.4 mol·L-1琥珀酸鈉、0.6%硫代巴比妥酸、10%三氯乙酸,均為分析純。

供試作物種子:小麥(黑龍江豐鴻種業有限公司)、玉米(山東壽光創跡農業有限公司)、豇豆(河北慶灃種業有限公司)、辣椒(河北慶灃種業有限公司)和黃瓜(河北慶灃種業有限公司)。

儀器設備:電子天平AR224CN(上海奧豪斯儀器有限公司)、紫外可見分光光度計UV-9000S(上海元析儀器有限公司)、高速冷凍離心機5430R(德國Eppendorf艾本德有限公司)、LED頂置人工氣候箱QRDN-1500T-4(杭州琦勝電子科技有限公司)、電熱恒溫鼓風干燥箱HGZF-11/H-101-3(上海躍進醫療器械有限公司)。

1.2 試驗方法

1.2.1 深綠木霉TraT2A蛋白對5種作物種子萌發的影響 選取大小一致、成熟飽滿的小麥、玉米、豇豆、辣椒和黃瓜種子,于70%酒精中消毒1 min,5%NaClO溶液消毒5 min,無菌水沖洗3次后,對照組用無菌水浸泡8 h,處理組無菌水浸泡3 h后再用不同濃度TraT2A浸泡5 h。用滅菌濾紙吸取多余液體后,放置于滅菌培養皿中(培養皿底部墊有海綿,上覆1層滅菌濾紙)保濕催芽,每皿20粒。處理組分別加入100.00 mg·mL-1、20.00 mg·mL-1、10.00 mg·mL-1和2.00 mg·mL-1的TraT2A,對照組(CK)加入無菌水,每皿10 mL,每個處理重復3次。置于溫度25℃、相對濕度60%、暗/光交替(16 h/8 h)恒溫培養箱中培養,采用稱重法每日補充等量的TraT2A和無菌水,3 d后統計種子發芽數,計算發芽率、發芽指數,然后將各發芽種子裝入稱量瓶中,放置于烘箱中,在105℃下處理30 min后,將溫度調至80℃烘干,再用電子天平稱量[23],計算活力指數。

式中,Gt為t時間內的發芽數,Dt為相應的發芽天數。

活力指數=發芽指數×單株平均干質量

1.2.2 深綠木霉TraT2A蛋白對5種作物幼苗形態指標的影響 按1.2.1小節方法處理5種作物種子,每個培養皿20粒,3次重復,培養7 d后,用刻度尺測量胚根和胚軸,然后用濾紙吸干植株表面水分,立即用電子天平稱量其質量,即鮮質量,然后按1.2.1小節方法測定干質量,最后計算促生率。

1.2.3 深綠木霉TraT2A蛋白對5種作物幼苗生理指標的影響 根據發芽期到幼苗期形態指標的測定數據,選取TraT2A對5種作物促生效果最好的濃度進行生理生化測定。每種作物挑選30粒種子,設3組重復。先對作物種子進行催芽處理,方法同1.2.1小節,處理組加入10.00 mL的TraT2A蛋白,對照組加入10.00 mL無菌水。3 d后移栽到裝滅菌土的花盆中,花盆直徑28 cm,高25 cm,每盆種10株幼苗。采用稱重法每日補充等量的TraT2A和滅菌水,在14 d時進行部分生理生化指標測定(葉綠素含量、根系活力和丙二醛含量)。

幼苗葉綠素含量測定采用分光光度法[24],根系活力采用TTC法(氯化三苯基四氮唑法)測定[25-26],丙二醛含量采用硫代巴比妥酸法測定[27],最后計算促生率。

1.2.4 數據分析 利用Excel 2010進行數據處理并采用SPSS 21.0軟件進行單因素方差分析,各處理的差異顯著性檢驗采用Duncan新復極差法。

2 結果與分析

2.1 深綠木霉發酵液蛋白提取物TraT2A對5種作物種子萌發的影響

由表1可知,4種不同濃度TraT2A處理5種作物種子后,與對照相比發芽率、發芽指數和活力指數均有顯著提高(P<0.05),且對不同作物的促生效果不同。其中10 mg·mL-1TraT2A處理的5種作物的發芽率、發芽指數和活力指數均為最高,黃瓜的發芽率最高為93.66%,小麥的發芽指數最高為15.16,玉米的活力指數最大為12.55,與對照發芽率(80.00%)、發芽指數(13.58)和活力指數(7.37)相比,分別提高了16.64%、11.63%和70.31%(圖1)。100 mg·mL-1TraT2A處理后的促生率最低(表1),其中玉米的發芽率最低,為80.67%;豇豆的發芽指數最低,為10.01,辣椒的活力指數最低,為3.57,但均高于對照。其他濃度處理的作物的發芽率、發芽指數和活力指數數值均介于上述處理濃度之間(P<0.05)。10 mg·mL-1TraT2A對5種作物的活力指數促生效果最為明顯,促生率最大,其次是發芽指數,對種子發芽率的促生率最低(圖1)。除發芽率之外,黃瓜種子的發芽指數和活力指數促生率均最高,且和其他作物的促生率之間存在顯著差異;玉米的發芽率、小麥的發芽指數和小麥的活力指數促生率最低,其他作物的上述3個指標促生率介于二者之間(P<0.05)。

表1 深綠木霉TraT2A對5種作物種子萌發的影響Table 1 Effects of TraT2A from T. atroviride on seed germination of five plants

2.2 深綠木霉發酵液蛋白提取物TraT2A對5種作物幼苗生長的影響

由表2可知,4種不同濃度TraT2A處理5種作物幼苗后,其胚根、胚軸、鮮質量和干質量均顯著高于對照(P<0.05),且對不同作物的促生效果不同。其中10 mg·mL-1TraT2A促生作用最為顯著,5種作物的胚根、胚軸、鮮質量和干質量均最大,尤其對玉米的胚根、胚軸、鮮質量和干質量促生效果最好,分別為10.24、2.78、4.25 cm和0.98 cm,相比對照分別提高了35.63%、26.17%、22.81%和53.14%;而100 mg·mL-1TraT2A促生效果最差,其中小麥的鮮質量和辣椒的干質量最低,分別為1.84 g和0.31 g,但均高于對照(表2),其他濃度處理的作物鮮質量和干質量值均介于二者之間(P<0.05)。由圖2可見,10 mg·mL-1TraT2A對5種作物的干質量促生效果最為明顯,其次是胚根、胚軸,對鮮質量促生率最低。除黃瓜和小麥干質量促生效果無差異外,10 mg·mL-1TraT2A對黃瓜的胚根、鮮質量和干質量促生效果最好,并與其他作物差異顯著(P<0.05),對豇豆干質量以及小麥、玉米和豇豆的胚根促生效果最差。10 mg·mL-1TraT2A對辣椒胚軸促生效果最好,與其他作物胚軸之間差異顯著(P<0.05);對玉米胚軸的促生效果最差。小麥與玉米和黃瓜的鮮質量促生效果無顯著差異,促生率均較高;對豇豆鮮質量的促生效果最差,其促生率顯著低于其他作物(P<0.05)。

圖2 10 mg·mL-1 TraT2A對5種作物胚根、胚軸、鮮質量和干質量的促生效果Fig.2 Effects of 10 mg·mL-1 TraT2A on radicle, hypocotyl, fresh mass and dry mass of five crops

表2 深綠木霉TraT2A對5種作物幼苗生長的影響Table 2 Effects of TraT2A from T. atroviride on seedling growth of five plants

2.3 深綠木霉發酵液蛋白提取物TraT2A對5種作物幼苗生理生化特性的影響

由表3可知,10 mg·mL-1的TraT2A處理5種作物幼苗后,與對照相比明顯提高了5種作物葉綠素含量和根系活力,同時降低了丙二醛含量(P<0.05)。10 mg·mL-1TraT2A處理5種作物后,小麥葉綠素含量和辣椒根系活力最小,分別為0.0636 mg·g-1和120.67 μg·g-1·h-1,均高于對照(0.0509 mg·g-1和98.00 μg·g-1·h-1);豇豆丙二醛含量最大為0.0310 nmol·g-1,低于對照(0.0410 nmol·g-1)。10 mg·mL-1TraT2A處理5種作物后,對丙二醛含量影響最大,其次是葉綠素含量,對根系活力影響最小。由圖3可見,10 mg·mL-1TraT2A對小麥的葉綠素含量和丙二醛含量影響最大,且和其他作物之間存在顯著差異(P<0.05);對黃瓜丙二醛含量和玉米葉綠素含量影響最小;對辣椒根系活力提高最大,對黃瓜根系活力提高最小(圖3),且二者根系活力與其他作物間差異顯著(P<0.05)。

圖3 10 mg·mL-1 TraT2A對5種作物葉綠素含量、根系活力和丙二醛含量的影響Fig.3 Effects of 10 mg·mL-1 TraT2A on chlorophyll content, root activity and MAD content of five crops

表3 深綠木霉TraT2A對5種作物幼苗生理特性的影響Table 3 Effect of TraT2A from T. atroviride on physiological characteristics of five crops

3 討 論

發芽率、發芽指數和活力指數是檢驗種子質量的重要指標,它們的值越大,種子的活力、發芽的速率以及生長量就更好。張樹武等[28-29]研究表明,不同稀釋倍數的深綠木霉發酵液均可促進黑麥草和白三葉草種子發芽,其中100倍發酵液處理黑麥草和白三葉草種子后,發芽率、發芽指數和活力指數分別是94.42%和96.55%,13.42和37.41,9.52和7.83,與CK相比顯著提高。本研究中,4種不同濃度的TraT2A處理5種作物種子后,與對照相比發芽率、發芽指數和活力指數均有顯著提高(P<0.05)。尤其是10 mg·mL-1TraT2A處理的5種作物的發芽率、發芽指數和活力指數均為最高,分別是93.66%、15.16和12.55,與對照發芽率、發芽指數和活力指數(80.00%、13.58和7.37)相比,分別提高了16.64%、11.63%和70.31%(表1),與上述研究結果一致。

根系是直接吸收土壤中水分、無機鹽的重要器官,發達的根部能夠更好地起到固定和支持作用,根系形態的變化能直接影響植物生長狀況[13]。鮮質量和干質量是恒量植物生長的重要指標,其值越大代表植物生長越健壯。葉綠素是高等植物進行光合作用的一類綠色色素,植物正常生長需要高效的光合作用提供能量,葉綠素含量是光合作用強弱的重要指標[30]。梁松等[13]研究表明,深綠木霉T1處理番茄幼苗后,其根長、鮮質量、干質量和SPAD值相比對照分別提高了34.91%、30.27%、15.04%和20.75%。張樹武等[28-29]研究表明,100倍稀釋液處理的黑麥草和白三葉草幼苗根系長度、鮮質量和干質量的相對增長率分別為16.95%和37.09%,40.57%和57.73%,73.68%和54.35%,葉綠素的相對增長率分別為84.09%和14.02%。本研究中,4種不同濃度的TraT2A處理5種作物幼苗后,胚根、胚軸、鮮質量和干質量均顯著高于對照(P<0.05),尤其10 mg·mL-1TraT2A促生作用最為顯著,促生率最大值分別為35.63%、26.17%、22.81%、53.14%,且10 mg·mL-1的TraT2A處理5種作物幼苗后,與對照相比明顯提高了5種作物葉綠素含量和根系活力(P<0.05),最大增長量分別是24.95%和23.14%,與前人研究結果基本一致。

丙二醛的積累會對細胞質膜等造成傷害,所以試驗中通常利用丙二醛的含量作為膜脂過氧化指標,木霉處理后可通過減少MDA積累以防止膜脂的過氧化作用[31]。羅軍等[30]發現,與核盤菌處理相比深綠木霉處理的碧玉萵筍MDA最大降幅為29.48%。梁巧蘭等[18]用TraT2A 100×液處理蘭州百合植株3 d后挑戰接種灰霉菌(B.cinerea),將灰霉菌和蘭州百合植株分別共同培養1、3、5 d時,百合葉片中的丙二醛含量分別是對照的0.68、0.40、0.51倍。劉暢等[31]研究表明,施加綠色木霉后,黃瓜幼苗中MDA含量有所降低,說明綠色木霉對黃瓜幼苗的生長起到了促進作用。本研究中,10 mg·mL-1TraT2A處理5種作物后,與對照相比明顯降低了5種作物丙二醛含量 (P<0.05),最大降幅為36.69%,試驗結果與前人研究一致。

伍曉麗等[32]研究發現,深綠木霉發酵液原液處理的青蒿種子和幼苗與對照相比,發芽率、發芽勢和發芽指數分別下降了31.06%、54.09%和35.62%,株高減少15.27%,根粗增加了8.99%,地上部干質量增加了11.76%,可見深綠木霉發酵液原液浸泡種子后,不僅會抑制種子發芽,還會使青蒿苗變粗變矮。本文初步明確了試驗條件下4種不同濃度的TraT2A對5種作物發芽、幼苗生長以及生理特性的影響,其促生作用機理和田間試驗效果還有待進一步研究。

4 結 論

通過研究深綠木霉T2發酵液中的蛋白提取物TraT2A對小麥、玉米、豇豆、辣椒和黃瓜種子、幼苗生長指標和生理特性的影響,探究了TraT2A對5種作物的促生作用。研究表明,4種不同濃度TraT2A對小麥、玉米、豇豆、辣椒和黃瓜的種子和幼苗具有顯著的促生作用,10 mg·mL-1處理促生效果最好,對辣椒發芽率、黃瓜發芽指數和黃瓜活力指數的影響最顯著,其促生率分別是17.65%、46.46%、91.86%;同時,10 mg·mL-1TraT2A對黃瓜胚根、辣椒胚軸、小麥鮮質量和黃瓜干質量的促生效果最好,促生率分別是46.28%、70.17%、23.26%、104.69%。此外,TraT2A處理5種作物幼苗后,與對照相比葉綠素含量和根系活力明顯提高(P<0.05),其中小麥葉綠素含量的促生率最大,為24.95%;辣椒根系活力的促生率最大,為23.14%。TraT2A處理使5種作物幼苗的丙二醛含量明顯降低(P<0.05),小麥降幅最大,為36.69%。因此,4種不同濃度的TraT2A處理5種作物后,10 mg·mL-1TraT2A對黃瓜的促生效果最好,其次為辣椒和小麥。